張廣志 王加寧 吳曉青 周方園 張新建 趙曉燕 謝雪迎 周紅姿

（山東省應用微生物重點實驗室 齊魯工業(yè)大學（山東省科學院） 山東省科學院生態(tài)研究所，濟南 250014）

我國設施蔬菜產業(yè)自20世紀80年代中期以來，得到迅速發(fā)展。截止2015年，我國設施蔬菜面積已經達到388.84萬hm2，產值超過蔬菜總產值的60%［1］。由于設施蔬菜經濟附加值高，長期處于高集約化、高復種指數(shù)、高肥料、農藥施用量的生產狀態(tài)，導致土壤次生鹽澤化、養(yǎng)分失調、酸化，土壤肥力下降，微生物生態(tài)失衡，土傳病蟲害及農藥殘留等也日益加重［1］。利用微生物或生物制品可降解農藥殘留，防控土傳病蟲害，提升土壤肥力，是解決設施蔬菜可持續(xù)發(fā)展瓶頸的主要手段之一［2］。

木霉（Trichoderma）是土壤微生物的優(yōu)勢種群，一直作為生防菌或促生菌被廣泛研究和應用，近年來的研究表明木霉在土壤和水源污染（如農藥等有機物污染或重金屬污染）修復方面也有較高的研究應用價值［3］。張廣志等［4，5］從長期施藥的設施蔬菜土壤中分離出的多株木霉菌，在生防和農殘修復方面，均表現(xiàn)出較強的應用潛力。木霉越來越成為一種極具應用開發(fā)潛力的微生物資源，可以協(xié)同解決設施農業(yè)土壤中存在的多個問題，發(fā)揮其功能多樣化的優(yōu)勢［6］。但是微生物活體菌劑一直存在效果不穩(wěn)定的應用瓶頸，通常在盆栽及小區(qū)試驗，或者在無菌土壤以及與殺菌劑配合使用時，才能保證較理想的效果。原因主要在此試驗環(huán)境下，菌種較容易保持其種群優(yōu)勢，有效發(fā)揮群體效應。而在設施田間使用時，活體菌種除了受到日益惡化的土壤環(huán)境因素影響外，還要受到其他微生物種群以及同類微生物群體的影響。此外，設施土壤普遍應用的消毒方式，也使得土壤原微生物種群多樣性結構受到嚴重破壞，某些適應性強的有害微生物占據(jù)了優(yōu)勢，這些均會對施入微生物菌種的適應和定殖競爭造成威脅。為了更好了解設施土壤中木霉的多樣性，本研究探索番茄根圍土樣中的木霉種群結構、相對種群密度及功能活性特征，旨在為研究木霉的生態(tài)學，深入挖掘木霉菌資源及提高在設施農業(yè)上的高效應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 土樣選擇 樣品采自山東壽光紀臺鎮(zhèn)任家洼村一個連續(xù)20多年種植番茄的日光溫室，五點取樣，植株連根拔起，輕抖，僅帶根圍表面少量土壤，無菌袋密封帶回實驗室。

1.1.2 試劑及培養(yǎng)基 木霉選擇性培養(yǎng)基（THSM）：K2HPO40.90 g；MgSO4·7H2O 0.20 g；NH4NO31.0 g；KCl 0.15 g；葡萄糖 3.0 g；孟加拉紅0.15 g；瓊脂 15.0 g；蒸餾水 1.0 L。滅菌后加入氯霉素 0.25 g，鏈霉素 0.03 g和五氯硝基苯 0.2 g；PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯 200 g、葡萄糖 20 g、瓊脂 15 g、蒸餾水 1 000 mL；無機鹽液體培養(yǎng)基（MSM）：K2HPO41.50 g，KH2PO40.50 g，MgSO4·7H2O 0.50 g，（NH4）2SO40.50 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.002 g，CaCl20.04 g，NaCl 0.5 g，H2O 1 000 mL，pH7.0。

