馬博 張婷婷 吳寶祥

（百色學(xué)院農(nóng)業(yè)與食品工程學(xué)院，百色 533000）

色素能夠賦予食品不同顏色、影響消費(fèi)者選擇、激發(fā)消費(fèi)者食欲，是食品的加工生產(chǎn)和銷售過程中一個(gè)重要因素［1］。近年來，隨著消費(fèi)者逐漸認(rèn)識(shí)到合成色素存在潛在的致癌、致畸等副作用，而天然色素具有的抑菌、消炎、抗癌、抗氧化及免疫調(diào)節(jié)等生物活性，使天然色素備受青睞［2-4］。據(jù)估計(jì)，國(guó)際食品色素市場(chǎng)值每年以10%-15%的速度增加，到2019年將達(dá)23.1億美元，而天然色素在2017年將達(dá)13.2億美元，超過合成色素市場(chǎng)份額［1，4］?？梢姡_發(fā)利用天然色素是當(dāng)前食品色素市場(chǎng)發(fā)展的必然趨勢(shì)。天然色素主要來源于動(dòng)物、植物及微生物，動(dòng)植物源天然色素依賴于原材料供給，品質(zhì)不易控制，而微生物源色素色譜范圍廣、生產(chǎn)不受季節(jié)氣候限制、原料廉價(jià)，且可以通過控制發(fā)酵參數(shù)來保證色素品質(zhì)［2，5-6］。絲狀真菌能夠合成包括類胡蘿卜素、醌類、聚酮類及其衍生物等多種不同化學(xué)結(jié)構(gòu)的色素，如紅曲色素、Arpink redTM、β-類胡蘿卜素及核黃素等［7-9］。當(dāng)前，微生物發(fā)酵生產(chǎn)天然色素尚不成熟，其大規(guī)模生產(chǎn)仍是目前工業(yè)上面臨的最大挑戰(zhàn)，選育安全、高產(chǎn)及能夠利用廉價(jià)生產(chǎn)原料新型產(chǎn)色素菌種是今后研究的重點(diǎn)之一［4］。本研究從形態(tài)特征和多位點(diǎn)核酸序列兩個(gè)方面對(duì)來自廣西大王嶺自然保護(hù)區(qū)原始森林腐殖質(zhì)中的一株產(chǎn)可溶性色素真菌DWL-C010進(jìn)行鑒定，考察了其色素在不同溫度下的熱降解情況，并測(cè)定了該菌纖維素半纖維酶和淀粉糖化酶的酶活，以期為該菌的后續(xù)開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源 由作者從百色大王嶺原始深林土壤中分離得到，編號(hào)為DWL-C010，保存于百色學(xué)院農(nóng)業(yè)與食品工程學(xué)院-80℃超低溫冰箱中。

1.1.2 培養(yǎng)基 查氏培養(yǎng)基（Czapek’s agar，CZ）、查氏酵母提取物培養(yǎng)基（CYA）、查氏酵母鹽培養(yǎng)基（YAS）、酵母提取物蔗糖培養(yǎng)基（YES）、PDA和PDB液體培養(yǎng)基；產(chǎn)酶培養(yǎng)基（g/L）：麥麩（過80 目 ）40，Avicel 10，KH2PO44，（NH4）SO44，MgSO4·7H2O 0.6，CaCl20.6，Tween-80 2，pH 6.5。

1.2 方法

1.2.1 形態(tài)觀察 分別在PDA、CYA、YES及CZ等4種培養(yǎng)基上3點(diǎn)接種，每點(diǎn)約2×106個(gè)孢子，于25℃恒溫培養(yǎng)7 d，測(cè)量菌落直徑并觀察菌落形態(tài)宏觀特征；采用插片培養(yǎng)，觀察顯微結(jié)構(gòu)和孢子特征。

