陳建軍 劉梁濤 曹香林

（1. 河南師范大學生命科學學院，新鄉(xiāng) 453007；2. 河南師范大學水產(chǎn)學院，新鄉(xiāng) 453007）

我國年產(chǎn)秸稈總量位居世界第一，但由于缺少有效的技術(shù)手段，導致這一生物資源的嚴重浪費，同時也污染環(huán)境［1-2］。秸稈的主要成分是纖維，主要集中于細胞壁，細胞壁含量占70%以上，由纖維素、半纖維素和木質(zhì)素組成；其中纖維素、半纖維素可在牛羊的瘤胃中被纖維分解菌酸解，生成揮發(fā)性脂肪酸，如乙酸、丙酸、丁酸等，被牛羊吸收作為能源利用［3-5］。已有研究表明這類物質(zhì)的有機物消化率很低，一般牛羊很少超過50%［6］。因此要提高秸稈的吸收利用率，對木質(zhì)素的降解已是重中之重。

在眾多秸稈處理的方法中，微生物降解有著獨特的優(yōu)勢。木質(zhì)素的完全降解是真菌、細菌、微生物群落共同作用的結(jié)果，其中真菌起著重要的作用。在降解秸稈木質(zhì)素方面主要包括三類酶，漆酶（Laccase）、木質(zhì)素過氧化物酶（Lignin peroxidase）、錳過氧化物酶（Manganese peroxidase），目前研究最多的是真菌漆酶［7］。漆酶是一種多銅氧化酶，可以氧化分解木質(zhì)素中的酚類物質(zhì)，近年來，對漆酶的研究也越來越多，并已經(jīng)取得了顯著的結(jié)果，在環(huán)境保護、造紙、食品等行業(yè)中也變現(xiàn)出極大的研究價值和應用潛力［8-9］。盡管漆酶的研究已經(jīng)取得一定的進展，但自然界中漆酶的產(chǎn)量較少，目前國內(nèi)對產(chǎn)漆酶的菌種培養(yǎng)研究還處于起步階段［10］，因此利用分子生物學方法研究漆酶基因并制備表達漆酶的工程菌，對實現(xiàn)漆酶的大規(guī)模生產(chǎn)和漆酶在各行業(yè)應用具有重要的意義［11］。

漆酶在造紙、環(huán)保、能源及食品等領域極富利用價值［12］，目前漆酶的發(fā)酵主要來自于真菌，但工業(yè)化生產(chǎn)卻較難實現(xiàn)，究其原因，主要是因為易污染、酶活不穩(wěn)定且活力相對較低所致［13-15］。此外，大部分真菌漆酶只有在中溫且弱酸條件下才能表現(xiàn)出較高的催化活性，限制了真菌漆酶在某些工業(yè)領域的應用［16-17］。因此，通過克隆性質(zhì)優(yōu)良的新型漆酶基因，構(gòu)建高效異源表達載體及蛋白質(zhì)改造等，是解決漆酶資源短缺、增強酶在較高溫度下的穩(wěn)定性及在堿性條件下的高催化活性的重要途徑［18-19］。

