鐘淵博，王 旭

(山東大學(xué) 國家膠體材料工程技術(shù)研究中心，山東 濟(jì)南 250100)

1 前 言

自從20世紀(jì)80年代胰島素作為首個(gè)人源重組蛋白質(zhì)藥物應(yīng)用于糖尿病的治療開始，蛋白質(zhì)藥物治療作為一種安全且直接的療法已經(jīng)取得了長足的發(fā)展[1-3]。目前，美國食品藥品監(jiān)督管理局已經(jīng)批準(zhǔn)130余種蛋白質(zhì)藥物用于各種疾病的治療[4]。然而由于蛋白質(zhì)藥物自身結(jié)構(gòu)及性質(zhì)的特點(diǎn)，其在應(yīng)用中仍存在著一系列的問題，比如其分子結(jié)構(gòu)復(fù)雜、穩(wěn)定性差易失活、體內(nèi)半衰期短、穿透細(xì)胞膜等生物屏障的能力差等[3]。藥物遞送系統(tǒng)能夠提高蛋白質(zhì)藥物的穩(wěn)定性、優(yōu)化其在體內(nèi)的代謝動(dòng)力學(xué)和組織分布、提高其生物膜穿透能力，從而提高其藥效[5, 6]。蛋白質(zhì)的聚乙二醇化(PEGylation)研究已經(jīng)有很長的歷史，這種方法能夠延長蛋白質(zhì)藥物在體內(nèi)的循環(huán)時(shí)間，提高藥物的穩(wěn)定性并降低藥物的免疫原性[7-10]。在可生物降解的聚合物微球中封裝蛋白質(zhì)藥物是另外一種較為常用的提高蛋白質(zhì)藥物穩(wěn)定性的方法[11-16]。在各種化學(xué)修飾或物理封裝過程中，最重要的一點(diǎn)就是要保留蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)及活性。然而，在修飾或封裝過程中所使用的有機(jī)溶劑或冷凍干燥等過程可能會(huì)造成蛋白質(zhì)的聚集并在一定程度上破壞蛋白質(zhì)藥物的結(jié)構(gòu)與活性[17]。將蛋白質(zhì)藥物封裝在納米凝膠[18, 19]或水凝膠[20, 21]中這一過程無需有機(jī)溶劑的參與，也不涉及冷凍干燥等可能破壞蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的操作。但是，納米凝膠或水凝膠的制備往往依賴于聚合或化學(xué)交聯(lián)反應(yīng)，這會(huì)降低蛋白質(zhì)藥物封裝的可控性，而且進(jìn)行聚合或交聯(lián)時(shí)所使用的化學(xué)試劑可能會(huì)影響這些體系應(yīng)用于生物體內(nèi)時(shí)的安全性。將蛋白質(zhì)藥物在中性水溶液中原位負(fù)載進(jìn)入聚合物納米粒子無疑是一種最為安全可靠的封裝方法[22]。蛋白質(zhì)表面通常含有大量的帶電基團(tuán)及疏水區(qū)域[23, 24]，如果能夠根據(jù)蛋白質(zhì)的帶電及疏水區(qū)域進(jìn)行有針對(duì)性的聚合物載體設(shè)計(jì)，通過靜電及疏水作用力的協(xié)同效應(yīng)使聚合物與蛋白質(zhì)最大程度復(fù)合，無疑將大大提高蛋白質(zhì)藥物封裝的穩(wěn)定性及可靠性[22]。

