摘 要：研究珍珠貝外套膜膠原蛋白肽（pearl oyster mantle collagen peptide，POM-CP）及其鋅螯合物（zinc-chelating pearl oyster mantle collagen peptide，POMCP-Zn）對小鼠前成骨細(xì)胞MC3T3-E1增殖分化的影響。結(jié)果表明：噻唑藍(lán)檢測結(jié)果顯示，與空白對照組相比，POMCP-Zn能夠顯著促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖，而POM-CP對成骨細(xì)胞的增殖性無顯著影響；與空白對照組相比，400 μg/mL的POM-CP和10 μg/mL的POMCP-Zn將成骨細(xì)胞的堿性磷酸酶活性分別提高到1.31 倍和1.48 倍；POMCP-Zn還可以提高成骨細(xì)胞分化階段Ⅰ型膠原蛋白、骨鈣素蛋白的分泌量，同時(shí)促進(jìn)成骨細(xì)胞礦化階段骨結(jié)節(jié)的形成。綜上所述，與POM-CP相比，POMCP-Zn對成骨細(xì)胞MC3T3-E1的增殖和分化有較強(qiáng)的促進(jìn)作用，POMCP-Zn有望成為預(yù)防骨質(zhì)疏松癥的潛在功能性食品。

關(guān)鍵詞：珍珠貝外套膜；肽鋅螯合物；MC3T3-E1細(xì)胞；骨質(zhì)疏松癥

Abstract： This study was aimed to investigate the effects of peptides （POM-CP） and zinc-chelating peptides （POMCP-Zn） from pearl oyster mantle collagen on the proliferation and differentiation of the osteoblastic cell line MC3T3-E1. The results of methyl thiazolyl tetrazolium assay （MTT） showed that POMCP-Zn significantly stimulated osteoblastic proliferation in comparison to the control， while POM-CP had no effect on cell proliferation. In addition， POM-CP at 400 μg/mL and POMCP-Zn at 10 μg/mL increased alkaline phosphatase activity 1.31- and 1.48-folds in osteoblastic cells compared with the control. Moreover， POMCP-Zn promoted the production of collagen type I and osteocalcin during osteoblastic differentiation and the formation of bone nodules osteoblastic mineralization. In conclusion， POMCP-Zn exerted a stronger effect than POM-CP on the proliferation and differentiation of MC3T3-E1 and POMCP-Zn is a potential candidate functional factor for osteoporosis prevention.

Keywords： pearl oyster mantle； zinc-chelating peptides； MC3T3-E1 cells； osteoporosis

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-201802002

中圖分類號(hào)：TS254.9 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1001-8123（2018）02-0008-07

引文格式：

馬婷， 吳謙， 申鉉日. 珍珠貝外套膜膠原蛋白肽及其鋅螯合物的體外抑制骨質(zhì)疏松作用[J]. 肉類研究， 2018， 32（2）： 8-14. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-201802002. http：//www.rlyj.pub

MA Ting， WU Qian， SHEN Xuanri. Antiosteoporotic effects of collagen peptides and zinc-chelating complex from pearl oyster mantle[J]. Meat Research， 2018， 32（2）： 8-14. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-201802002. http：//www.rlyj.pub

馬氏珍珠貝（Pinctada martensii）是全球廣泛養(yǎng)殖的用于培養(yǎng)海水珍珠最重要的雙殼類軟體動(dòng)物之一，在中國、日本和東南亞地區(qū)廣泛分布[1]。然而隨著海水珍珠養(yǎng)殖量的增加，大量的貝肉及珍珠貝外套膜等副產(chǎn)物被丟棄。因此，利用珍珠貝的加工副產(chǎn)物提取膠原蛋白來提高其附加值變得尤為重要。已有文獻(xiàn)報(bào)道了扇貝膠原蛋白的理化性質(zhì)及生物學(xué)功能。Shen等[2]研究發(fā)現(xiàn)，扇貝外套膜膠原蛋白的分子結(jié)構(gòu)、氨基酸含量和肽圖譜不同于Ⅰ型膠原蛋白，推測這種扇貝外套膜膠原蛋白為類Ⅴ型膠原蛋白。Mizuta等[3]發(fā)現(xiàn)外套膜膠原蛋白含量占干質(zhì)量的7.7%～12.6%，占總蛋白含量的13.5%～26.5%。膠原蛋白具有廣泛的生物活性，與細(xì)胞的增殖、分化、黏附和遷移密切相關(guān)[4-5]。然而，迄今為止，有關(guān)類Ⅴ型膠原蛋白的生物活性卻少有報(bào)道。

