摘 要：建立高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時檢測魚肉中5 種頭孢類抗生素（頭孢氨芐、頭孢洛寧、頭孢匹林、頭孢喹肟和頭孢唑啉）殘留的檢測方法。魚肉基質(zhì)經(jīng)乙腈提取，Prime HLB（6 mL，200 mg）固相萃取小柱凈化。采用AB-4500 Qtrap液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀，Accucore C18 RP-MS色譜柱（2.1 mm×100 mm，2.7 μm），以乙腈和體積分數(shù)0.1%的乙酸水溶液為流動相進行梯度洗脫，流速0.4 mL/min，柱溫30 ℃。采用電噴霧離子源，正離子掃描，多反應監(jiān)測模式，外標法定量。結(jié)果表明：5 種頭孢類藥物在0～75 μg/kg范圍內(nèi)線性良好，且在8 min內(nèi)完全分離；5 種頭孢類藥物的檢出限均為0.5 μg/kg，定量限為2.0 μg/kg；在10、25、40 μg/kg加標水平下，5 種頭孢類藥物的批內(nèi)平均加標回收率為81.0%～111.0%，相對標準偏差為0.41%～10.50%，批間平均加標回收率為84.7%～106.0%，相對標準偏差為0.88%～8.71%。

關(guān)鍵詞：魚肉；高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法；頭孢類藥物

Abstract： A high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry （HPLC-MS/MS） method was developed for the determination of five cephalosporins in fish （cephalexin， cefalonium， cephapirin， cefquinome and cefazolin）. Samples were extracted with acetonitrile and then the extract was cleaned up with a Prime HLB solid-phase extraction （SPE） cartridge prior to being analyzed using an AB-4500 Qtrap LC-MS/MS system. The chromatographic separation was performed on an Accucore C18 RP-MS column （2.1 mm × 100 mm， 2.7 μm） by gradient elution using a mobile phase made up of acetonitrile and 0.1% acetic acid in water at a 0.4 mL/min flow rate. The column temperature was set at 30 ℃. The analytes were detected using multiple-reaction monitoring （MRM） in the positive electrospray ionization mode and quantified by the external standard method. Complete separation was achieved within 8 min. The calibration curves for all five analytes were linear over the concentration range from 0 to 75 μg/kg. The limit of detection for all analytes was 0.5 μg/kg， and the limit of quantification was 2.0 μg/kg. At spiked levels of 10， 25 and 40 μg/kg， the intra-assay recoveries of all five cephalosporins were 81.0%–111.0% with relative standard deviation （RSD） of 0.41%–10.50%， and the inter-assay recoveries were 84.7%–106.0% with RSD of 0.88%–8.71%.

Keywords： fish； high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry； cephalosporins

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-201802005

中圖分類號：O657.63 文獻標志碼：A 文章編號：1001-8123（2018）02-0028-05

引文格式：

貝亦江， 王揚， 朱凝瑜， 等. 高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測魚肉中5 種頭孢類藥物[J]. 肉類研究， 2018， 32（2）： 28-32. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-201802005. http：//www.rlyj.pub

BEI Yijiang， WANG Yang， ZHU Ningyu， et al. Simultaneous determination of 5 cephalosporins in fish by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J]. Meat Research， 2018， 32（2）： 28-32. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-201802005. http：//www.rlyj.pub

頭孢類藥物是以天然頭孢菌素C作為原料，經(jīng)半合成得到的一類β-內(nèi)酰胺類抗生素[1]，對細菌表現(xiàn)出廣譜抗菌活性[2]，被廣泛應用于臨床和畜牧漁業(yè)[3]。隨著我國水產(chǎn)養(yǎng)殖集約化程度的提高，養(yǎng)殖用藥增加，往往導致抗生素的濫用[3]。頭孢類藥物可以引起多種酶、血膽紅素含量的升高，引發(fā)造血系統(tǒng)功能障礙[4-6]。