2 線性-樹枝狀嵌段共聚物用于蛋白遞送

線性-樹枝狀嵌段共聚物(telodendrimer)[25-27]是由線性聚合物嵌段與樹枝狀嵌段通過化學(xué)鍵連接而成的一類拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的雜化共聚物。兩親性的線性-樹枝狀嵌段共聚物在水溶液中可通過自組裝形成納米粒子，其已被廣泛應(yīng)用在小分子藥物傳遞領(lǐng)域：Li等[28]合成了可交聯(lián)型線性-樹枝狀嵌段共聚物，利用硼酸鹽和鄰苯二酚之間的可逆交聯(lián)反應(yīng)穩(wěn)定抗癌藥物紫杉醇的封裝；相比于未交聯(lián)的納米粒子，交聯(lián)后的納米粒子具有更加緩慢藥物釋放速度，并可以通過微酸性或甘露醇的刺激加速藥物的釋放。Kenyon等[29]報(bào)道了利用含膽酸的線性-樹枝狀嵌段共聚物納米粒子對(duì)地塞米松進(jìn)行封裝，用于治療哮喘模型小鼠；使用納米粒子封裝的地塞米松組與未封裝的地塞米松組相比，其免疫反應(yīng)更低，呼吸受阻更低，從而表明納米粒子對(duì)抗炎藥物的封裝和保護(hù)可提高藥物的使用效果。Zhang等[30]采用聚乙二醇(PEG)及farnesylthiosalicylate構(gòu)建線性-樹枝狀嵌段共聚物，并利用其封裝紫杉醇治療胸腺癌，取得了較好的治療效果。Choi等[31]采用線性-樹枝狀嵌段共聚物封裝乙酰唑胺，實(shí)現(xiàn)了藥物的高效裝載，增強(qiáng)了使膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡的作用。

相比于樹枝狀高分子，線性-樹枝狀共聚物的合成方法往往更為簡單，所合成的多分支結(jié)構(gòu)具有多終端的功能基團(tuán)，并且具有可調(diào)控性，從而可以根據(jù)不同的用途進(jìn)行調(diào)整設(shè)計(jì)[32]。與具有自由線團(tuán)結(jié)構(gòu)的線性聚合物相比，樹枝狀嵌段的球形結(jié)構(gòu)往往會(huì)影響線性-樹枝狀嵌段共聚物的物理化學(xué)性質(zhì)[33, 34]。Gitsov等[35, 36]報(bào)道了線性聚乙二醇-樹枝狀聚芐醚嵌段共聚物可以與漆酶的多糖結(jié)構(gòu)有效作用，通過為底物提供疏水腔進(jìn)而提高其酶活性；而線性聚乙二醇-聚苯乙烯嵌段共聚物則持續(xù)降低漆酶的催化活性。該研究預(yù)示了利用線性-樹枝狀共聚物有效遞送蛋白質(zhì)藥物的可能。

除了特殊的分子結(jié)構(gòu)對(duì)蛋白質(zhì)活性的影響外，線性-樹枝狀嵌段共聚物還具有精確可調(diào)的化學(xué)組成及結(jié)構(gòu)[27, 37]，這為穩(wěn)定負(fù)載及靶向輸送蛋白質(zhì)藥物以及根據(jù)蛋白質(zhì)藥物結(jié)構(gòu)進(jìn)行聚合物載體的定制化設(shè)計(jì)提供了良好的材料學(xué)基礎(chǔ)。下面將介紹4個(gè)利用線性-樹枝狀嵌段共聚物或其雜化體系對(duì)蛋白質(zhì)藥物進(jìn)行有效封裝及靶向輸送的成功實(shí)例。

