王琦 馮靜紅 孫占斌 姜維治 李世東 孫漫紅 馬桂珍

（1. 淮海工學(xué)院，連云港 222005；2. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，北京 100193）

在某些特定條件下，一些真菌的原生質(zhì)體濃縮、細(xì)胞壁加厚，形成一種特殊的抗性結(jié)構(gòu)——厚垣孢子。目前，有關(guān)厚垣孢子的形成機(jī)制尚不明確。有研究證明，通過改變環(huán)境條件，如溫度和通氣量等，能夠誘導(dǎo)真菌厚垣孢子的產(chǎn)生［1-2］。當(dāng)環(huán)境不利于真菌生長(zhǎng)時(shí)，營(yíng)養(yǎng)菌絲轉(zhuǎn)化成厚垣孢子使菌體存活，待條件適宜時(shí)，厚垣孢子萌發(fā)，真菌繼續(xù)生長(zhǎng)。因此，這種結(jié)構(gòu)能抵御外界不良環(huán)境，對(duì)真菌的生長(zhǎng)和存活具有十分重要的意義［3-4］。

環(huán)境中氧氣水平改變時(shí)會(huì)引起細(xì)胞內(nèi)活性氧（Reactive oxygen，ROS）的變化?；钚匝跏巧矬w內(nèi)一類具有強(qiáng)氧化、還原能力的氧自由基和含氧衍生物，主要包括過氧化氫（H2O2）、超氧陰離子自由基（O2-·）和羥基自由基（OH·）。低濃度下，活性氧作為信號(hào)分子在促進(jìn)真核細(xì)胞生長(zhǎng)、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡以及細(xì)胞抗氧化脅迫中發(fā)揮著積極作用［5-6］。但是當(dāng)活性氧濃度超出機(jī)體抗氧化防御能力時(shí)，就會(huì)產(chǎn)生氧化脅迫（oxidative stress），損傷細(xì)胞活性，破壞細(xì)胞的生長(zhǎng)與代謝［7-8］。氧化脅迫的大小與活性氧類型密切相關(guān)，Watts等［9］發(fā)現(xiàn)H2O2對(duì)E. coli細(xì)胞毒性最強(qiáng)，OH· 毒性最弱。不同作用時(shí)間作用效果也不相同，燕國(guó)梁等［10］發(fā)現(xiàn)接種前添加H2O2能刺激芽孢桿菌生長(zhǎng)，而對(duì)數(shù)期添加則抑制細(xì)菌生長(zhǎng)。微生物在適應(yīng)氧化脅迫的過程中，會(huì)表現(xiàn)出不同的生理應(yīng)答反應(yīng)，如促使細(xì)胞分化、合成抗氧化物酶等［11-13］。Alonso-Monge等［14］發(fā)現(xiàn)，嚴(yán)重缺氧條件下白色念珠菌（Candida albicans）可以產(chǎn)生厚垣孢子。但迄今，有關(guān)氧化脅迫對(duì)絲狀真菌厚垣孢子形成的影響還未見報(bào)道。

粉紅螺旋聚孢霉（Clonostachys rosea，異名：粉紅黏帚霉，Gliocladium roseum）是一類重要的生防真菌，可以防治多種植物真菌病害［15-17］。前期研究發(fā)現(xiàn)，一定條件下粉紅螺旋聚孢霉可以產(chǎn)生厚垣孢子。與分生孢子相比，厚垣孢子抗逆性增強(qiáng)，并且在土壤中萌發(fā)率顯著提高［18］，對(duì)提高粉紅螺旋聚孢霉生防制劑貨架期和防效穩(wěn)定性具有重要意義。本實(shí)驗(yàn)以粉紅螺旋聚孢霉高效菌株67-1為材料，通過改變液體培養(yǎng)通氣條件以及添加不同種類的活性氧，研究氧化脅迫對(duì)67-1菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)厚垣孢子的影響，旨在探討活性氧水平與厚垣孢子形成之間的關(guān)系，為生防真菌厚垣孢子制劑研發(fā)和今后厚垣孢子形成機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 粉紅螺旋聚孢霉67-1，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所土傳病害生防實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 液體培養(yǎng)基 葡萄糖25 g，酵母粉7.2 g，K2HPO41 g，MgSO40.5 g，F(xiàn)eSO40.05 g，ZnSO4·7 H2O 0.05 g，蒸餾水1 L。裝液量為100/500 mL。

1.2 方法

1.2.1 液體培養(yǎng) 將67-1菌株在PDA 平板上28℃培養(yǎng)7 d，加入5 mL 無菌水，洗脫孢子，制備濃度為107/mL 的孢子懸液。吸取2 mL 孢子懸液接種于種子培養(yǎng)基中，28℃、180 r/min 振蕩培養(yǎng)48 h，按2%接種量接種進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。28℃、180 r/min 恒溫振蕩培養(yǎng)72 h。