1.2.2 分子鑒定

1.2.2.1 基因組DNA提取、PCR擴(kuò)增與測(cè)序 采用EP管液氮研磨法微量提取基因組DNA；濃度稀釋至50-100 ng/μL后，分別擴(kuò)增ITS序列、β-微管蛋白基因（BenA）、鈣調(diào)蛋白基因（CaM）、RNA聚合酶Ⅱ第二大亞基基因（RPB2）及RNA聚合酶Ⅱ大亞基基因（RPB1），引物如表1所示［10］。擴(kuò)增體系為25 μL，其中DNA模板、上游引物及下游引物各1.0 μL，PrimeSTAR Max DNA 聚合酶 12.5 μL，ddH2O 9.5 μL。PCR擴(kuò)增條件為94℃預(yù)變性3 min；94℃變性30 s，退火30 s，72℃延伸30 s，30個(gè)循環(huán)后，72℃再延伸10 min；ITS、BenA及CaM退火溫度分別為60℃、55℃和50℃。RPB2和RPB1基因擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性3 min；94℃變性30 s，48℃退火30 s，72℃延伸1 min，反應(yīng)5輪；后50℃退火，反應(yīng)5輪；再52℃退火，反應(yīng)25輪；最后72℃延伸10 min；擴(kuò)增結(jié)束后，取2.0 μL產(chǎn)物在0.8%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳檢測(cè)，后將PCR產(chǎn)物送華大基因有限公司進(jìn)行測(cè)序［11］。

表1 PCR擴(kuò)增和測(cè)序引物

1.2.2.2 測(cè)序數(shù)據(jù)分析 原始序列用DNAStar中的Seqman拼接，人工校對(duì)后遞交到GenBank獲取序列號(hào)。利用MEGA7.0.14對(duì)編輯好的相關(guān)序列進(jìn)行比對(duì)分析，分別用鄰接法（neighbor-joiningmethod，NJ）中的Kimura2-參數(shù)模型分別構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，空缺完全刪除，并進(jìn)行1 000次自舉分析（Bootstrap）置信度。

1.2.3 菌株DWL-C010色素?zé)岱€(wěn)定性分析

1.2.3.1 色素樣品制備 PDB液體培養(yǎng)基100 mL，接種量約1.0×108個(gè)孢子，160 r/min，28℃培養(yǎng)7 d后，培養(yǎng)基過濾除菌體，濾液10 000 r/min、4℃離心10 min。取上清液，按照1∶4（V/V）加入無(wú)水乙醇，4℃過夜醇沉，離心棄底部沉淀。醇沉后上清液置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中進(jìn)行減壓濃縮，濃縮液即為色素樣品。

1.2.3.2 DWL-C010紅色素最大吸收波長(zhǎng)確定 色素原液用適當(dāng)稀釋后，在400-600 nm范圍內(nèi)掃描，記錄數(shù)據(jù)，繪制波普曲線，確定最大吸收波長(zhǎng)。

1.2.3.3 色素穩(wěn)定性分析 將色素濃縮液用檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液適當(dāng)稀釋后，分別置于40、50、60、70和80℃水浴鍋中，連續(xù)熱處理6 h，每隔1 h測(cè)定OD，記作A，第0 h測(cè)得的OD記作A0。

1.2.3.4 DWL-C010色素?zé)峤鈩?dòng)力學(xué)參數(shù)求解 研究表明，聚酮類色素?zé)峤到庾裱患?jí)動(dòng)力學(xué)反應(yīng)規(guī)律［12-13］。DWL-C010色素?zé)峤馑俾食?shù)（Dc）可以通過方程（1）表示，通過邊界條件（即t=0時(shí)，A=A0；t=t時(shí)，A=A）可將方程（1）轉(zhuǎn)化為方程（2）：其Dc可通過做色素保留率對(duì)數(shù)與熱作用時(shí)間之間的函數(shù)求得。

其中，A為最大波長(zhǎng)下的吸光度，t為時(shí)間（h），Dc為熱降解速率常數(shù)（h-1）。

半衰期t1/2利用方程（3）計(jì)算，指數(shù)遞減時(shí)間（D）利用方程（4）計(jì)算，即：

色素降解溫度依賴性可以通過Arrhenius方程（5）表示，方程（5）可以線性化成方程（6）。根據(jù)不同溫度的Dc，以ln（Dc）對(duì)1/T作線性回歸，求出活化能Ea。

其中，D0為前指因子，Ea為活化能，R為氣體常數(shù)（8.314 J·mol-1·k-1），T為絕對(duì)溫度。1.2.4 菌株DWL-C010酶活測(cè)定

1.2.4.1 粗酶液制備 100 mL產(chǎn)酶培養(yǎng)基接種量同1.2.3.1，28℃、180 r/min培養(yǎng)至第3天開始取樣，至第8天結(jié)束，發(fā)酵液10 000 r/min、4℃離心10 min，取上清液作為粗酶液。