1.2 方法

1.2.1 木霉菌分離 用無菌刷將根系表面土壤刷下，混合，取土樣10 g，加到裝有100 mL無菌水的三角瓶中，置于搖床 140 r/min 15 min。取1 mL 土壤懸液加入9 mL無菌水的試管中，以此稀釋至104倍。采用混菌的方式，即將各稀釋濃度的菌懸液1 mL，加入9 cm平板上，再倒入適量50-55℃的木霉選擇性培養(yǎng)基（THSM）［7］，混勻，每個稀釋梯度3次重復。25℃恒溫培養(yǎng)，24 h 觀察一次，有疑似木霉菌落出現(xiàn)，用接種針挑出轉接到PDA平板上。同樣條件培養(yǎng)3-5 d，根據(jù)形態(tài)特征分組，去同，保存?zhèn)溆谩?/p>

將番茄根系用0.1%的升汞溶液和75%酒精表面消毒后，用解剖刀將根系切片，轉接到上述木霉選擇性培養(yǎng)基上，分離根系內生木霉菌，操作同上。通過稀釋倍數(shù)和平板出現(xiàn)的菌落數(shù)，估算各個木霉菌株在土樣中的相對種群密度和組成比例情況。

相對種群密度=稀釋倍數(shù)×該稀釋倍數(shù)平板上出現(xiàn)的菌落數(shù)平均數(shù)。

1.2.2 木霉菌種類鑒定和系統(tǒng)發(fā)育分析 結合形態(tài)學特征和tef1-α序列鑒定分離的木霉種類。采用真菌基因組DNA快速提取試劑盒（北京艾德萊生物科技有限公司）提取DNA，以此為模板擴增tef1-α（引物 EF1-728F：5'CATCGAGAAGTTCGAGAAGG 3'和TEF1-LLErev ：5'AACTTGCAGGCAATGTGG 3'）［8-9］。PCR采用C1000 Thermalcycler（BIO RAD），反應體系 25 μL ：1 μL 各引物（10 μmol/L），12.5 μL 2×Pfu PCR MasterMix（北京艾德萊生物科技有限公司），1 μL模板DNA，9.5 μL dd H2O。反應條件：預變性95℃ 5 min；95℃變性 40 s，55℃退火 40 s，72℃延伸60 s，進行35個循環(huán)；72℃延伸10 min，4℃保存［10-11］。PCR產物送上海生工純化并測序。測序 結 果 提 交 TrichoBLAST（WWW.ISTH.info） 和NCBI Nucleotide BLAST進行相似性比較分析。采用MEGA7.0軟件構建tef1-α序列系統(tǒng)進化樹［12］。

1.2.3 木霉對幾種常見土傳病原菌的抑菌作用測定 用經滅菌的直徑5 mm打孔器在分別活化2 d的木霉和病原菌（Rhizoctonia solani、Pythium ultimum和Fusarium solani）的菌落邊緣打取菌苔，分別移置于直徑9 cm 的PDA平板上（間距6 cm），于25℃條件下對峙培養(yǎng)，每處理重復3次。以只接種病原菌的為對照。待對照病原菌菌落快長到木霉接菌點或木霉菌落快長到病原菌接菌點時，測量各自菌落的半徑，并計算抑制率［4］。

1.2.4 木霉對毒死蜱的降解活性測定 按100 mg/L的濃度將毒死蜱加入到滅菌后的裝有50 mL無機鹽液體培養(yǎng)基（MSM）的250 mL三角瓶中，分別接種各木霉菌株的孢子懸液（1.0×108cfu/mL）1 mL，以不接木霉孢子懸液的處理為對照。每處理重復3次，置于30℃ 140 r/min培養(yǎng)5 d，并利用GC-ECD法檢測毒死蜱殘留量［13-14］，并計算降解率。

2 結果

2.1 毒死蜱降解木霉的分離和鑒定

圖1 木霉菌株的菌落形態(tài)