在正常的骨穩(wěn)態(tài)下，成骨細(xì)胞向陷窩中分泌類骨質(zhì)引起的骨形成與破骨細(xì)胞的酸化效應(yīng)、蛋白水解酶引起的骨吸收處于一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡中[6]。成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的相對數(shù)量及工作效率共同決定骨量和骨代謝[7-8]。然而，參與骨形成與骨吸收的相關(guān)細(xì)胞因子會(huì)因年齡增長、不良生活習(xí)慣、遺傳、體質(zhì)量指數(shù)的改變而發(fā)生變動(dòng)，最終使破骨細(xì)胞活力大于成骨細(xì)胞，進(jìn)而引發(fā)骨質(zhì)疏松癥[9-10]。

據(jù)統(tǒng)計(jì)，目前中國約有9 000 萬人患骨質(zhì)疏松癥，另有2 億多人骨量低于正常標(biāo)準(zhǔn)，存在患骨質(zhì)疏松癥的風(fēng)險(xiǎn)[11]。

通常，雌激素、降鈣素、雙膦酸鹽和他汀類等藥物是治療骨質(zhì)疏松癥的首選藥物，但長期使用此類藥物會(huì)引起多種不良反應(yīng)[12]。因此，當(dāng)前的首要任務(wù)便是尋找一種安全、有效的骨質(zhì)疏松癥治療方法。

鋅是骨骼生長和骨形成中的重要營養(yǎng)因子。有研究表明，鋅元素在體內(nèi)可以增強(qiáng)大腿股骨的骨質(zhì)量，提高骨硬度和生長板活性，促進(jìn)成骨細(xì)胞的骨形成和礦化[13-15]，

抑制破骨細(xì)胞的骨吸收[16-17]，而鋅缺乏會(huì)抑制細(xì)胞外基質(zhì)的礦化和延遲骨形成[18]。無機(jī)鋅不穩(wěn)定、吸收率低，不適合長期攝入，而鋅螯合肽可以有效避免上述一系列缺點(diǎn)。與硫酸鋅相比，鋅螯合肽對礦物質(zhì)的生物利用率具有更好的作用，它通過載體介導(dǎo)的方式來維持礦物質(zhì)的可溶性并提高其吸收能力[19]。因此，探討鋅螯合肽對骨質(zhì)疏松癥的治療效果具有重要意義。

本研究選用珍珠貝外套膜為原料，制備珍珠貝外套膜膠原蛋白肽（pearl oyster mantle collagen peptide，POM-CP）及其鋅螯合物（zinc-chelating pearl oyster mantle collagen peptide，POMCP-Zn），探討POM-CP和POMCP-Zn對MC3T3-E1成骨細(xì)胞的增殖和分化的影響，為今后進(jìn)一步利用水產(chǎn)蛋白資源以及生產(chǎn)治療骨質(zhì)疏松癥的功能性食品提供新途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

馬氏珍珠貝由海南泉溢食品有限公司提供；小鼠前成骨細(xì)胞MC3T3-E1由上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源典藏中心提供。

α-MEM培養(yǎng)基、胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）、

磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）、青霉素、鏈霉素、0.25%胰酶-乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）（均為細(xì)胞培養(yǎng)級） 美國Gibco公司；噻唑藍(lán)（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、β-甘油磷酸鈉、抗壞血酸、茜素紅、氯化十六烷基吡啶（均為細(xì)胞培養(yǎng)級）、TritonX-100（分析純）

美國Sigma公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒 碧云天生物技術(shù)研究所；小鼠Ⅰ型膠原蛋白（collagen type Ⅰ，COLⅠ）、骨鈣素（osteocalcin，OCN）酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒 武漢伊萊瑞特生物科技有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

TENSOR27傅里葉變換紅外光譜（fourier transform infrared spectroscopy，F(xiàn)TIR）儀 德國Bruker公司；SMP7多功能酶標(biāo)儀、TC10細(xì)胞計(jì)數(shù)器 美國伯樂公司；