1.2.4.2 酶活測(cè)定 采用DNS比色法［14-15］。纖維素內(nèi)切酶和木聚糖酶活力定義為1 mL粗酶液在50℃，pH 5.0條件下，每分鐘催化底物產(chǎn)生1 μmoL還原糖量為1個(gè)活力單位（U/mL）；糖化酶活力定義為1 mL粗酶液在40℃，pH 4.6條件下，每分鐘催化可溶性淀粉產(chǎn)生1 μmoL葡萄糖為1個(gè)活力單位（U/mL）。

2 結(jié)果

2.1 菌株DWL-C010形態(tài)學(xué)特征

不同培養(yǎng)基上菌株DWL-C010的菌落大小和形態(tài)不同（圖1）。25℃培養(yǎng)7 d，PDA平板上菌落直徑32-34 mm；黃色邊緣，整齊，絨毛狀；中心餅狀凸起、絨狀；分泌橘紅色液體，呈同心圓狀；反面呈鮮紅色，具有可溶性紅色素。

YES培養(yǎng)基上菌落直徑23-24 mm；黃色邊緣，輻射狀凸起，中央呈火山口狀，菌絲絨毛狀，白色間有橘紅色；反面菌落暗紅色，輻射狀開裂；少量紅色素分泌至培養(yǎng)基中。

CYA培養(yǎng)基上菌落直徑22-24 mm；黃色邊緣1-3 mm，整齊；表面輻射狀褶皺；中心呈火山口狀，菌絲絨毛狀，黃色；反面菌落紅色；部分紅色素分泌到培養(yǎng)基中。

CZ培養(yǎng)基上菌落直徑9-13 mm；黃色邊緣1-2 mm，整齊；中心饅頭狀凸起，毯狀；有液體滲出；反面鮮紅色；大量紅色素分泌至培養(yǎng)基中。37℃培養(yǎng)時(shí)，CYA上不生長(zhǎng)。分生孢子梗有隔，壁平滑；帚狀枝二輪生；?；?-8個(gè)；瓶梗針狀，每個(gè)?；?-8個(gè)；分生孢子球狀或近球狀，2.3-3.6×1.8-2.5 μm?；谏鲜鲂螒B(tài)特征，結(jié)合Yilmaz等報(bào)道［16］，初步將菌株DWL-C010歸屬為藍(lán)狀菌。

圖1 菌株DWL-C010形態(tài)特征

2.2 菌株DWL-C010系統(tǒng)發(fā)育分析

ITS、RBP2、RBP1、BenA和CaM基 因 經(jīng) 過PCR擴(kuò)增、測(cè)序，得到序列長(zhǎng)度分別為521、852、826、327 和556 bp；在NCBI中的核酸數(shù)據(jù)庫(kù)中Blast發(fā)現(xiàn)，菌株DWL-C010的CaM基因序列與白二輪籃狀菌CBS133440的對(duì)應(yīng)核酸序列一致性為96%，而ITS序列、RBP2、RBP1和BenA基因序列一致性均高達(dá)99%。利用MEGA7.0中的ClustalW，將ITS、RBP2、RBP1、BenA和CaM序列分別與相關(guān)典型菌株對(duì)應(yīng)序列進(jìn)行多重比對(duì)，修剪后依次得到用于系統(tǒng)發(fā)育分析的序列長(zhǎng)度為407、651、493、327和388 bp。與白二輪藍(lán)狀菌典型菌株133440相比，比對(duì)堿基序列中ITS共發(fā)生4個(gè)點(diǎn)突變，轉(zhuǎn)換和顛換各占一半，均發(fā)生在轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)；RBP2共發(fā)生9個(gè)點(diǎn)突變，其中2個(gè)轉(zhuǎn)換，7個(gè)顛換，均為同義突變；RBP1共發(fā)生6個(gè)點(diǎn)突變，其中轉(zhuǎn)化5個(gè)，顛換1個(gè)，也均為同義突變；BenA共發(fā)生4個(gè)點(diǎn)突變，其中2個(gè)顛換位點(diǎn)和1個(gè)插入位點(diǎn)位于內(nèi)含子區(qū)，1個(gè)轉(zhuǎn)換位于外顯子區(qū)；CaM共發(fā)生20個(gè)點(diǎn)突變，13個(gè)轉(zhuǎn)化、5個(gè)顛倒及1個(gè)缺失突變位點(diǎn)在內(nèi)含子中，2個(gè)轉(zhuǎn)化和1個(gè)顛倒突變位點(diǎn)在外顯子中。5個(gè)基因位點(diǎn)的系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果（圖2）表明，菌株DWL-C010均與白二輪籃狀菌CBS133440聚在一起，并且置信度均達(dá)到了100%，故將菌株DWL-C010鑒定為白二輪籃狀菌（T. albobiverticillius）。