人們對漆酶基因的克隆研究也有近百年的歷史，雖然很多學者克隆出不少漆酶基因，也都在酵母和大腸桿菌等表達體系中進行表達，但表達分泌均較弱，到現(xiàn)在為止并沒有可以應用于大規(guī)模生產(chǎn)的工程菌［20］。究其原因，可能在于未獲得酶活較高菌株作為克隆模板，表達穩(wěn)定性差等［21-22］。課題組前期研究了黃孢原毛平革菌Phanerochaete chrysosporium產(chǎn)漆酶的生化性質(zhì)和生產(chǎn)性能。該菌株與報道過的其他菌株相比，酶活力高，降解性能較好，同時產(chǎn)酶的條件也好控制，為研究漆酶基因的克隆表達和漆酶的純化奠定了基礎，對構(gòu)建好的工程菌產(chǎn)生的漆酶進行了分離純化和酶學性質(zhì)研究，為后續(xù)運用蛋白質(zhì)工程的方法改造酶的催化活力和穩(wěn)定性奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 黃孢原毛平革菌Phanerochaete chrysosporium由河南師范大學生命科學學院從菌肥中分離獲得，大腸桿菌Escherichia coliBL21（DE3）由本實驗保存，pET24a載體，來自上海生工公司。1.1.2 工具酶與其他試劑 限制性內(nèi)切酶NdeⅠ、XhoⅠ、T4 DNA連接酶、Taq DNA聚合酶購自TaKaRa公司；小提質(zhì)粒試劑盒及膠回收試劑盒購自TaKaRa；卡那霉素購于Ameresco公司；IPTG購自Merck公司；丙烯酰胺（Acr）及甲叉雙丙烯酰胺（Bis）購自Promega公司；引物合成和克隆質(zhì)粒測序由上海英駿生物工程公司完成；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 白腐真菌漆酶基因的克隆及序列分析 根據(jù)根據(jù)NCBI中公布的白腐真菌的漆酶的基因序列（GenBank：AY225437.1），應用 NCBI-Blast進行保守結(jié)構(gòu)域分析，表明該基因有3個保守的結(jié)構(gòu)域：即Cu-oxidase_3、Sufl和CuRO_2_MCO_like_1。其中Sufl是多銅氧化酶三蛋白結(jié)構(gòu)域，與細胞周期調(diào)控、細胞分裂、染色體分離、無機離子轉(zhuǎn)運與代謝有關(guān)；第二個是Cu-oxidase_3的結(jié)構(gòu)域，這項包含許多不同的銅氧化酶樣結(jié)構(gòu)域；第3個是CuRO_2_MCO_like_1的結(jié)構(gòu)域，包含未知的多銅氧化酶二蛋白結(jié)構(gòu)域；根據(jù)該基因的基因組序列和PET24a表達載體的MCS位點，設計特異性PCR primers為：

其中F1中含有NdeⅠ酶切位點；R1中含有XhoⅠ酶切位點。提取黃孢原毛平革菌總DNA為模板，PCR擴增條件為94℃，5 min預變性；94℃，1 min，58℃ ；30 s，72℃，2 min；29個循環(huán) ；72℃延伸10 min。所得片段膠回收后與克隆載體pET24a載體連接，轉(zhuǎn)化E. coliBL21（DE3），挑取陽性轉(zhuǎn)化子，提取質(zhì)粒酶切鑒定后測序，測序由上海生工公司完成。

1.2.2 大腸桿菌表達載體的構(gòu)建及漆酶基因的誘導表達 將克隆好的漆酶基因用NdeI和XhoI進行雙酶切，膠回收漆酶基因片段，將其與經(jīng)相同酶切線性化的pET24a（+）載體連接，并將其轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coliBL21（DE3），篩選出陽性轉(zhuǎn)化子。酶切驗證正確后，挑選陽性轉(zhuǎn)化子接種于含50 μg/ml Kan的4 ml LB培養(yǎng)液的試管中，37℃ 220 r/min搖過夜并凍存；次日按1∶100接種于50 μg/ml Kan的30 mL LB培養(yǎng)液中，37℃ 220 r/min振搖至菌體OD600為0.4（約2 h）；取出1 mL培養(yǎng)物，12 000 r/min室溫離心2 min，棄上清，用100 μL 1×上樣緩沖液重懸菌體沉淀；向剩余的培養(yǎng)物中加入IPTG至終濃度為0.5 mmol/L，25℃ 220 r/min振搖5 h，誘導CPE融合蛋白表達；取出1 mL培養(yǎng)物，12 000 ×g室溫離心2 min，棄上清，用100 μL 1×上樣緩沖液重懸菌體沉淀，剩余培養(yǎng)物4℃ 4 000×g離心12 min，棄上清，沉淀置-20℃凍存。

1.2.3 SDS-PAGE確定表達產(chǎn)物的分布 分別取10 μL經(jīng)誘導的重組菌的上清及沉淀物，利用10%SDS-PAGE進行電泳分離，電壓130 V，考馬斯亮藍R250染色顯帶，Gel Doc2000成像系統(tǒng)分析。