2.1 線性-樹枝狀嵌段共聚物納米粒子用于蛋白質(zhì)的原位封裝與遞送

受到生物體系中多重協(xié)同作用力的啟發(fā)，Wang等[22]利用線性-樹枝狀嵌段共聚物高度可控的化學(xué)組成及結(jié)構(gòu)，根據(jù)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)及性質(zhì)，合成了與蛋白質(zhì)具有多重雜化超分子相互作用力的線性-樹枝狀嵌段共聚物，并用于蛋白質(zhì)的穩(wěn)定封裝及靶向遞送。這種線性-樹枝狀嵌段共聚物由線性的聚乙二醇及樹枝狀的寡聚氨基酸骨架構(gòu)成。其中，寡聚氨基酸的末端含有功能性基團(tuán)，可進(jìn)一步進(jìn)行功能化修飾。如圖1a所示，這些功能性基團(tuán)可以為帶正電的氨基或胍基，也可以為帶負(fù)電的羧酸基。這些帶正電或負(fù)電的基團(tuán)可以與蛋白質(zhì)表面的帶電基團(tuán)通過靜電相互作用力復(fù)合。此外，不同的疏水基團(tuán)(如十七酸、膽固醇、維他命E等)也可以被修飾在寡聚氨基酸的末端，從而促進(jìn)線性-樹枝狀嵌段共聚物與蛋白質(zhì)通過疏水-疏水相互作用進(jìn)行復(fù)合[22]。這種設(shè)計(jì)具有以下3個(gè)優(yōu)點(diǎn)：① 樹枝狀的雜化功能性基團(tuán)可以最大程度地貼合蛋白質(zhì)各向異性的表面及溝槽，從而提高線性-樹枝狀嵌段共聚物與蛋白質(zhì)發(fā)生作用的可能性與穩(wěn)定性；② 多重相互作用可以提高線性-樹枝狀嵌段共聚物與蛋白質(zhì)之間作用力的強(qiáng)度；③ 線性-樹枝狀嵌段共聚物中疏水基團(tuán)的存在可以有效降低周圍環(huán)境的極性，從而顯著提高靜電相互作用力的強(qiáng)度[38-40]，進(jìn)而形成穩(wěn)定的蛋白質(zhì)/線性-樹枝狀嵌段共聚物復(fù)合納米粒子。

優(yōu)化的線性-樹枝狀嵌段共聚物可以與蛋白質(zhì)(如牛血清白蛋白BSA、胰島素Insulin等) 復(fù)合形成直徑小于30 nm的納米粒子。其負(fù)載量最高可達(dá)200%(線性-樹枝狀嵌段共聚物 ∶蛋白質(zhì)=1 ∶2，質(zhì)量比)。研究表明，線性-樹枝狀嵌段共聚物中帶電基團(tuán)的選擇應(yīng)遵守電荷互補(bǔ)原則，即利用帶正電的基團(tuán)負(fù)載負(fù)電性的蛋白質(zhì)(如牛血清白蛋白、胰島素等)，利用負(fù)電基團(tuán)負(fù)載正電性的蛋白質(zhì)(如溶菌酶、胰蛋白酶等)。此外，胍基具有很好的細(xì)胞膜穿透性，所以利用含胍基的線性-樹枝狀嵌段共聚物可以進(jìn)行蛋白質(zhì)的細(xì)胞內(nèi)傳遞[22]。線性-樹枝狀嵌段共聚物中的疏水官能團(tuán)的種類會(huì)對(duì)蛋白質(zhì)封裝的穩(wěn)定性產(chǎn)生影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，含有維他命E的線性-樹枝狀嵌段共聚物與模型蛋白質(zhì)牛血清白蛋白具有較強(qiáng)的結(jié)合作用，可用于其穩(wěn)定封裝。相比于未封裝的自由蛋白質(zhì)，利用上述納米粒子可以將蛋白質(zhì)藥物有效地遞送至HT-29結(jié)腸癌裸鼠移植瘤部位(圖1b)。這一方面是因?yàn)槔镁€性-樹枝狀嵌段共聚物進(jìn)行穩(wěn)定的蛋白質(zhì)封裝可有效延長蛋白質(zhì)在小鼠體內(nèi)的循環(huán)時(shí)間，另一方面則是因?yàn)樾〕叽绲募{米粒子基于實(shí)體瘤高通透性和滯留效應(yīng)(the enhanced permeability and retention effects)[41]可富集在腫瘤部位。這種利用線性-樹枝狀嵌段共聚物封裝蛋白質(zhì)藥物的方法可在中性水溶液中直接進(jìn)行而不需要任何的催化劑或有機(jī)溶劑。這種原位封裝蛋白質(zhì)藥物的方法可以在最大程度上保留蛋白質(zhì)藥物的活性，利用這種方法可以實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)藥物的穩(wěn)定封裝及靶向遞送，從而更好地實(shí)現(xiàn)利用蛋白質(zhì)藥物對(duì)疾病進(jìn)行有效治療。