歐盟、美國和日本等國家及地區(qū)對乳類、肉類及動物內(nèi)臟中頭孢類抗生素的殘留量均有嚴格規(guī)定[7-8]。我國目前只明確規(guī)定了3 種頭孢類藥物的最高殘留限量[9]，分別為頭孢氨芐0.2 mg/kg、頭孢喹諾0.05 mg/kg、頭孢噻呋1.0 mg/kg。

國內(nèi)外對于頭孢類抗生素的檢測技術(shù)研究以畜禽肌肉、乳、血漿等樣品居多[10-20]，魚肉中的頭孢類藥物檢測往往不作為重點，且鮮有報道。國內(nèi)外報道中頭孢類藥物的主要檢測技術(shù)有微生物法、酶聯(lián)免疫法、毛細管電泳法和色譜法[21-22]，一般以液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（high performance liquid chromatography-tandem mass spetrometry，LC-MS/MS）法為仲裁方法。目前，國家標準分析方法中提供了河豚魚和鰻魚中5 種頭孢類物質(zhì)殘留量的檢測方法[23]，但該方法缺少對其他魚類的適用性，且預處理過程試劑用量較大，對樣品的凈化程度不夠，基質(zhì)效應較大，也容易造成環(huán)境污染。本研究以浙江省主要養(yǎng)殖和捕撈區(qū)域的烏鱧、草魚、鰻魚3 種代表性淡水海魚為研究對象，建立廣泛適用于魚肉基質(zhì)中頭孢類藥物殘留檢測的LC-MS/MS方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

池塘養(yǎng)殖烏鱧，2017年5月取自德清縣禹越鎮(zhèn)百畝漾生態(tài)休閑農(nóng)莊，體長22.5～32.5 cm，體質(zhì)量1.25～2.36 kg；池塘養(yǎng)殖草魚，2017年5月取自浙江恒澤生態(tài)農(nóng)業(yè)科技有限公司，體長27.5～29.4 cm，體質(zhì)量0.98～1.16 kg；海洋捕撈鰻魚，2017年4月取自溫州南麂島海域，體長43.3～46.1 cm，體質(zhì)量2.58～3.34 kg。每種魚類樣品各6 批次，每批次6 尾，去皮、去骨后切成0.5 cm見方的肉塊，置于攪拌勻漿機中攪成糜狀，備用。

頭孢氨芐（純度99.0%）、頭孢喹肟（純度80.1%）、頭孢洛寧（純度95.0%）、頭孢匹林（純度100.0%）、頭孢唑啉（純度96.6%）標準品 德國Dr.Ehrenstorfer公司；乙腈、甲醇、甲酸和正己烷（均為色譜純） 美國Tedia公司；實驗用水均為超純水。

1.2 儀器與設備

AB-4500 Qtrap液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀 美國AB Sciex公司；Accucore C18 RP-MS色譜柱（2.1 mm×100 mm，2.7 μm） 美國Thermo Fisher公司；Oasis Prime HLB柱（6 mL，200 mg） 美國Waters公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

稱取2.5 g肉糜樣品，加入提取溶劑，渦旋振蕩/超聲15 min，8 000 r/min條件下離心5 min，取上清液。其中，分別選擇乙腈、乙腈水溶液（80∶20，V/V）、甲醇和甲醇水溶液（80∶20，V/V）作為提取溶劑，根據(jù)提取效果選擇合適的提取溶劑。

將Prime HLB小柱（6 mL，200 mg）用3 mL乙腈潤濕后上樣，樣品提取液收集至離心管；氮吹至干，加入2 mL水復溶后振蕩1 min，可根據(jù)樣品性狀有選擇地加入正己烷除脂；將2 mL復溶后的溶液轉(zhuǎn)移至高速冷凍離心機，12 000 r/min條件下離心10 min，過0.22 μm濾膜，待測。