2.3 菌株DWL-C010色素?zé)峤鈩?dòng)力學(xué)分析

2.3.1 菌株DWL-C010紅色素最大吸收峰的確定 稀釋后的紅色素溶液在400 nm到600 nm掃描，其波普如圖3-A所示。菌株DWL-C010紅色素吸光度先降低，在450 nm處開始升高，在495 nm處又開始降低，約在600 nm處開始趨于穩(wěn)定?？梢姡?95 nm是菌株DWL-C010紅色素的特征吸收峰。

2.3.2 菌株DWL-C010紅色素降解動(dòng)力學(xué)分析 分別在40、50、60、70和80℃5個(gè)溫度梯度下，每隔1 h測(cè)定其色素OD495，其色素保留率如圖3-B所示。從圖3-B可知，在40和50℃時(shí)，其紅色素降解緩慢；60℃開始，其色素保留率開始顯著降低，尤其在80℃時(shí)，其色素保留率急劇下降。通過做ln（A/A0）與時(shí)間的函數(shù)，進(jìn)行線性擬合，發(fā)現(xiàn)各溫度的回歸曲線線性良好，相關(guān)系數(shù)R2均大于0.95，符合一級(jí)動(dòng)力模型（圖3-C）。通過線性方程，可知各溫度下紅色素的熱降解速率常數(shù)Dc在每小時(shí)0.009 8-0.081 2之間（表2）；通過方程（3）和（4），可知其半衰期t1/2和指數(shù)遞減時(shí)間D分別在70.73 h-8.54 h和234.96 h-28.36 h。通過作ln（Dc）與時(shí)間倒數(shù)的函數(shù)，進(jìn)行曲線擬合，發(fā)現(xiàn)其線性良好（圖3-D），R2為0.970，求得菌株DWL-C010紅色素的活化能Ea為51.82 kJ·mol-1，前指因子自然對(duì)數(shù)為15.21。

2.4 白二輪藍(lán)狀菌DWL-C010產(chǎn)酶特性

白二輪藍(lán)狀菌DWL-C010具有一定的產(chǎn)糖化酶（Glucoamylase）、纖維素內(nèi)切酶（CMCase）和半纖維素酶的能力。其中，木聚糖酶（Xylanase）活最高，CMCase酶活次之，糖化酶酶活最低（圖4）。木聚糖酶酶活前5 d提升明顯，第6天達(dá)到最大酶33.098 U/mL；CMCase酶活除第3天外，其酶活均顯著高于糖化酶酶活（P＜0.05），但二者也在第6天酶活達(dá)到最大，分別為1.880 U/mL和0.976 U/mL；第6天以后，3種酶酶活均略有下降，這可能培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)成分耗盡和菌體自身裂解有關(guān)。

圖2 菌株DWL-C010的ITS序列（A）、RBP2（B）、RBP1（C）、BenA（D）和CaM（E）基因系統(tǒng)發(fā)育樹

3 討論

圖3 菌株DWL-C010紅色素?zé)峤鈩?dòng)力學(xué)分析

表2 白二輪藍(lán)狀菌DWL-C010紅色素?zé)峤到鈩?dòng)力學(xué)參數(shù)