圖1 線性-樹枝狀嵌段共聚物的結(jié)構(gòu)及蛋白質(zhì)封裝示意圖 (a)；結(jié)腸癌裸鼠移植瘤活體成像(b)，未封裝的自由熒光蛋白質(zhì)(上，#A1) 及線性-樹枝狀嵌段共聚物封裝的熒光蛋白質(zhì)(下，#A2)通過靜脈注射給藥，圖中黑線圈出了腫瘤部位[22]Fig.1 Schematic illustrations of telodendrimer structures and protein encapsulation (a); In vivo animal images of HT-29 colon cancer bearing nude mice xenograft models (#A1 and #A2) after tail vein injection of free Cy5-protein, and Cy5-protein-loaded telodendrimer nanoparticles (b), the black circles in (b) indicate the tumor sites[22]

2.2 類脂質(zhì)/線性-樹枝狀嵌段共聚物雜化納米粒子運(yùn)載蛋白質(zhì)藥物治療原位腦瘤

多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(glioblastoma multiforme)是一種常見且難以治愈的腦腫瘤[42]。血腦屏障會(huì)阻止絕大多數(shù)小分子藥物及幾乎所有大分子藥物的通過[43]，即限制了藥物分子作用于腦腫瘤部位。增強(qiáng)對(duì)流遞送(convection-enhanced delivery)是一種持續(xù)的局部注射療法，與擴(kuò)散的方法相比能將輸注藥物的滲透能力提高一個(gè)量級(jí)，從而將無法通過血腦屏障的藥物遞送至腦瘤部位[42]。然而現(xiàn)階段，利用增強(qiáng)對(duì)流遞送方法結(jié)合聚合物載體進(jìn)行藥物的輸送還停留在小分子藥物的遞送階段[44]。很多蛋白質(zhì)藥物對(duì)腫瘤具有非常好的治療效果，比如白喉毒素[45]。據(jù)報(bào)道，單個(gè)白喉毒素分子進(jìn)入腦瘤細(xì)胞后通過抑制蛋白質(zhì)的合成就足以殺死一個(gè)腦瘤細(xì)胞[45-47]。然而，白喉毒素的非特異性毒性限制了其作為蛋白質(zhì)藥物治療腦瘤的應(yīng)用。為了克服其非特異性毒性，科學(xué)家們開發(fā)了截短型白喉毒素(DT390)[48]。然而截短型白喉毒素自身卻無法進(jìn)入細(xì)胞，更無法發(fā)揮藥效[46]。所以需要有針對(duì)性地設(shè)計(jì)載體用于穩(wěn)定負(fù)載截短型白喉毒素并進(jìn)行其細(xì)胞內(nèi)的傳遞。綜上，合理的開發(fā)載體運(yùn)載截短型白喉毒素進(jìn)入細(xì)胞并結(jié)合增強(qiáng)對(duì)流遞送手段，則有望實(shí)現(xiàn)對(duì)原位腦瘤的有效治療。