1.3.2 色譜條件

色譜柱：Accucore C18 RP-MS（2.1 mm×100 mm，2.7 μm）；乙腈為流動相B，梯度洗脫程序如表1所示；流速0.4 mL/min，進樣體積5 μL，色譜柱溫度30 ℃。

其中，分別選擇體積分數(shù)0.1%的乙酸水溶液、純水及體積分數(shù)0.1%的乙酸水溶液中加入5 mmol/L乙酸銨作為流動相A，根據(jù)目標化合物的分離效果選擇合適的流動相。

1.3.3 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源（electrospray ionization，ESI）正離子模式（ESI+）；多反應監(jiān)測（multi reaction monitor，MRM）；電噴霧電壓5 500 V，聚焦電壓300 V，去簇電壓55 V，碰撞室出口電壓20 V；氣化溫度525 ℃。MRM參數(shù)如表2所示。

1.3.4 基質(zhì)標準曲線的繪制

用水配制質(zhì)量濃度為100 μg/mL的標準儲備液，4 ℃貯存，根據(jù)需要稀釋為適當質(zhì)量濃度的標準工作液。

采用外標法定量，因此需繪制基質(zhì)標準曲線。將陰性魚糜樣品基質(zhì)按照1.3.1節(jié)中的方法處理，待氮吹至提取液體積為5 mL左右時加入5 種標準物質(zhì)，使其質(zhì)量濃度均分別為0、10、25、50、75 μg/L，繼續(xù)氮吹至干后，復溶、冷凍、離心、過濾。以基質(zhì)標準工作溶液中5 種頭孢類藥物的質(zhì)量濃度為橫坐標，對應定量離子的色譜峰面積為縱坐標繪制標準曲線。

1.3.5 目標化合物的定性和定量

使用Sciex-Analyst軟件，根據(jù)MRM參數(shù)掃描對5 種頭孢類藥物進行定性，試樣中被測組分的含量按照下式計算。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2016軟件對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計、處理及繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 實驗條件的優(yōu)化

2.1.1 提取溶劑的選擇

由圖1可知：乙腈水溶液對各組分的提取率均較高，但提取液中的水分去除較為繁瑣且費時，影響檢測結(jié)果的精密度和檢測效率；甲醇和甲醇水溶液對頭孢喹肟和頭孢氨芐的提取率不高；純乙腈對各組分的提取率均相對較高，而且凈化后濃縮方便快捷，目前國內(nèi)外文獻報道中動物肌肉組織中頭孢類藥物的提取溶劑也以乙腈或乙腈水溶液為主[24-30]，因此本研究選擇純乙腈作為提取溶劑。

2.1.2 固相萃取柱的選擇

相較于GB/T 22960—2008《河豚魚和鰻魚中頭孢唑林、頭孢匹林、頭孢氨芐、頭孢洛寧、頭孢喹肟殘留量的測定 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》[23]中采用的大體積提取液加旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)的凈化方式，本研究采用小體積提取液加Prime HLB固相萃取的方式進行樣品凈化。Prime HLB柱對于基質(zhì)中的蛋白質(zhì)、脂類等雜質(zhì)具有明顯的凈化作用[24]，且相較于傳統(tǒng)的固相萃取柱，Prime HLB柱不需要經(jīng)過“活化-上樣-淋洗-洗脫”這一過程，可以直接將提取液過柱后收集待用，大大縮短了過柱時間，提高了檢測效率，與其他文獻報道中的結(jié)論相符[26]。

對于脂類含量較高的基質(zhì)，經(jīng)Prime HLB柱凈化的樣品可以進一步加入正己烷除脂，充分振蕩、離心后，棄去正己烷層，并將提取液冷凍（4 ℃）離心。實驗表明，在12 000 r/min條件下，至少需要離心10 min，使得蛋白質(zhì)在低溫條件下迅速絮集、下沉，進一步提高樣品提取液的純度，減少基質(zhì)效應。