絲狀真菌色素是重要的天然色素來源之一。目前，報(bào)道的產(chǎn)色素絲狀真菌主要有青霉、擬青霉、曲霉、德氏霉、鐮刀菌、脈孢菌和藍(lán)狀菌等［8，17］。藍(lán)狀菌最初由Benjamin用于描述青霉菌屬的有性階段，后Yilmaz等［16］將藍(lán)狀菌和青霉雙輪亞屬合并單列一新屬。藍(lán)狀菌中，T. amestolkiae，T. ruber和T. stolii因產(chǎn)素色不能分泌到胞外而不利于下游分離純化，T. purpurogenus因產(chǎn)真菌毒素而不能用于工業(yè)生產(chǎn)，馬尼菲藍(lán)狀菌（T. marneffei）雖不產(chǎn)真菌毒素，但是機(jī)會(huì)致病菌，也不能用于生產(chǎn)食品添加劑［5，9，11］。然而，深玫色藍(lán)狀菌（T.atroroseus）和白二輪藍(lán)狀菌不僅能夠?qū)⑺a(chǎn)色素有效分泌胞外，且未見有產(chǎn)真菌毒素的報(bào)道，是潛在的紅色素工業(yè)化生產(chǎn)菌種［18］。Venkatachalam等［19］對(duì)來自海洋的一株白二輪藍(lán)狀菌色素成分進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)的12種化合物中4種為紅曲類色素，并首次報(bào)道了1種新化合物。本實(shí)驗(yàn)通過5個(gè)基因位點(diǎn)序列分析，結(jié)合形態(tài)學(xué)特征，將菌株DWL-C010鑒定為白二輪藍(lán)狀菌。

圖4 白二輪藍(lán)狀菌DWL-C010不同發(fā)酵時(shí)間的酶活

穩(wěn)定性是色素性能的重要評(píng)價(jià)指標(biāo)之一。在食品加工過程中，熱處理是常用保鮮手段之一。為了考察菌株DWL-C010紅色素的熱穩(wěn)定性，利用一級(jí)動(dòng)力學(xué)模型分析了其色素在40-80℃的降解情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在40℃時(shí)，其半衰期和指數(shù)遞減時(shí)間可分別長(zhǎng)達(dá)近3 d和10 d；在50℃時(shí)，其半衰期和指數(shù)遞減時(shí)間可分別長(zhǎng)達(dá)2 d和7 d之多；在高溫80℃時(shí)，其半衰期和指數(shù)遞減時(shí)間還可分別長(zhǎng)達(dá)8.54 h和28.36 h。同時(shí)，其紅色素活化能為51.82 kJ·mol-1，高于產(chǎn)紫青霉（P. purpurogenum）的42.4 kJ·mol-1［13］、 紅 曲 霉（Monascus ruber） 的 11.49 kcal·mol-1［12］和紫紅曲霉（M. purpureus）的 40.81 kJ·mol-1［20］?？梢?，菌株 DWL-C010 紅色素具有較好的熱穩(wěn)定性。

此外，微生物煉制色素以工農(nóng)業(yè)廢棄物、植物源淀粉及木質(zhì)纖維素等為底物，既能夠降低生產(chǎn)成本，又能處理廢棄物，防止環(huán)境污染。藍(lán)狀菌作為一類重要的工業(yè)用子囊菌，除了應(yīng)用于食品工業(yè)和生物防治外，還能夠分泌多種生物質(zhì)降解酶。如嗜松藍(lán)狀菌、T. funiculosus和T. cellulolyticus能夠纖維素酶，且嗜松藍(lán)狀菌還能產(chǎn)內(nèi)切葡糖苷酶和淀粉酶，T. leycettanus能產(chǎn)熱穩(wěn)定的木聚糖酶，T. lanuginosus能產(chǎn)糖化酶［16，21-23］。本實(shí)驗(yàn)以Avice為碳源，添加麥麩，對(duì)菌株DWL-C010進(jìn)行液體搖瓶培養(yǎng)，測(cè)得在第6天其糖化酶、纖維素內(nèi)切酶和半纖維素酶酶活最大，分別為0.976、1.880和33.098 U/mL，表明其具有一定的利用廉價(jià)生產(chǎn)原料潛力。

4 結(jié)論

從廣西大王嶺原始森林腐殖質(zhì)土壤中分離得到的一株產(chǎn)可溶性紅色素真菌DWL-C010，通過多基因位點(diǎn)序列分析，結(jié)合其形態(tài)學(xué)特征，將其鑒定為白二輪藍(lán)狀菌。其可溶性紅色素的特征吸收峰位于495 nm處，具有較好的熱穩(wěn)定性。在40-80℃時(shí)，其紅色素降解復(fù)合一級(jí)動(dòng)力學(xué)模型，其Ea為51.82 kJ·mol-1。另外，菌DWL-C010具有一定的產(chǎn)糖化酶、纖維素內(nèi)切酶和半纖維素酶能力。可見，菌株DWL-C010具有潛在的工業(yè)化生產(chǎn)價(jià)值，其紅色素在食品工業(yè)具有一定的應(yīng)用前景。

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