耿龍潑 王鑫旺 黃路華 鄧基利 汪世華 張峰

（福建農林大學生命科學學院 福建省病原真菌與真菌毒素重點實驗室，福州 350002）

黃曲霉是一種常見的腐生真菌，它在緯度為16°-35°的溫帶地區(qū)極易從土壤中分離得到［1］。黃曲霉能以菌核的形式存在于土壤中并且抵御極端環(huán)境，而后產生分生孢子在炎熱干旱的環(huán)境條件下爆發(fā)［2］。黃曲霉作為人、動物和植物的共同病原菌，可引起人和動物的曲霉病。有報道稱北美地區(qū)65%的兒童曲霉病是由黃曲霉引起的［3］。此外，黃曲霉還會侵染花生、玉米、棉籽、堅果、茶葉等作物［4］。全世界約有25%的谷物因污染真菌而不可食用，其中以黃曲霉的污染較為嚴重［5］。

黃曲霉除了自身能引起曲霉病和污染糧食作物的危害外，其另一個主要的危害是在生長發(fā)育的過程中產生的次級代謝產物黃曲霉毒素（Aflatoxin，AFT）。黃曲霉毒素是聚酮化合物衍生的二呋喃香豆素，其合成由靠近3號染色體端粒處的一個含29個基因的基因簇調控［6］。黃曲霉毒素在酸性和中性條件下較為穩(wěn)定，難溶于水，而易溶于有機溶劑，且具有熒光特性［7］。常見的黃曲霉毒素有AFB1、AFB2、AFG1、AFG2、AFM1、AFM2等， 其 中 AFB1可以耐高溫，并且AFB1也是毒性和致癌性較強的物質［8-9］。研究表明，當黃曲霉的分生孢子和菌核的發(fā)育受到影響時，菌株幾乎失去毒素合成的能力［10］。此外，當黃曲霉的分生孢子產量增多時，菌株的毒素合成量也有所提高［11］。這暗示黃曲霉的生長發(fā)育能夠影響其毒素的產生。

核糖體蛋白作為核糖體的主要組成成分，除了在細胞內蛋白質生物合成中發(fā)揮著重要作用外，還具有其他的生物學功能。有研究表明抗黃曲霉品種的花生種子在發(fā)育時核糖體蛋白L41的表達比敏感品種中多，說明核糖體蛋白與植物的抗逆境能力息息相關［12］。也有研究表明核糖體蛋白L13可以結合去乙?；窼irT1，促進其泛素化，從而抑制細胞周期和細胞凋亡［13］。在蛋白質組水平對黃曲霉可變剪接的檢測結果發(fā)現，核糖體蛋白L32存在著不同的剪接方式，這暗示了黃曲霉核糖體蛋白的不同表達方式可能在細胞中擔負著不同的生物學功能［14］。利用穩(wěn)定的同位素標記法對產毒和非產毒狀態(tài)的黃曲霉總蛋白進行標記，分析發(fā)現核糖體蛋白L27的表達量存在差異，說明黃曲霉特定核糖體蛋白的表達量與其產毒存在著重要聯系［15］。

基于此，我們通過熒光定量RT-PCR對黃曲霉各個發(fā)育時期的74個核糖體蛋白mRNA進行定量，以期找出與黃曲霉生長發(fā)育緊密聯系的核糖體蛋白，為今后揭示核糖體蛋白調控黃曲霉生長發(fā)育的機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究所用的黃曲霉菌株為Aspergillus flavusNRLL3357（由中山大學賀竹梅教授惠贈）。將少量黃曲霉孢子接種于PDA（Difco）培養(yǎng)基上，于37℃黑暗恒溫培養(yǎng)5 d后收集孢子，制備成孢子懸液。取106個孢子均勻涂布于鋪有玻璃紙的Wickerham［16］培養(yǎng)基上，分別于37℃黑暗恒溫培養(yǎng)1 d、3 d、7 d后收集樣品，命名為菌絲期、孢子期、菌核期，每組3個平行，樣品收集后用液氮迅速冷凍，于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