Z326K低溫離心機(jī) 德國Hermle公司；SW-CJ-2D雙人單面凈化工作臺(tái) 蘇州凈化設(shè)備有限公司；TV-1900雙光束紫外-可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；MCO-175二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱 日本Sanyo

公司；CKX 41SF倒置顯微鏡 日本Olympus公司。

1.3 方法

1.3.1 POM-CP和POMCP-Zn的制備

珍珠貝外套膜膠原蛋白的提取參照Shen等[2]的方法，并稍作修改。低溫下將外套膜去雜后，在4 ℃條件下用0.1 mol/L的NaOH浸泡48 h，每隔8 h換一次浸泡液，然后用去離子水沖洗至中性；隨后將外套膜與水混合

（1∶8，V/V），于95 ℃條件下熱提2 h，浸提液冷凍干燥后備用。所得膠原蛋白按照質(zhì)量濃度10 mg/mL溶于去離子水中，用0.5 mol/L的NaOH調(diào)節(jié)pH值至8.0，添加酶活力單位為4 200 U/g膠原蛋白的胰蛋白酶，在50 ℃、120 r/min搖床中酶解5 h，之后沸水浴加熱10 min終止酶解反應(yīng)，酶解液冷凍干燥后制得POM-CP，隨后采用高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法測定POM-CP的分子質(zhì)量。

POMCP-Zn的制備參照J(rèn)iang Liangping等[20]的方法，并稍作修改。將1 mL質(zhì)量濃度為100 mg/mL（0.734 mol/L）

的硫酸鋅溶液添加到5 mL蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度為30 mg/mL的POM-CP中；調(diào)節(jié)pH值至6.0，將混合物置于45 ℃恒溫振蕩搖床中反應(yīng)30 min；添加純乙醇，使得乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到80%后，室溫靜置30 min，于8 000×g條件下離心15 min，去上清液，然后用純乙醇反復(fù)沖洗沉淀物至無游離鋅離子檢出（雙硫腙用作指示劑）；收集沉淀物干燥后保存，采用原子吸收光譜法測定螯合物中鋅的含量[21]。

1.3.2 珍珠貝外套膜膠原蛋白的紫外光譜分析

取適量凍干后的珍珠貝外套膜膠原蛋白，配制成質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL的水溶液，用蒸餾水做空白調(diào)零，在190～400 nm波長范圍內(nèi)對珍珠貝外套膜膠原蛋白溶液進(jìn)行紫外掃描，記錄不同波長下溶液的吸光度。

1.3.3 珍珠貝外套膜膠原蛋白的氨基酸組成分析

將珍珠貝外套膜膠原蛋白用6 mol/L的HCl浸泡于密封消化管中，110 ℃條件下減壓處理，隨后用HPLC儀進(jìn)行測定。氨基酸含量表示為每1 000 個(gè)氨基酸殘基中的殘基數(shù)。

1.3.4 POM-CP和POMCP-Zn的FTIR分析

取適量干燥后的POM-CP和POMCP-Zn分別與干燥的20 mg溴化鉀一起放入瑪瑙研缽中，充分研磨、壓片，最終為透明薄片，然后在4 000～500 cm-1波數(shù)范圍內(nèi)進(jìn)行紅外掃描，采用自動(dòng)信息采集器收集信號(hào)。

1.3.5 細(xì)胞培養(yǎng)

小鼠前成骨細(xì)胞MC3T3-E1培養(yǎng)于含有10% FBS和100 U/mL青霉素和鏈霉素的α-MEM培養(yǎng)基中，于37 ℃、5%二氧化碳的濕潤培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在細(xì)胞融合度達(dá)到90%時(shí)，采用0.25%胰酶-EDTA消化后進(jìn)行細(xì)胞傳代。

1.3.6 細(xì)胞增殖性測定

取對數(shù)生長期的MC3T3-E1細(xì)胞，利用細(xì)胞計(jì)數(shù)器將細(xì)胞濃度調(diào)整為1.5×104 個(gè)/mL，之后每孔100 μL接種于96孔板；于二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 d后，棄去原培養(yǎng)液，換用含有不同質(zhì)量濃度樣品（POM-CP分別為0、50、100、200、300、400 μg/mL；POMCP-Zn分別為0、1、10、25、50、100 μg/mL）的生長完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)2 d。