1.2.2 裝液量對(duì)67-1 菌絲生長(zhǎng)及產(chǎn)厚垣孢子的影響 三角瓶中液體培養(yǎng)基裝量分別設(shè)定為20%、70%、80%、90%和100%，28℃、180 r/min 培養(yǎng)。48 h 觀察不同裝液量中67-1菌絲生長(zhǎng)狀態(tài)，72 h血球計(jì)數(shù)板測(cè)定厚垣孢子和分生孢子的數(shù)量。每個(gè)裝液量3個(gè)重復(fù)。

1.2.3 H2O2對(duì)67-1菌絲生長(zhǎng)及產(chǎn)厚垣孢子的影響 分別在菌株接種前和培養(yǎng)16 h后向液體培養(yǎng)基中添加H2O2，接種前添加濃度分別為5、6、7、8和9 mmol/L，培養(yǎng)16 h 添加濃度分別為62、64、66和68 mmol/L，28℃下180 r/min 培養(yǎng)，觀察菌絲生長(zhǎng)狀況，測(cè)定產(chǎn)孢數(shù)量。每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。

1.2.4 甲萘醌對(duì)67-1菌絲生長(zhǎng)及產(chǎn)厚垣孢子的影響 稱取一定量的甲萘醌溶于1 mL 丙酮溶液，然后加到100 mL 的液體培養(yǎng)基中。分別在接種前和培養(yǎng)16 h 后添加甲萘醌，接種前添加濃度分別為210、220、230、240和250 μmol/L，培養(yǎng)過程中添加濃度分別為 200、350 和 500 μmol/L。28℃、180 r/min 培養(yǎng)，測(cè)定67-1生長(zhǎng)和產(chǎn)孢情況。培養(yǎng)基中添加1 mL丙酮溶液作為對(duì)照，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。

1.2.5 OH· 對(duì)67-1菌絲生長(zhǎng)及產(chǎn)厚垣孢子的影響 液體培養(yǎng)基中加入0.278 g/L FeSO4· 7 H2O，以及不同濃度的H2O2，建立Fe2+-H2O2體系，通過Fenton 和Harber-weiss 反應(yīng)生成羥基自由基。H2O2添加時(shí)間和添加量分別選取接種前5個(gè)濃度，1、2、3、4和5 mmol/L，培養(yǎng)16 h 后添加濃度為43、49、55和58 mmol/L。以只添加FeSO4· 7 H2O為對(duì)照，28℃、180 r/min 培養(yǎng)72 h。每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)分析 利用SPSS 13.0 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果

2.1 通氣量對(duì)67-1菌絲生長(zhǎng)及產(chǎn)厚垣孢子的影響

減少通氣量能夠抑制67-1菌絲生長(zhǎng)和厚垣孢子形成。當(dāng)搖瓶中發(fā)酵液裝量≤80% 時(shí)，菌絲生長(zhǎng)正常。當(dāng)裝液量達(dá)到90% 時(shí)，菌絲成束，極少產(chǎn)生分枝，厚垣孢子數(shù)量顯著降低，但占總孢子數(shù)的比例提高。當(dāng)瓶中沒有多余空間時(shí)，菌絲生長(zhǎng)受到嚴(yán)重抑制，僅形成極短的菌絲段，無孢子產(chǎn)生（圖1，表 1，圖 2）。

圖1 不同裝液量對(duì)67-1菌絲生長(zhǎng)的影響

表1 不同裝液量對(duì)67-1生長(zhǎng)的影響

圖2 不同裝液量對(duì)67-1產(chǎn)厚垣孢子的影響

2.2 H2O2對(duì)67-1菌絲生長(zhǎng)及產(chǎn)厚垣孢子的影響

培養(yǎng)過程中添加H2O2對(duì)67-1生長(zhǎng)和產(chǎn)孢均有顯著影響。隨著添加濃度的增加，67-1生物量迅速下降。接種前添加5-6 mmol/L H2O2，其厚垣孢子數(shù)量較對(duì)照（3 × 106/mL）顯著增加（P＜ 0.05）。當(dāng)濃度達(dá)到7 mmol/L 時(shí)，厚垣孢子數(shù)量顯著下降，但其比例增加（P＜ 0.05）。濃度達(dá)到 9 mmol/L 時(shí)，67-1生長(zhǎng)和產(chǎn)孢完全受到抑制。真菌孢子萌發(fā)后（16 h）對(duì)H2O2的耐受力增強(qiáng)，濃度超過60 mmol/L 時(shí)，開始出現(xiàn)明顯的抑制，但在60-64 mmol/L 范圍內(nèi)厚垣孢子比例顯著上升（P＜ 0.05，表2，圖3，圖6）。

表2 不同濃度H2O2 對(duì)67-1生長(zhǎng)的影響

2.3 甲萘醌對(duì)67-1菌絲生長(zhǎng)及產(chǎn)厚垣孢子的影響

當(dāng)甲萘醌濃度大于210 μmol/L 時(shí)，67-1菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢受到明顯抑制，但在一定范圍內(nèi)厚垣孢子的比例隨甲萘醌濃度的增加而增大。67-1培養(yǎng)過程中（16 h）菌絲對(duì)超氧陰離子自由基的耐受濃度較接種體（孢子）增加1倍，此時(shí)加入350 μmol/L 的甲萘醌，對(duì)厚垣孢子生成表現(xiàn)出明顯的促進(jìn)作用，并且厚垣孢子比例最高（P＜ 0.05，表3，圖4，圖6）。