黃曲霉核糖體蛋白mRNA序列從NCBI（National Center for Biotechnology Information）網站獲得，熒光定量PCR引物設計使用軟件Primer 5.0，引物合成由北京六合華大基因科技股份有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 總RNA的提取 稱取0.15 g菌體，加入1 mL冰上預冷的Trizol（Invitrogene），再加入0.2 mL直徑1.5 mm的磁珠，在組織破碎儀上65 Hz震蕩破碎90 s，5 000 r/min低溫離心2 min。取上清，加入200 μL氯仿，劇烈震蕩1 min，冰上放置10 min，12 000 r/min低溫離心15 min。取500 μL上清液至新的EP（RNase free）管中，加入500 μL異丙醇，顛倒混勻，冰上放置10 min，12 000 r/min低溫離心15 min。棄上清，加入1 mL 75%的乙醇（DEPC水配制）洗滌沉淀，10 000 r/min低溫離心5 min。棄上清，靜置晾干沉淀，加入30 μL DEPC水溶解沉淀，使用瓊脂糖凝膠和Nanodrop 2000分光光度計檢測總RNA的質量和純度，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 逆轉錄合成cDNA 取2 μg的RNA加入2 μL oligo（dT）18（10 mmol/L）引物并用DEPC水補齊至15 μL，70℃變性5 min，迅速轉移至冰上，冷卻2 min。向上述溶液中加入 0.5 μL RTase（Promega）、0.2 μL RNase Inhibitor（TaKaRa）、1.5 μL dNTP、5 μL RT buffer 和 2.8 μL DEPC 水，混勻，42℃反轉錄反應2 h，即得到cDNA。

1.2.3 熒光定量RT-PCR 將上述反轉錄得到的cDNA稀釋10倍用于熒光定量RT-PCR反應，體系為 ：3 μL cDNA，1 μL 引物 F（5 μmol/L），1 μL 引物R（5 μmol/L），5 μL 2×SYBR Green Mix（ABI），總體積10 μL。熒光定量RT-PCR擴增條件如下：預變性，95℃ 7 min；PCR 反應，95℃ 15 s，56℃ 15 s，72℃ 45 s，循環(huán)40次。在72℃采集和記錄熒光。然后保持95℃ 15 s，60℃ 1 min，每10 s 加0.5℃直到95℃擴增結束。反應在ABI StepSnePlus 實時熒光定量PCR儀上進行。選擇β-tubulin作為內參基因，每組樣品3個平行，目標基因的相對表達量采用2-ΔΔCt法計算［17］。使用GraphPad Prism 5進行統(tǒng)計和顯著性分析，Tukey多重比較用于顯著性分析，如果P＜0.05，則認為顯著。

1.2.4 黃曲霉核糖體蛋白基因功能預測 Gene Ontology功能分析數據在DAVID網站獲得（https://david.ncifcrf.gov/），GO功能富集分析使用OmicShare工具（www.omicshare.com/tools）。

2 結果

2.1 黃曲霉不同生長時期的菌落形態(tài)

黃曲霉孢子在Wickerham培養(yǎng)基上37℃黑暗條件下培養(yǎng)1 d后，孢子在培養(yǎng)基上萌發(fā)生長出白色的菌絲，為黃曲霉的菌絲期（圖1）。當培養(yǎng)到第3天時，菌落呈現出綠色，顯微鏡觀察發(fā)現此時的菌絲會長出分生孢子頭，為黃曲霉的孢子期（圖2）。當培養(yǎng)到第7天時，培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分大部分被利用完，部分菌絲會凋亡，此時的菌落呈現出灰綠色。當用75%的酒精噴洗掉菌落表面的孢子和菌絲，可以明顯看到形成的具有抗逆性的黑灰色菌核，為黃曲霉的菌核期（圖3）。

2.2 熒光定量RT-PCR分析結果

對提取的各時期的總RNA檢測顯示完整性好且質量符合要求后，反轉錄獲得cDNA，用于熒光定量RT-PCR檢測。熒光定量RT-PCR檢測結果表明，在所有檢測的核糖體蛋白基因中，沒有一個基因的表達量在3個時期是恒定的。如果以菌絲期作為參照，在孢子期共有54個核糖體蛋白基因的表達量上調，而在菌核期有57個核糖體蛋白基因的表達量上調，其中在孢子期、菌核時期表達量均上調的基因有42個（圖4-A）。但是，與菌絲期相比，只有2個核糖體蛋白的基因表達量在孢子期下調，而在菌核期表達量下調的核糖體蛋白基因有12個，在孢子期、菌核時期表達量均下調的基因有2個（圖4-B）。由此可見，黃曲霉核糖體蛋白的表達量與菌株的生長發(fā)育密切相關，且在孢子期參與生命活動的核糖體蛋白數目最多，菌核期次之，菌絲期最少。