依據(jù)上述思路，Wang等[49]開發(fā)了一種類脂質(zhì)(lipidoid)/線性-樹枝狀嵌段共聚物雜化納米粒子(圖2a)。該納米粒子具有精細(xì)可調(diào)的粒子尺寸及表面化學(xué)。優(yōu)化的納米粒子具有56 nm的水力學(xué)直徑及中性的表面電勢，它可以有效負(fù)載蛋白質(zhì)藥物并實(shí)現(xiàn)其細(xì)胞內(nèi)傳遞。這種負(fù)載有蛋白質(zhì)藥物的雜化納米粒子通過增強(qiáng)對(duì)流遞送手段運(yùn)送至原位腦瘤后具有良好的腫瘤內(nèi)擴(kuò)散性及長的保留時(shí)間，從而可以實(shí)現(xiàn)對(duì)腦瘤的長效給藥。如圖2b和2c所示，負(fù)載有牛血清白蛋白的雜化納米粒子及未封裝的自由截短型白喉毒素對(duì)比組對(duì)原位腦瘤均無明顯的治療效果，而負(fù)載有截短型白喉毒素的雜化納米粒子治療組則能顯著抑制腦瘤的生長。此研究將促進(jìn)增強(qiáng)對(duì)流遞送在納米載體輸送蛋白質(zhì)藥物治療原位腦瘤方面的發(fā)展。

圖2 負(fù)載有蛋白質(zhì)藥物的類脂質(zhì)/線性-樹枝狀嵌段共聚物雜化納米粒子制備及原位腦瘤治療示意圖 (a)，在接種U87腫瘤細(xì)胞于 小鼠顱內(nèi)后的第7、17及24 d時(shí)，基于不同的治療方式下小鼠的生物發(fā)光成像指出腦瘤大小 (b)，負(fù)載截短型白喉毒素的 類脂質(zhì)/線性-樹枝狀嵌段共聚物雜化納米粒子有效抑制腦瘤的生長(c) [ 49]Fig.2 Schematic illustrations of the formation of protein-loaded lipidoid-telodendrimer hybrid nanoparticles and brain tumor treatment (a), Typical bioluminescence images of mice injected with intracranial U87 tumors treated with different formulations at different days after the cell intracranial implantation (b), DT390-incorporated nanoparticle delivery suppresses tumor growth on mice injected with intracranial U87 tumors, *P < 0.05 as comparison to each control group (c) [49]

2.3 基于線性-樹枝狀嵌段共聚物的蛋白質(zhì)藥物載體定制化設(shè)計(jì)

前面介紹了兩個(gè)基于靜電作用及疏水作用協(xié)同進(jìn)行蛋白質(zhì)藥物有效負(fù)載及靶向輸送的例子。在此類納米載體中，帶電基團(tuán)的選擇往往相對(duì)容易，即在考慮電荷互補(bǔ)原則的基礎(chǔ)上根據(jù)遞送需求進(jìn)行帶電基團(tuán)的選擇。比如，當(dāng)目標(biāo)蛋白質(zhì)藥物為負(fù)電性的截短型白喉毒素時(shí)，需要選擇胍基、叔胺基等作為帶電基團(tuán)以便實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)藥物的細(xì)胞內(nèi)傳遞；而當(dāng)目標(biāo)蛋白質(zhì)藥物為負(fù)電性的胰島素時(shí)，則一般選擇毒性較低的伯氨基作為帶電性基團(tuán)，這樣一方面伯氨基可以與負(fù)電性的胰島素通過靜電相互作用結(jié)合，另一方面伯氨基的使用也會(huì)避免胰島素在遞送過程中發(fā)生不必要的細(xì)胞攝取(胰島素能夠結(jié)合細(xì)胞表面的受體進(jìn)而引發(fā)葡萄糖的注入，所以胰島素需要在細(xì)胞外釋放，而應(yīng)避免聚陽離子引起的胰島素細(xì)胞攝取)，從而最大程度地發(fā)揮胰島素的藥效[50]。相比于帶電基團(tuán)的選擇，疏水基團(tuán)的合理選擇要困難許多。如何根據(jù)目標(biāo)蛋白質(zhì)藥物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行疏水基團(tuán)的合理選擇及納米載體構(gòu)建是一項(xiàng)巨大的挑戰(zhàn)。