細(xì)胞增殖性測定：每孔添加20 μL的MTT，培養(yǎng)4 h，隨后棄去培養(yǎng)基，每孔添加150 μL的DMSO，充分溶解生成的藍(lán)紫色甲瓚結(jié)晶，輕微振蕩10 min后，利用酶標(biāo)儀在490 nm波長處測定每孔的吸光度（A）。細(xì)胞增殖率按照下式計(jì)算。

1.3.7 細(xì)胞堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）活性測定

取對數(shù)生長期的MC3T3-E1細(xì)胞，利用細(xì)胞計(jì)數(shù)器將細(xì)胞濃度調(diào)整為2.0×104 個(gè)/mL，之后每孔1 mL接種于24孔板；于二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 d后，分別用含0、50、100、200、300、400 μg/mL的POM-CP和0、1、10、25、50、100 μg/mL的POMCP-Zn的分化培養(yǎng)基（其中包含10 mmol/L的β-甘油磷酸鈉和50 μg/mL的抗壞血酸）干預(yù)7 d，每2 d更換一次分化培養(yǎng)基；培養(yǎng)結(jié)束后棄去培養(yǎng)液，細(xì)胞層用預(yù)冷的PBS清洗2 次，隨后每孔加入200 μL細(xì)胞裂解液（1% TritonX-100），于4 ℃條件下裂解30 min；裂解物于4 ℃、12 000×g條件下離心5 min，取上清，采用對硝基苯磷酸酯（p-nitrophenylphosphate，p-NPP）法檢測ALP含量，BCA試劑盒測定其蛋白質(zhì)含量。ALP活性用每克蛋白質(zhì)釋放的酶的活力來表示。

1.3.8 細(xì)胞COLⅠ和OCN分泌量測定

取對數(shù)生長期的MC3T3-E1細(xì)胞，利用細(xì)胞計(jì)數(shù)器將細(xì)胞濃度調(diào)整為2.0×104 個(gè)/mL，之后每孔1 mL接種于24孔板；于二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 d后，用含0、10、25、50、100 μg/mL POMCP-Zn的分化完全培養(yǎng)基（其中包含10 mmol/L的β-甘油磷酸鈉和50 μg/mL的抗壞血酸）干預(yù)7 d和14 d，每2 d更換一次分化培養(yǎng)基；培養(yǎng)結(jié)束后，收集培養(yǎng)液，參照ELISA試劑盒法檢測COLⅠ和OCN的分泌量。

1.3.9 細(xì)胞礦化結(jié)節(jié)測定

取對數(shù)生長期的MC3T3-E1細(xì)胞，利用細(xì)胞計(jì)數(shù)器將細(xì)胞濃度調(diào)整為2.0×104 個(gè)/mL，之后每孔1 mL接種于24孔板；于二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 d后，用含0、50、100 μg/mL POMCP-Zn的分化完全培養(yǎng)基（其中包含10 mmol/L的β-甘油磷酸鈉和50 μg/mL的抗壞血酸）干預(yù)21 d，每2 d更換一次分化培養(yǎng)基；培養(yǎng)結(jié)束后將細(xì)胞用4%中性甲醛固定15 min，1%茜素紅-Tris溶液染色30 min，去離子水清洗后，于倒置顯微鏡下觀察并拍照。

半定量檢測細(xì)胞礦化程度：加入100 mmol/L的氯化十六烷基吡啶溶解細(xì)胞中的茜素紅，利用酶標(biāo)儀在570 nm波長處測定每孔的吸光度。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)均表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。采用SPSS Statistics 19.0軟件分析數(shù)據(jù)間的差異顯著性，使用Origin 8.0軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 珍珠貝外套膜膠原蛋白的紫外光譜分析結(jié)果

大多數(shù)蛋白質(zhì)在280 nm波長附近有很強(qiáng)的紫外吸收，這是由于蛋白質(zhì)中含有的色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸分別在280、275、257 nm波長處有紫外吸收峰，而膠原蛋白中不含色氨酸，苯丙氨酸和酪氨酸含量也很低，因此純膠原蛋白溶液的紫外光譜掃描特征應(yīng)該是在250～290 nm波長范圍內(nèi)基本無吸收峰，同時(shí)在230 nm波長以下有強(qiáng)吸收[22]。