在木霉選擇性培養(yǎng)基上培養(yǎng)2 d后，陸續(xù)將4個稀釋梯度，共計12個平板上的疑似木霉菌落全部轉接到PDA平板上，再繼續(xù)培養(yǎng)3-5 d，通過菌落特征確認木霉菌菌株，共獲得木霉菌株126個，通過菌落形態(tài)結合鏡檢顯微特征，進一步分組，共獲得24個不同的組，組間菌株形態(tài)差異不明顯，初步確認為同一菌株，并各挑一個代表菌株，依次編號T1-1-T1-24，重新轉接至PDA培養(yǎng)基上，每個菌株3次重復，培養(yǎng)3-5 d，根據(jù)形態(tài)學和顯微特征的細微差別進一步確認分組。從根系中分離內生木霉菌16株，同上，最終確認不同菌株3株，編號分別為TN1-1-TN1-3。分離所有27株木霉，PDA平板形態(tài)如圖1所示，產孢簇常呈鮮綠色到暗綠色，分布不均勻，常形成同心圓結構。

將27個木霉菌株tef1-α序列，提交至TrichoBLAST（WWW.ISTH.info） 和 NCBI BLAST進行相似性檢索，結果表明，土樣中24個菌株，其中有11個菌株與T. virens代表菌株GJS 01-287相似度在99%，鑒定為T. virens（綠色木霉）；6個菌株與T. simmonsii代表菌株S86相似度在99%，鑒定為T. simmonsii（西蒙斯木霉）；3個菌株與T. atroviride代表菌株DAOM 222144相似度在99%，鑒定為T.atroviride（深綠木霉）；2個菌株與T. crassum代表菌株DAOM 164916相似度在99%，鑒定為T. crassum（厚木霉）；1個菌株與T. atrobrunneum代表菌株S369相似度在99%，鑒定為T. atrobrunneum（深褐木霉）。另有1株木霉，經過對比，與所有登記的木霉tef1-α序列相似度均在95 %以下。根據(jù)Bissett［15］公布的木霉種類名錄以及近兩年發(fā)表的新種［16-19］，目前所有被認可的木霉種類，均有相應的tef1和rpb2序列作為代表序列。tef1和rpb2序列是目前木霉系統(tǒng)發(fā)育分析及種類鑒定的主要依據(jù)，tef1通常比rpb2具有更高的分辨率，除個別種類外，依據(jù)tef1序列可以對木霉實現(xiàn)準確的種類認定［15，20］。因此根據(jù)tef1序列與GenBank所有登記的木霉tef1序列的對比結果，初步鑒定菌株T1-24為一木霉新種（T.sp.nov.）。3株內生木霉菌株TN1-1、TN1-2和TN1-3分別鑒定為T. atroviride、T. simmonsii和T. atrobrunneum，平板菌落形態(tài)與土樣中的同種菌株具有明顯差異，菌落顏色也普遍淺于土樣中菌株。

2.2 木霉菌株的相對種群密度

土樣中木霉，通過稀釋倍數(shù)和平板出現(xiàn)的菌落數(shù)，估算各個木霉菌株在土樣中的相對種群密度。該設施番茄的根圍土樣中，木霉的總的種群密度大約在104 CFU/g。各個菌株的組成，如圖2所示，T1-8、T1-23和T1-24三個菌株是其中優(yōu)勢菌株，占比分別為30%、20%和20%；其它菌株占比均在5 %或5 %以下。個別菌株，如T1-2、T1-7、T1-12、T1-16和T1-20，僅能在稀釋10倍的平板上出現(xiàn)，相對種群密度分別為10 CFU/g、20 CFU/g、30 CFU/g、10 CFU/g、20 CFU/g。

圖2 土壤中木霉各菌株的相對種群密度組成

2.3 木霉的系統(tǒng)發(fā)育分析

木霉菌株的tef1-α序列極大似然（ML）發(fā)育樹如圖3所示，已知木霉種類的菌株都在臨近的一條發(fā)育分支上，只有一個疑似新種與其他26株木霉的tef1-α序列相似性僅為92%，且位于相對較遠的發(fā)育分支上。由于本發(fā)育樹基于相對保守序列tef1進行構建，無法真實反映木霉種類下的各個菌株的系統(tǒng)進化情況，導致其中部分菌株，如T. virens的T1-21、T1-23、T1-18、T1-7和T1-11，在同一個發(fā)育位點上，序列相似性達到100%，但形態(tài)特征上，尤其菌落特征，如產孢簇分布、密度、顏色、形成同心圓個數(shù)及大小等方面，具有明顯的差異，仍可確認為不同菌株。T1-24菌株與所有登記的木霉tef1-α序列相似度在95%以下，與其他幾個種的菌株相距較遠，形態(tài)特征更是未見相似報道，現(xiàn)確定為一疑似木霉新種，為土壤木霉種類的優(yōu)勢種群（20.04%），僅次于T. virens（37.37%）和T. crassum（32.06%）；此外該木霉在多個設施菜地土樣中常有發(fā)現(xiàn)，應該為設施菜地土壤中的常見木霉種類。