以線性-樹枝狀嵌段共聚物為材料基礎(chǔ)，Wang等[50]提出了一個(gè)計(jì)算機(jī)虛擬篩選輔助聚合物載體定制的概念。如圖3a所示，首先選擇一個(gè)小分子數(shù)據(jù)庫，利用分子對(duì)接等計(jì)算模擬方法計(jì)算小分子與蛋白質(zhì)藥物胰島素的對(duì)接能，并按對(duì)接能高低將這些小分子進(jìn)行排序；然后將這些小分子利用化學(xué)反應(yīng)接枝在預(yù)先修飾有正電性基團(tuán)的線性-樹枝狀嵌段共聚物上從而制備了一個(gè)聚合物庫，并利用這些聚合物封裝胰島素從而制備了一個(gè)胰島素納米制劑庫；接下來對(duì)該納米制劑庫進(jìn)行系統(tǒng)的評(píng)估及優(yōu)化，主要研究利用聚合物對(duì)胰島素進(jìn)行封裝的穩(wěn)定性、胰島素體外釋放動(dòng)力學(xué)、胰島素體內(nèi)代謝動(dòng)力學(xué)、血糖抑制情況等；最后利用實(shí)驗(yàn)結(jié)果來驗(yàn)證計(jì)算機(jī)預(yù)測結(jié)果的正確性。研究表明，計(jì)算機(jī)預(yù)測與實(shí)驗(yàn)結(jié)果具有很好的一致性，即含有與胰島素具有較低對(duì)接能的分子的聚合物納米粒子具有較高的胰島素封裝穩(wěn)定性及較長時(shí)間的血糖抑制效果(圖3b和3c)，這驗(yàn)證了該聚合物載體定制化設(shè)計(jì)方法的可行性。通過該方法篩選出的優(yōu)化的聚合物載體能夠有效封裝胰島素并調(diào)控其釋放動(dòng)力學(xué)，從而有效延長了單次注射胰島素對(duì)血糖的控制時(shí)間，從而有望減輕由于頻繁注射胰島素給糖尿病患者帶來的巨大痛苦。綜上，利用該方法可實(shí)現(xiàn)根據(jù)蛋白質(zhì)藥物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行聚合物載體的定制化設(shè)計(jì)，這很大程度上提高了聚合物載體設(shè)計(jì)及制備的針對(duì)性與目的性。利用這種方法制備的藥物制劑有望實(shí)現(xiàn)對(duì)疾病更好的治療。

圖3 計(jì)算機(jī)輔助虛擬篩選優(yōu)化聚合物載體設(shè)計(jì)用于胰島素遞送示意圖 (a)，平衡解離常數(shù)的自然對(duì)數(shù)與平均對(duì)接能的關(guān)系曲 線 (b)，不同聚合物載體遞送胰島素對(duì)低血糖生成指數(shù)的影響 (c) [50]Fig.3 Schematic illustrations of rational design and combinatorial synthesis of telodendrimers for protein delivery (a); Natural logarithm of equilibrium dissociation constant (lnKD) plotted against average docking energy (Ea) (b), linear regression was fit via Ordinary Least Square to calculate the Pearson correlation coefficient r and the associated P values; Quantification of hypoglycemia index (c) [50]

2.4 陽離子聚合物/線性-樹枝狀嵌段共聚物復(fù)合物用于蛋白質(zhì)的細(xì)胞內(nèi)遞送

陽離子聚合物作為一種高效的非病毒型載體材料已被廣泛應(yīng)用于基因遞送領(lǐng)域[51-55]，其最近也被嘗試應(yīng)用于蛋白質(zhì)藥物的細(xì)胞內(nèi)傳遞[3, 56]。然而，陽離子聚合物自身的一些特點(diǎn)(包括高細(xì)胞毒性、高溶血性、非特性粘附或聚集性等)[52, 57]卻嚴(yán)重限制了其作為蛋白質(zhì)藥物載體的應(yīng)用。針對(duì)這一問題，Wang等[58]設(shè)計(jì)并制備了一種含有負(fù)電基團(tuán)及疏水基團(tuán)的線性-樹枝狀嵌段共聚物，其通過靜電作用、疏水作用與陽離子聚合物、蛋白質(zhì)復(fù)合，作為可移除的保護(hù)層在降低陽離子聚合物細(xì)胞毒性、溶血性、非特異粘附及聚集性的同時(shí)，提高其細(xì)胞內(nèi)傳遞蛋白質(zhì)分子的能力。