1.2.4 漆酶融合蛋白的純化 將過夜誘導表達的菌液于12 000 r/min，4℃離心15 min，收集菌體，采用超聲波細胞破碎法，用pH7.4 PBS緩沖液懸浮菌體，經(jīng)0.45 μm濾膜過濾后上柱，經(jīng)Ni-IDA-Sepharose CL-6B親和層析柱純化得到純化后的漆酶蛋白，收集流出液，進行12% SDS-PAGE分析。

1.2.5 表達產(chǎn)物的Western blotting 鑒定 收集不同誘導表達時間的表達產(chǎn)物100 μL，加入100 μL 2×Sample Buffer重懸，開水煮沸5 min。各取10 μL上樣進行10% SDS-PAGE電泳。然后以半干法電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，取下硝酸纖維素膜利用TBST緩沖液短暫漂洗后經(jīng)5%光明脫脂奶粉室溫封閉l h，再用TBST漂洗3次后，與His-Tag單抗孵育過夜，次日TBST漂洗3次后，與IRDye800標記的羊抗鼠IgG孵育l h，最后TBST 3次洗膜經(jīng)Odyssey紅外激光成像系統(tǒng)掃描實驗結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 漆酶基因的克隆及分析

提取黃孢原毛平革菌基因組DNA，用Lac-F1和Lac-R1引物進行擴增，連接pET24a載體后，測序得到長度為1 680 bp的基因內(nèi)部片段，將其命名為lac1680（圖1）。測得擴增獲得的基因lac1680核苷酸序列與GenBank公布的漆酶基因的全基因組核苷酸序列（GenBank：AY225437.1）同源性達98%。

2.2 質(zhì)粒圖譜的構(gòu)建

根據(jù)載體序列和lac基因的序列最終構(gòu)建成完整的全質(zhì)粒圖譜，lac基因通過NdeI和XhoI兩個酶切位點插入到PET24a-lac里面全質(zhì)粒圖譜如圖2所示。

2.3 重組表達質(zhì)粒雙酶切

提取質(zhì)粒后，用NdeI和XhoI進行雙酶切。如圖3所示，在2號泳道出現(xiàn)1 600 bp左右和5 000 bp左右的片段，其中較小條帶與目的條帶相似，較大條帶為質(zhì)粒載體，說明表達載體連接成功。

2.4 重組菌預表達的全菌裂解物SDS-PAGE檢測

將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌進行誘導表達，結(jié)果如圖4 所示，經(jīng)IPTG誘導的泳道出現(xiàn)了一條大小約75 kD的蛋白條帶，而未誘導的沒有條帶，進而說明誘導表達成功。

2.5 SDS-PAGE檢測純化的lac-c-His6蛋白

通過SDS-PAGE檢測純化后的蛋白，結(jié)果如圖5所示，4號泳道明顯呈現(xiàn)出一條與目的蛋白大小一致的單一蛋白條帶，幾乎看不到任何雜帶，說明純化效果良好。

2.6 Western blotting驗證lac-c-His6蛋白

利用Western blotting技術(shù)，進一步驗證漆酶蛋白的可靠性。結(jié)果如圖6所示，4號未經(jīng)誘導的菌株在目的位置沒有條帶；相反，無論洗脫純化后還是濃縮后的溶液中均出現(xiàn)了目的條帶，從而證明該條帶即為誘導純化后的漆酶蛋白。

2.7 野生型菌株與工程菌產(chǎn)漆酶能力研究

圖1 漆酶基因核苷酸序列以及推導的氨基序列

圖2 pET24a質(zhì)粒圖譜

圖3 pET24a-lac重組表達質(zhì)粒雙酶切驗證的瓊脂糖凝膠電泳

為了解重組菌的產(chǎn)酶活力，以野生型黃孢原毛平革菌為對照，比較了不同時間兩株菌的產(chǎn)酶活力。結(jié)果顯示，二者酶活力都是隨著培養(yǎng)時間的增加而增加，其中野生菌株菌株在第6天達到最大值（圖7-A），構(gòu)建好的工程菌株活力在第48 小時即可達到最大值（圖7-B），產(chǎn)酶時間大大縮短。此外，收集了菌株產(chǎn)酶能力最高時的細胞懸液，經(jīng)細胞破碎后，通過SDS-PAGE分析表明，構(gòu)建好的工程菌在蛋白水平上比原野生型菌株有了明顯的提高，而且其酶活力比野生菌株提高了近39%。