圖1 黃曲霉菌絲時期的菌落形態(tài)

圖2 黃曲霉孢子時期的菌落形態(tài)

圖3 黃曲霉菌核時期的菌落形態(tài)

通過進一步分析發(fā)現，多數核糖體蛋白基因從菌絲期發(fā)展到孢子期和菌核期后發(fā)生了明顯上調，且大致可以分為以下兩類：（1）在孢子期和菌核期有42個基因的表達量均上調，且存在顯著差異（P＜0.05）。它們可以分為3種情況：第一種情況是相比菌絲期表達量上調，但在孢子期、菌核期之間表達量無顯著差異的基因有9個，其中核糖體大亞基蛋白基因有2個，核糖體小亞基蛋白基因有7個（圖5-A）。第二種情況是在孢子期的表達量比菌核期多的基因有9個，其中核糖體大亞基蛋白基因有4個，核糖體小亞基蛋白基因有5個（圖5-B）。第3種情況是在菌核期的表達量比孢子期多的基因共有24個，其中核糖體大亞基蛋白基因有15個（圖5-C），核糖體小亞基蛋白基因有9個（圖5-D）。值得一提的是，大亞基L9、L25p、L27、L31的表達量是菌絲期的數十倍。（2）共有27個核糖體蛋白基因的表達量只在孢子期或菌核期單一時期上調，且存在顯著差異（P＜0.05）。有12個基因的表達量只在孢子期出現上調（圖6-A），有15個基因的表達量只在菌核期出現上調（圖6-B）。有趣的是，這15個只在菌核期表達上調的基因在菌絲期、孢子期的表達量都沒有明顯的差異。

圖4 差異表達基因在不同時期的分布

此外，與菌絲期相比，L13、S0在孢子期、菌核期的表達量均有所降低，且存在顯著差異（P＜0.05）。雖然L17、S2、S10在菌絲期、孢子期的表達量沒有明顯差異，但在菌核期的表達量卻有所降低，且存在顯著差異（P＜0.05）（圖7）。除了這5個基因之外，L2、L5、L7、L8、L12、S3、S6等7個基因在孢子期表達上調，但是在菌核期明顯下調，且存在顯著差異（P＜0.05）。

2.3 黃曲霉核糖體蛋白基因功能富集分析

圖5 孢子期和菌核期表達量均上調的核糖體蛋白基因的表達分析

圖6 孢子期或菌核期表達量上調的核糖體蛋白基因的表達分析

圖7 表達量下調的核糖體蛋白基因的表達分析

對黃曲霉核糖體蛋白基因進行GO分類，得到包括分子功能，細胞組分和生物過程3部分，共9個類別的結果（表1）?？偣哺患玫?種分子功能，即結構分子活性功能（6個基因）和結合功能的（3個基因），其中S15既具有結構分子活性又具有結合功能。富集得到包含細胞、細胞部分、大分子復合物、細胞器和細胞器部分的5種細胞組分，其中L17、S0、S1、S15、S20在這5種細胞組分中均有出現。富集得到包括細胞過程和代謝過程在內的2種生物過程，P1、P2、L12、L21、L27、L34、S12、S24均參與這2種生物過程。值得注意的是，L21在所得到的分類中均有出現，而S15同時出現在分子功能和細胞組分的分類中。這暗示上述兩種核糖體蛋白可能具有較為重要的作用。

3 討論

核糖體蛋白作為核糖體的主要組成成分，除了在細胞內蛋白質生物合成中發(fā)揮著重要作用外，還具有其他的核糖體外生物學功能。為了探究黃曲霉核糖體蛋白與其生長發(fā)育之間的關系，我們利用熒光定量RT-PCR對黃曲霉菌絲期、孢子期、菌核期的74個核糖體蛋白基因的表達量進行分析，結果表明在黃曲霉生長發(fā)育的不同時期，核糖體蛋白基因的表達量存在明顯差異。