由圖1可知，珍珠貝外套膜膠原蛋白在204 nm波長處有最大吸收峰，而在280 nm波長附近無吸收峰，符合膠原蛋白的紫外吸收特征。

2.2 珍珠貝外套膜膠原蛋白的氨基酸組成

由表1可知：珍珠貝外套膜膠原蛋白的所有氨基酸中含量最多的是甘氨酸，約占氨基酸總量的30%；脯氨酸和羥脯氨酸的含量約占氨基酸總量的20%，具有膠原蛋白特有的性質(zhì)；此外，珍珠貝外套膜膠原蛋白含有較高含量的谷氨酸、天冬氨酸、組氨酸和亮氨酸。研究表明，金屬螯合肽通常由谷氨酸、天冬氨酸、組氨酸和亮氨酸等組成[23-25]。

本研究以珍珠貝外套膜為材料制備POM-CP和POMCP-Zn，HPLC法測得POM-CP的分子質(zhì)量主要分布在500～10 000 Da之間，原子吸收光譜法測得螯合物中鋅的含量為5.82×104 mg/kg，進(jìn)而評價(jià)POM-CP和POMCP-Zn

對成骨細(xì)胞骨形成的作用。

2.3 POM-CP和POMCP-Zn的FTIR分析

由圖2可知，POM-CP在1 655 cm-1處具有由于羰基伸縮振動(dòng)和氨基彎曲振動(dòng)所引起的特征吸收峰酰胺I帶，然而，在POM-CP螯合鋅離子后，該峰值轉(zhuǎn)移到了較低的頻率處，在POMCP-Zn中為1 639 cm-1處。這表明膠原蛋白肽中的羰基螯合了鋅離子。此外，2 個(gè)較為明顯的振動(dòng)頻率也發(fā)生了改變，在POMCP-Zn中羧基峰值從POM-CP的1 404 cm-1移動(dòng)到了較低頻率1 384 cm-1處，羥基峰值從POM-CP的3 408 cm-1移到了較高頻率3 446 cm-1處。這些結(jié)果表明POM-CP主要通過肽鍵中的羰基氧、羧基氧和羥基氧與鋅離子發(fā)生螯合反應(yīng)。

由圖3可知，與空白對照組相比，質(zhì)量濃度為50～400 μg/mL的POM-CP作用于MC3T3-E1細(xì)胞2 d后不能顯著促進(jìn)細(xì)胞的增殖，這與文獻(xiàn)報(bào)道的牛、魚、豬的膠原蛋白肽[26-27]在作用于MC3T3-E1細(xì)胞2 d時(shí)也不能影響成骨細(xì)胞的增殖相符合。與空白對照組相比，質(zhì)量濃度為50 μg/mL的POMCP-Zn作用于MC3T3-E1細(xì)胞2 d時(shí)，細(xì)胞增殖率顯著提高至126.93%。前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，不同劑量（0.1、1、5、10、15 μmol/L）的鋅離子對成骨細(xì)胞的增殖促進(jìn)作用不同，其中1 μmol/L鋅離子的促進(jìn)效果最佳，細(xì)胞增殖率提高至112.98%，但同時(shí)發(fā)現(xiàn)質(zhì)量濃度繼續(xù)升高后，鋅離子的促進(jìn)作用反而降低，由此可知，POMCP-Zn對成骨細(xì)胞的增殖促進(jìn)作用明顯優(yōu)于鋅離子。

2.5 POM-CP和POMCP-Zn對MC3T3-E1細(xì)胞ALP活性的影響

ALP可以降解鈣化抑制因子，促使基質(zhì)釋放磷酸根離子，進(jìn)而增加局部鈣離子及磷酸根離子的濃度，促進(jìn)基質(zhì)礦化階段鈣化結(jié)晶的形成，因此其對成骨細(xì)胞的成熟和鈣化有顯著作用，是成骨細(xì)胞分化的標(biāo)志性基因[28-29]。