3 討論

圖4 pET24a-lac-BL21（DE3）重組菌預表達的全菌裂解物SDS-PAGE檢測

圖5 SDS-PAGE檢測純化的lac-c-His6蛋白

圖6 WB驗證lac-c-His6蛋白（用His的抗體）

決定生物學功能的潛在因素是基因的分子特征，本研究前期對黃孢原毛平革菌漆酶基因進行了載體的構(gòu)建，成功克隆了黃孢原毛平革菌漆酶基因的cds區(qū)。序列分析表明，lac1680基因編碼的漆酶蛋白具有3個保守的結(jié)構(gòu)域，通過與其它已報道的漆酶的保守結(jié)構(gòu)相比較，經(jīng)PCR擴增、SDS-PAGE及Western blotting雙重驗證，證實了我們所篩選得到的陽性轉(zhuǎn)化子表達的重組蛋白能夠被分泌，同時明確證實了基因lac1680能夠編碼分泌漆酶蛋白。

圖7 黃孢原毛平革菌（A）和工程菌（B）產(chǎn)漆酶能力折線圖

與目前國際上所采用的漆酶基因的克隆方法而言，傳統(tǒng)基因克隆一般采用探針雜交來獲得其全長的cDNA序列，也有運用RACE技術(shù)進行克隆基因的例子，但其最終目的都是為了提高漆酶基因的表達量，或者是提高漆酶活性。近年來對菌株產(chǎn)酶條件、降解條件的優(yōu)化、漆酶載體的研究仍是研究熱點，例如鄧寒梅等［23］通過對固定化漆酶載體的研究來提高酶活性，張雪玲等［24］對漆酶Lac1338的酶學特性測定分析酶解染料影響。大腸桿菌重組菌具有生長快速、分泌能力強、易工業(yè)化生產(chǎn)等優(yōu)點，雖然也有構(gòu)建失敗的事例［25］，但迄今為止還是被人們認為是最具市場前景的前沿技術(shù)［26-27］。如楊建強等將野生革耳來源的漆酶基因在大腸桿菌中表達，得到可溶性漆酶蛋白，在可溶性漆酶蛋白中添加CuSO4并在室溫下孵育復性，獲得有活性的漆酶。

通過對比工程菌與野生型菌株所產(chǎn)生的粗酶液，酶的比活力相差不大，只是酶活力有所提高，這可能與該漆酶基因來自與同一物種有關(guān)，同時檢測重組蛋白所處的環(huán)境對酶活性也有一定的影響，后續(xù)將對構(gòu)建好的工程菌酶學性質(zhì)進行研究。未來在加強分子生物學和基因工程方面的研究，實現(xiàn)高效的異源表達，更加詳細的了解其功能，將其應用于實踐生產(chǎn)［28］。

4 結(jié)論

本研究以先前篩選到的高產(chǎn)漆酶的黃孢原毛平革菌為模板，利用同源克隆技術(shù)合成一個全長為1 680 bp的漆酶基因，將該基因連接到構(gòu)建好的pET-24a載體上，并轉(zhuǎn)入大腸桿菌中，通過誘導表達，獲得漆酶蛋白。經(jīng)過SDS-PAGE及Western Blotting雙重驗證，充分證明了我們得到的就是誘導純化后的漆酶，初步建立起漆酶基因的異源表達及重組蛋白純化體系。通過對比基因工程菌和野生型菌株在不同培養(yǎng)時間段內(nèi)的酶活力，結(jié)果表明，構(gòu)建好的工程菌活力比原菌酶活力提高了39%。

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