圖3 基于菌株tef1-α序列構建的最大似然進化樹

2.4 木霉生防活性測定結果

平板對峙條件下，所有27個木霉菌株對3個供試病原真菌均有一定的抑菌作用，且同種不同菌株的抑菌效果有明顯的差異，表明這些同種不同菌株存在進化上（功能活性）的差異。其中木霉對立枯絲核菌（R. solani）的抑菌效果最為顯著（圖4），有13個菌株的抑菌率超過50%；而西蒙斯木霉（T.simmonsii）的7個菌株中有6個菌株的抑菌率超過82.0%，T1-2的抑菌率也達60.4%，表現(xiàn)普遍的生防潛能；綠色木霉（T. virens）、厚木霉（T. crassum）和深綠木霉（T. atroviride）中也各有1個菌株對立枯絲核菌有較高的生防潛能，抑菌率超過80%。

所試木霉菌株對病原真菌F. oxysporum的抑菌率相對較低（圖5），僅有7個菌株的抑菌率超過50%。其中綠色木霉的T1-22、T1-13菌株和厚木霉的T1-8菌株，抑菌率分別為54.1%、55.7%和54.0%；深綠木霉3個菌株抑菌率分別達78.7%、77.1%和63.9%，菌株T1-9卻僅為27.9%；新種T1-24抑菌率也達67.2%。對病原菌V. dahliae的抑菌率普遍較差（圖6），除西蒙斯木霉T1-15菌株抑菌率51.6%外，其它菌株抑菌率均在50%或50%以下；其中西蒙斯木霉的幾個菌株，相對較好，抑菌率集中在45.3%-51.6%。

2.5 木霉對毒死蜱降解效果

圖4 木霉菌株對立枯絲核菌的抑菌效果

圖5 木霉菌株對尖孢鐮孢菌的抑菌效果

圖6 木霉菌株對大麗輪枝菌的抑菌效果

圖7 木霉菌株對毒死蜱的降解效果

降解試驗結果如圖7所示，除深褐木霉（T.atrobrunneum）兩個菌株對毒死蜱的降解效果不明顯外；其它種類的木霉，均有菌株能有效降解毒死蜱，如綠色木霉T1-10、西蒙斯木霉的T1-2、深綠木霉的TN1-1、厚木霉的T1-6和疑似新種的T1-24菌株對毒死蜱的降解率分別最高達到58.3%、82.5%、72.1%、63.0%和38.2%。也有一些菌株，如綠色木霉T1-21、西蒙斯木霉T1-12等5個菌株孢子在含有100 mg/L毒死蜱的無機鹽溶液中不能萌發(fā)或生長，也未見有降解效果。降解實驗結果同時表明，同一個種的不同木霉菌株，對毒死蜱的降解效果也存在顯著差異，表明木霉菌的系統(tǒng)進化過程，不僅表現(xiàn)在形態(tài)學特征上，在功能活性上也有體現(xiàn)。