由圖4可知，當(dāng)POM-CP質(zhì)量濃度為300、400 μg/mL時(shí)，MC3T3-E1細(xì)胞的ALP活性分別顯著提高至128%和131%，但與空白對照組相比，較低質(zhì)量濃度（50～200 μg/mL）的POM-CP不能顯著提高細(xì)胞的ALP活性。而POMCP-Zn展現(xiàn)出較強(qiáng)的促進(jìn)ALP活性的作用。與空白對照組相比，較低質(zhì)量濃度的POMCP-Zn對促進(jìn)ALP的活性呈劑量依賴性，50 μg/mL的POMCP-Zn對ALP活性的促進(jìn)作用最大，達(dá)162%，隨后有所降低（質(zhì)量濃度100 μg/mL）。此外，前期研究發(fā)現(xiàn)，與空白對照組相比，濃度為1 μmol/L的鋅離子處理組MC3T3-E1細(xì)胞的ALP活性提高至108.34%，由此可知，鋅離子不能顯著促進(jìn)成骨細(xì)胞的ALP活性，但肽-鋅螯合物處理可以顯著促進(jìn)細(xì)胞的ALP活性。

上述結(jié)果表明，POM-CP不能促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖，而質(zhì)量濃度為10～100 μg/mL的POMCP-Zn對MC3T3-E1細(xì)胞的增殖具有顯著促進(jìn)作用。另外，在分化階段，與鋅離子和POM-CP相比，POMCP-Zn對MC3T3-E1細(xì)胞ALP活性的提高有更好的效果。因此，本研究選擇POMCP-Zn進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

2.6 POMCP-Zn對MC3T3-E1細(xì)胞COLⅠ和OCN分泌量的影響

OCN是成骨細(xì)胞分化晚期的標(biāo)志，是骨基質(zhì)中含量最豐富的非膠原蛋白，對骨外基質(zhì)中羥基磷灰石的結(jié)合和沉積具有重要作用。由圖6可知，質(zhì)量濃度為50 μg/mL的POMCP-Zn對OCN分泌的促進(jìn)作用最強(qiáng)。干預(yù)14 d時(shí)，與空白對照組相比，50 μg/mL的POMCP-Zn處理組的OCN含量提高了239%。

上述結(jié)果進(jìn)一步表明，POMCP-Zn能夠促進(jìn)骨膠原和非膠原蛋白的合成，從而上調(diào)成骨細(xì)胞分化。

2.7 POMCP-Zn對MC3T3-E1細(xì)胞礦化結(jié)節(jié)的影響

在細(xì)胞分化晚期，鈣、磷等離子不斷沉積，骨基質(zhì)也逐步礦化成熟，形成骨礦化鈣結(jié)節(jié)[31]。本研究采用茜素紅染色來評價(jià)細(xì)胞外基質(zhì)鈣沉積物，進(jìn)而探討POMCP-Zn

對成骨細(xì)胞礦化結(jié)節(jié)的影響。由圖7可知，用質(zhì)量濃度為25、50 μg/mL的POMCP-Zn處理21 d后，MC3T3-E1細(xì)胞的鈣結(jié)節(jié)數(shù)目顯著多于空白對照組。半定量實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與空白對照組相比，50 μg/mL的POMCP-Zn顯著提高了成骨細(xì)胞的礦化能力（提高48.78%）。

3 結(jié) 論

本研究采用熱水法提取珍珠貝外套膜膠原蛋白，通過紫外光譜掃描、氨基酸組成分析鑒定證明其符合膠原蛋白的基本性質(zhì)；隨后采用胰蛋白酶酶解得到POM-CP，

將其與鋅離子螯合，得到肽鋅螯合物POMCP-Zn；通過FTIR圖譜分析得到，POM-CP主要通過肽鍵中的羰基氧、羧基氧和羥基氧與鋅離子螯合；MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，用質(zhì)量濃度為0～400 μg/mL的POM-CP處理MC3T3-E1細(xì)胞2 d，對其增殖性沒有顯著影響，而POMCP-Zn具有顯著促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞增殖的作用，并呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系；與空白對照組相比，50 μg/mL的POMCP-Zn對MC3T3-E1細(xì)胞的增殖率提高至126.93%；同時(shí)，POMCP-Zn也可以提高成骨細(xì)胞分化階段的ALP活性、COLⅠ和OCN分泌量，促進(jìn)成骨細(xì)胞礦化階段骨結(jié)節(jié)的形成，推測與其螯合的鋅離子有關(guān)。

綜上所述，POM-CP對MC3T3-E1細(xì)胞的分化具有一定的作用，而POMCP-Zn能夠促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖、分化及礦化，進(jìn)而引起骨再生，POMCP-Zn有望成為治療骨質(zhì)疏松癥的潛在功能性食品。

參考文獻(xiàn)：

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