蛋白質(zhì)、陽離子聚合物(如聚乙烯亞胺PEI)與線性-樹枝狀嵌段共聚物的復(fù)合發(fā)生在中性水溶液中且不需要任何的催化劑或有機(jī)溶劑。這種基于多重雜化超分子相互作用力的復(fù)合具有較高的穩(wěn)定性。綠色熒光染料異硫氰酸熒光素(FITC)被用于標(biāo)記牛血清白蛋白(圖4a～4c)或線性-樹枝狀嵌段共聚物(圖4d)。同大多數(shù)蛋白質(zhì)分子一樣，模型蛋白質(zhì)分子牛血清白蛋白自身無法穿透細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞(圖4a)；當(dāng)利用陽離子聚合物作為載體遞送牛血清白蛋白時(shí)，除了引入高細(xì)胞毒性及溶血性外，還造成了在細(xì)胞外與培養(yǎng)液中各種生物大分子的嚴(yán)重聚集(圖4b)，其影響了蛋白質(zhì)的細(xì)胞內(nèi)傳遞效率；使用線性-樹枝狀嵌段共聚物保護(hù)層不但可以降低陽離子聚合物引起的細(xì)胞毒性及溶血性，還可完全消除聚集現(xiàn)象且可以有效地將牛血清白蛋白遞送至細(xì)胞內(nèi)(圖4c)；線性-樹枝狀嵌段共聚物不僅作為保護(hù)層以降低載體引起的細(xì)胞毒性、溶血性及聚集性，而且在蛋白質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞這一過程中，線性-樹枝狀嵌段共聚物會(huì)自發(fā)地從蛋白質(zhì)-陽離子聚合物復(fù)合物上解離而不會(huì)隨蛋白質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞(圖4d)，這將在最大程度上保持(或恢復(fù))陽離子聚合物的高胞內(nèi)傳遞能力。這種以線性-樹枝狀嵌段共聚物作為可移除的保護(hù)層輔助陽離子聚合物進(jìn)行有效的蛋白質(zhì)分子細(xì)胞內(nèi)傳遞的策略將在蛋白質(zhì)藥物治療領(lǐng)域有廣闊的應(yīng)用前景。

圖4 結(jié)腸癌細(xì)胞的共聚焦熒光顯微鏡照片，細(xì)胞分別使用下述 試劑在37 ℃下進(jìn)行共培養(yǎng)3 h：(a) 未封裝的自由熒光蛋 白質(zhì)，(b) 熒光蛋白質(zhì)/陽離子聚合物復(fù)合物(1 ∶2，質(zhì)量 比)，(c) 熒光蛋白質(zhì)/陽離子聚合物/線性-樹枝狀嵌段共 聚物復(fù)合物(1 ∶2 ∶2，質(zhì)量比)，(d) 蛋白質(zhì)/陽離子聚合 物/熒光線性-樹枝狀嵌段共聚物復(fù)合物(1 ∶2 ∶2，質(zhì)量比) [58]Fig.4 Confocal fluorescence microscopy images of HT-29 cells incubated with free FITC-BSA (a), FITC-BSA:PEI (1 ∶2, w/w) (b), FITC-BSA:PEI:telodendrimer (1 ∶2 ∶2, w/w) (c), and BSA: PEI:FITC-telodendrimer (1 ∶2 ∶2, w/w) (d) at 37 ℃ for 3 h[58]