3 討論

通過對設施番茄根圍土樣和根圍內生木霉進行分離，依照形態(tài)學特征上的差異，共獲得27個不同木霉菌株（3株屬于內生木霉菌），這些木霉菌株產孢簇呈鮮綠色到暗綠色，產孢簇分布不均勻，常圍繞接菌點形成同心圓結構。同種類的木霉不同的菌株，形態(tài)學特征相似，但仍存在細微差別可以加以區(qū)分。結合tef1-α序列分析，鑒定27個菌株分別屬于5個已知木霉種和1個疑似新種。所有菌株對R.solani、F. oxysporum和V. dahliae三種具有代表性的土傳病原真菌具有普遍的不同程度的拮抗作用，同時，除厚木霉外，其它種類的木霉均有少數(shù)個別菌株能有效降解毒死蜱，表現(xiàn)土壤農殘修復的潛力。因此利用木霉菌，更容易篩選到兼具兩種功能甚至多種功能的木霉菌資源，實現(xiàn)生物防治與土壤農化殘留降解的協(xié)同應用目標，對于設施農業(yè)減少殺菌劑使用，延緩抗藥性；降解農藥殘留，減少農殘危害具有重要的意義。系統(tǒng)發(fā)育樹的構建，一定程度上反映了各個種類及菌株的進化發(fā)育關系，但由于tef1-α作為種類鑒定的序列標記，并不能反映菌株實際進化上的差異，因此，同種下的木霉部分菌株tef1-α序列相似性達到100%，在系統(tǒng)發(fā)育樹上處于同一進化分支。土壤中的木霉通常由幾種不同種類組成，每個種類的木霉可能存在不同的進化菌株，本研究中各菌株形態(tài)特征的細微差異及功能活性的不同差異給予其有效地證明。

不同的木霉菌株在土壤中的的種群密度也存在巨大差異，如T1-12相對種群密度僅為30 CFU/g，而T1-8相對種群密度約為T1-12的100倍，因此對土樣的木霉菌株最大程度的分離是研究土壤木霉資源及生態(tài)多樣性的基礎。本研究通過專用的木霉選擇性分離培養(yǎng)基，設置不同的土壤稀釋梯度，并通過混菌的方式，最大程度地對土樣中的木霉菌株進行了分離，尤其對種群密度相對極低的5個木霉菌株（10-30 CFU/g）也能有效進行分離，效率顯著。本研究表明，設施菜地土壤中，木霉具有豐富的多樣性，功能活性上的差異，也驗證了形態(tài)學特征上的菌株差異在不同菌株確認上應用的可行性，該特征可指導土壤中功能木霉的挖掘和篩選工作。該根圍土樣中木霉總的種群密度總體不高，約在104CFU/g，優(yōu)勢種為T. virens、T. crassum和T.sp. nov.，且只是個別菌株（T. virensT1-23、T. crassumT1-8和T.sp. nov. T1-24）占優(yōu)勢，表明這3個菌株在設施番茄根圍土樣中具有更好的適應性和競爭能力。但在對3種病原真菌的抑菌試驗以及對毒死蜱的降解試驗中，表現(xiàn)卻并不理想。因此在功能活性菌株的篩選過程中，很容易被舍去，而是選擇抑菌活性高或降解毒死蜱效率的菌株，如菌株T1-14、T1-4、T1-15以及T1-2，但這些菌株在土壤中的相對種群密度卻很低，即1.0×102CFU/g、1.0×102CFU/g、2.0×102CFU/g或10 CFU/g，預示在設施農業(yè)土壤中可能適應性或定殖競爭能力差，外源加入該環(huán)境的土壤中，種群優(yōu)勢很難得到持久保障，難以更長時間地發(fā)揮作用。由此表明，在農業(yè)微生物菌株的篩選過程中，除了考慮功能活性的高低外，也要考慮其種群密度或在環(huán)境中的適應性，才能篩選獲得更具實際應用潛力的菌株資源；或者通過其它措施提高試驗期內的種群密度優(yōu)勢，從而保證發(fā)揮其群體效應。

4 結論

從連續(xù)多年栽培番茄的設施大棚根圍土樣中分離木霉菌，研究其種群多樣性和相對種群密度，同時測定對植物病原真菌的抑菌活性和對有機磷農藥降解活性。共獲得6個不同的木霉種類，27個不同的木霉菌株。各木霉菌株在土樣中種群密度差異很大。所有木霉菌株對幾種常見土傳病原真菌具有普遍的不同程度的抑菌活性，部分菌株能有效降解有機磷農藥毒死蜱，可以實現(xiàn)生物防治與土壤農化殘留降解的協(xié)同應用目標。

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