2.1.3 流動相A的選擇

由圖2～4可知：體積分數(shù)0.1%的乙酸水溶液作為流動相A時，分離得到的色譜峰峰型良好，信號強度相對均衡，不會出現(xiàn)不同物質(zhì)間信號強度差異太大的情況，適合5 種頭孢類藥物的分離；體積分數(shù)0.1%的乙酸水溶液中加入5 mmol/L乙酸銨作為流動相A時，對藥物信號強度的抑制較強；純水作為流動相A時，不同藥物間的信號強度差異較大，容易造成定量不準確。因此選擇體積分數(shù)0.1%的乙酸水溶液作為流動相A。

2.2 5 種頭孢類藥物的MRM總離子流色譜圖

5 種頭孢類藥物的MRM總離子流色譜圖如圖5所示。

2.3 線性范圍、檢出限和定量限

由表3可知，5 種頭孢類藥物在0～75 μg/kg范圍內(nèi)線性良好。

在本研究的實驗條件下，對添加較低量的5 種頭孢類藥物的空白魚肉樣品進行測定，以3 倍信噪比

（RS/N=3）和10 倍信噪比（RS/N=10）確定出5 種頭孢類藥物的檢出限和定量限分別為0.5 μg/kg和2.0 μg/kg。

2.4 準確度、精密度及重復性

以10、25、40 μg/kg 3 個水平向樣品中加入標準物質(zhì)，樣品共6 批次，每個批次設6 個平行樣。由表4可知：批內(nèi)平均加標回收率為81.0%～111.0%，相對標準偏差為0.41%～10.50%；批間平均加標回收率為84.7%～106.0%，相對標準偏差為0.88%～8.71%。經(jīng)差異顯著性分析，3 種魚肉基質(zhì)中3 個加標水平的5 種頭孢類藥物的批內(nèi)和批間回收率均無顯著性差異。

2.5 實際樣品測定

從本中心實驗室各類樣品中抽取50 批次來自全省各地周邊海域及養(yǎng)殖場的海魚和淡水魚作為實際樣品，其中草魚11 批次、黃顙魚10 批次、鱖魚5 批次、鯽魚10 批次、大黃魚5 批次、烏鱧4 批次、鰻魚5 批次，采用本研究確定的方法進行測定，同時進行質(zhì)量控制加標回收實驗。結(jié)果表明，50 批次樣品均未檢出上述5 種頭孢類藥物殘留。

2.6 與國標方法的比較

與國標方法對比，本研究所確定方法的優(yōu)勢體現(xiàn)在以下幾方面：1）提取溶劑體積由35 mL減少至8 mL，節(jié)約了有機試劑用量，減少了對環(huán)境的污染；2）樣品凈化方式由液-液萃取改為固相萃取，能更有效地去除雜質(zhì)，減少基質(zhì)效應；3）基質(zhì)種類由河豚魚、鰻魚增加至養(yǎng)殖量更大、養(yǎng)殖范圍更廣的烏鱧、草魚和鰻魚，拓展了方法的應用范圍；4）質(zhì)譜進樣時間由15 min減少至8 min，提高了檢測效率。

3 結(jié) 論

本研究采用LC-MS/MS技術(shù)建立魚肉基質(zhì)中頭孢氨芐、頭孢喹肟、頭孢洛寧、頭孢唑啉和頭孢匹林5 種頭孢類藥物殘留量的檢測方法，通過繪制基質(zhì)標準曲線，發(fā)現(xiàn)方法準確度和精密度在頭孢類藥物痕量時仍然符合實驗要求。與現(xiàn)有國標方法相比，本研究確定的方法彌補了樣品基質(zhì)、方法普及度方面的不足，降低了檢出限和定量限，節(jié)約了試劑用量和預處理時間，滿足國內(nèi)外對于頭孢類藥物殘留的檢測要求。

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