2.5 線性-樹枝狀嵌段共聚物的分子設(shè)計(jì)及納米粒子制備

上面介紹了4個(gè)利用線性-樹枝狀嵌段共聚物或其復(fù)合納米粒子對(duì)蛋白質(zhì)藥物進(jìn)行有效封裝及靶向輸送的例子[22, 49, 50, 58]。合理的設(shè)計(jì)并制備線性-樹枝狀嵌段共聚物是實(shí)現(xiàn)上述功能的關(guān)鍵。在本節(jié)中，將闡述線性-樹枝狀嵌段共聚物分子設(shè)計(jì)的基本原則(表1)。在結(jié)構(gòu)上，由于聚乙二醇分子具有良好的親水性及低免疫原性等特點(diǎn)，所以上述4個(gè)例子中所使用的線性-樹枝狀嵌段共聚物的線性高分子均為PEG5k(分子量為5000道爾頓的聚乙二醇)。具有雙氨基結(jié)構(gòu)的賴氨酸是構(gòu)筑樹枝狀寡聚氨基酸骨架的理想選擇。當(dāng)利用線性-樹枝狀嵌段共聚物封裝負(fù)電性蛋白質(zhì)藥物(如胰島素、截短型白喉毒素等)時(shí)應(yīng)選擇正電性分子進(jìn)行線性-樹枝狀嵌段共聚物的功能化；其中精氨酸上所帶的胍基誘導(dǎo)細(xì)胞攝取納米粒子的效果較好[22]，而賴氨酸結(jié)構(gòu)上的靈活性使其所帶的氨基能夠與蛋白質(zhì)的羧基形成穩(wěn)定的離子鍵及氫鍵相互作用[50]，所以應(yīng)針對(duì)所需遞送的蛋白質(zhì)的種類合理選擇正電性分子對(duì)線性-樹枝狀嵌段共聚物進(jìn)行修飾。當(dāng)利用線性-樹枝狀嵌段共聚物結(jié)合正電性蛋白(如溶菌酶等)或與陽離子聚合物(如PEI等)形成復(fù)合物時(shí)，則應(yīng)選擇含羧酸基團(tuán)的負(fù)電性分子對(duì)線性-樹枝狀嵌段共聚物進(jìn)行功能化[22, 58]。線性-樹枝狀嵌段共聚物中的疏水基團(tuán)主要用于與蛋白質(zhì)藥物或類脂質(zhì)的疏水區(qū)域或基團(tuán)通過疏水相互作用結(jié)合[22, 49]，所以應(yīng)根據(jù)蛋白質(zhì)藥物或類脂質(zhì)的結(jié)構(gòu)選擇合適的疏水分子對(duì)線性-樹枝狀嵌段共聚物進(jìn)行修飾。此外，上述線性-樹枝狀嵌段共聚物的合成所使用的是多肽化學(xué)[22]，所以所制備的線性-樹枝狀嵌段共聚物不但具有良好的生物相容性，還具有可生物降解性，其可以作為一種安全的蛋白質(zhì)藥物載體應(yīng)用于體內(nèi)研究。

表1 線性-樹枝狀嵌段共聚物分子設(shè)計(jì)及納米粒子制備概述

*Other component in the telodendrimer-based hybrid nanoparticles

3 結(jié) 語

利用線性-樹枝狀嵌段共聚物遞送蛋白質(zhì)藥物是一項(xiàng)新興且十分有意義的研究。線性-樹枝狀嵌段共聚物精確可控的化學(xué)組成及結(jié)構(gòu)為根據(jù)蛋白質(zhì)藥物的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)及功能定向設(shè)計(jì)并制備聚合物載體提供了可能。而以線性-樹枝狀嵌段共聚物為基礎(chǔ)的雜化體系的開發(fā)也豐富了納米載體的制備手段并促進(jìn)了蛋白質(zhì)藥物的胞內(nèi)傳遞及靶向傳遞。相信隨著對(duì)線性-樹枝狀嵌段共聚物及其雜化體系認(rèn)識(shí)的不斷加深，人們會(huì)開發(fā)出越來越多的先進(jìn)功能型納米載體用于遞送蛋白質(zhì)藥物以實(shí)現(xiàn)對(duì)各種疾病的有效治療。

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