熒光定量RT-PCR結果表明，以菌絲期作為參照，共有54個核糖體蛋白基因的表達量在孢子期出現上調，在菌核期表達量上調的核糖體蛋白基因也有57個，且都存在顯著差異（P＜0.05）。引起這一現象的原因可能是黃曲霉完成其初始生長階段，以孢子的形成為代表的發(fā)育階段開始進行，菌體的發(fā)育及代謝的增多需要多種效應基因的響應，因而在孢子期和菌核期表達量上調的基因數量增多。如GO功能分析得到的分子功能中發(fā)揮結合功能的L1、L9、S15的表達量在孢子期或菌核期出現上調，這些核糖體蛋白的增多能夠結合rRNA形成更多的核糖體來發(fā)揮功能。參與細胞過程和代謝過程的P1、P2、L12、L21、L27、L34、S12、S24的表達量在孢子期或菌核期也出現上調。此外，有研究表明糖體蛋白L11、L23、S7能夠誘導細胞凋亡［18-20］，這3個基因的表達量在黃曲霉的孢子期和菌核期均出現上調，可能與菌體的逐漸衰老凋亡有關。

表1 黃曲霉核糖體蛋白基因GO分類

與菌絲期相比，有2個核糖體蛋白基因的表達量在孢子期是下調的，而到了菌核時期表達量下調的核糖體蛋白基因有12個。引起這一變化的原因可能是隨著發(fā)育的進行菌體內活性氧水平逐漸升高，高水平的活性氧促進了菌核的形成，但菌體中的氧化應激引起了內質網應激反應，在核糖體蛋白基因的表達上表現出效應［21-22］，因而使得在表達的核糖體蛋白基因減少。此外，有實驗表明核糖體蛋白L7的表達量下調明顯與細胞的衰老有關［23］。黃曲霉進入菌核期后，核糖體蛋白L7的表達量出現明顯下調，可能與該時期菌體的衰老有關。李紅艷［24］發(fā)現核糖體蛋白S3的表達減少導致細胞凋亡而引起果蠅幼蟲發(fā)育的遲緩。當黃曲霉進入生長發(fā)育的孢子期，核糖體蛋白S3的表達量明顯比菌絲期上調，而進入生長發(fā)育緩慢的菌核期后，核糖體蛋白S3的表達量明顯下調，暗示了核糖體蛋白S3在果蠅和黃曲霉中可能發(fā)揮相同的作用。

用可引起DNA損傷的重金屬鎘處理香魚肝細胞，熒光定量RT-PCR檢測結果表明核糖體蛋白P0的表達增加，表明核糖體蛋白P0與DNA的損傷修復有關［25］。黃曲霉進入菌核期后，核糖體蛋白P0的表達量明顯上調，可能是這一時期菌體中高水平的活性氧引起DNA的損傷，因而使得具有修復功能的蛋白P0的表達量上調。在應激條件下，去乙?；窼irT1可以增強細胞的自我修復，延長細胞壽命，而核糖體蛋白L13可以結合SirT1，促進其泛素化降解［13］。在黃曲霉的孢子期和菌核期，核糖體蛋白L13的表達量逐漸出現下調，可能與響應應激及延長菌體壽命有關。

雖然本研究從轉錄水平證實了黃曲霉核糖體蛋白與其生長發(fā)育之間存在著緊密聯系，但每個核糖體蛋白在生長發(fā)育過程中的具體作用還有待進一步的鑒定。

4 結論

本研究通過對黃曲霉菌絲期、孢子期、菌核期的74個核糖體蛋白基因的表達量分析發(fā)現，沒有一個被檢測的核糖體蛋白基因的表達量在三個時期都是恒定的。分析結果表明在孢子期參與生命活動的核糖體蛋白數目最多，菌核期次之，菌絲期最少。對黃曲霉核糖體蛋白基因進行GO功能分析表明，9個基因富集于2種分子功能，10個基因富集于5種細胞組分，有8個基因參與到細胞過程和代謝過程的生物過程中?？梢姾颂求w蛋白與黃曲霉的生長發(fā)育具有緊密聯系，而其在生長發(fā)育中具體的調控機制還有待進一步的研究。

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