圖3 發(fā)酵液中添加H2O2對(duì)67-1產(chǎn)厚垣孢子的影響

表3 不同濃度甲萘醌對(duì)67-1生長(zhǎng)的影響

2.4 羥基自由基對(duì)67-1菌絲生長(zhǎng)及產(chǎn)厚垣孢子的影響

一定濃度的OH·能顯著提高67-1產(chǎn)厚垣孢子能力。在Fe2+-H2O2體系中，接種前添加1-5 mmol/L H2O2，67-1菌絲生長(zhǎng)旺盛，厚垣孢子顯著增加，濃度為3 mmol/L 時(shí)產(chǎn)孢水平提高6倍以上。培養(yǎng)16 h后添加43-55 mmol/L H2O2厚垣孢子產(chǎn)量和比例顯著提高（P＜ 0.05，表 4，圖 5，圖 6）。

圖4 不同時(shí)期添加不同濃度甲萘醌對(duì)67-1產(chǎn)厚垣孢子的影響

表4 Fe2+-H2O2體系中添加不同濃度的H2O2對(duì)67-1生長(zhǎng)的影響

3 討論

圖5 不同時(shí)期添加不同濃度羥基自由基對(duì)67-1產(chǎn)厚垣孢子的影響

圖6 不同種類活性氧對(duì)67-1厚垣孢子形成與形態(tài)的影響

通過改變裝液量調(diào)節(jié)液體培養(yǎng)基中氧氣含量，研究低氧脅迫下粉紅螺旋聚孢霉67-1生長(zhǎng)和產(chǎn)厚垣孢子的變化。裝液量越大，氧含量越低，低氧脅迫越高。結(jié)果表明，菌絲和孢子都可以耐受一定程度的低氧脅迫，菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢能力變化不大，但是當(dāng)?shù)脱趺{迫超過某一閾值時(shí)，菌絲生長(zhǎng)狀態(tài)改變，厚垣孢子產(chǎn)量顯著降低。趙文婧［19］研究發(fā)現(xiàn)，處于低氧脅迫環(huán)境下湯姆青霉（Penicillium thomii）菌絲分化形成大量的菌核，在67-1培養(yǎng)過程中發(fā)現(xiàn)，氧氣缺乏會(huì)造成菌絲分枝明顯減少，形成大量的菌絲束。這可能是由于不同微生物應(yīng)對(duì)低氧脅迫表現(xiàn)的生理性應(yīng)答不同。在低氧狀態(tài)下，菌體細(xì)胞代謝途徑可能發(fā)生改變，能量供應(yīng)不足，有毒物質(zhì)大量積累［20］，使菌株正常生長(zhǎng)發(fā)育受到干擾。

添加一定濃度的H2O2、甲萘醌和羥基自由基，可以促進(jìn)粉紅螺旋聚孢霉厚垣孢子的形成，但是會(huì)一定程度抑制菌絲的生長(zhǎng)，推測(cè)在不同類型活性氧的刺激下真菌菌絲大量轉(zhuǎn)化成厚垣孢子來度過不良環(huán)境。厚垣孢子是真菌的一種休眠體結(jié)構(gòu)，通常在逆境條件下產(chǎn)生，具有較強(qiáng)的適應(yīng)和抗逆能力。粉紅螺旋聚孢霉受到氧化脅迫刺激后，通過產(chǎn)生厚垣孢子，維持自身的存活。

厚垣孢子的抗逆性可能與其細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)密切有關(guān)。厚垣孢子細(xì)胞壁由內(nèi)外兩層壁組成，燕瑋婷［21］認(rèn)為，水稻稻曲病菌的休眠特性與細(xì)胞壁中多糖含量較高有關(guān)。閆越［22］發(fā)現(xiàn)，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)黃孢原毛平革菌（Phanerochaete chrysosporium）厚垣孢子的內(nèi)層細(xì)胞壁不斷增厚，其中含有較高濃度的多糖和蛋白，因而具有較強(qiáng)的抗壓能力。我們推測(cè)67-1厚垣孢子的抗逆性也與其細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)相關(guān)，但尚需進(jìn)一步證明。目前，關(guān)于粉紅螺旋聚孢霉厚垣孢子形成機(jī)制還不明確，利用優(yōu)化的條件為下一步深入研究厚垣孢子形成機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

氧化脅迫能夠影響粉紅螺旋聚孢霉菌絲生長(zhǎng)狀態(tài)和產(chǎn)厚垣孢子能力。氧環(huán)境下，菌絲分枝減少，厚垣孢子數(shù)量降低。發(fā)酵過程中添加一定濃度的活性氧可以促進(jìn)粉紅螺旋聚孢霉厚垣孢子的形成。

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