DNA條形碼技術(shù)鑒別市售魚肉制品真?zhèn)?/h1>
2018-05-14 09:58石蕊寒
肉類研究 2018年2期
摘 要：以COΙ基因和16S rRNA基因作為魚類制品通用的DNA條形碼，對(duì)超市中采集的91 份冷凍魚肉樣品及經(jīng)過深加工的預(yù)包裝魚肉樣品進(jìn)行物種鑒定。結(jié)果表明：COΙ基因和16S rRNA基因均可用于魚類制品物種真?zhèn)蔚蔫b別；冷凍魚肉樣品和預(yù)包裝魚肉樣品與其商標(biāo)的符合率分別為83.54%和58.33%；市場(chǎng)中存在魚類制品商品標(biāo)簽標(biāo)示錯(cuò)誤、配料標(biāo)注不明確等問題，為相關(guān)部門對(duì)魚類制品的監(jiān)管提供了有力的技術(shù)支持。
關(guān)鍵詞：DNA條形碼；COI基因；16S rRNA基因；魚肉制品；真?zhèn)舞b別
Abstract： This study was conducted to identify the species origin of 91 samples of frozen fish products and highly processed， pre-packaged fish products collected from supermarkets using DNA barcoding technique based on homologous sequence analysis of the COI and 16S rRNA genes. The results confirmed that both COI and 16S rRNA gene sequencing were useful for species authentication of fish products. The species origin of 66 of 79 （83.54%） frozen fish products and 7 of 12 （58.33%） highly processed， pre-packaged fish products was consistent with the product claims， which indicated that some problems such as mislabeling and ambiguous ingredient designation of fish products existed in the fish market. This research can provide technical support for the supervisory authorities concerned .
Keywords： DNA barcoding； COI gene； 16S rRNA gene； fish products； authentication
DOI：10.7506/rlyj1001-8123-201802007
中圖分類號(hào)：TS254.7 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1001-8123（2018）02-0040-06
引文格式：
石蕊寒， 南匯珠， 丁紅田， 等. DNA條形碼技術(shù)鑒別市售魚肉制品真?zhèn)蝃J]. 肉類研究， 2018， 32（2）： 40-45. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-201802007. http：//www.rlyj.pub
SHI Ruihan， NAN Huizhu， DING Hongtian， et al. The authentication of commercial fish products using DNA barcoding technique[J]. Meat Research， 2018， 32（2）： 40-45. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-201802007. http：//www.rlyj.pub
隨著我國(guó)魚肉制品貿(mào)易的飛速發(fā)展和人民生活水平的日益提高，一些不法商家見利忘義，大肆地?fù)郊僭旒?，影響了?guó)內(nèi)外貿(mào)易的正常秩序，也損害了消費(fèi)者的身體健康和經(jīng)濟(jì)利益。超市作為零售終端，以其產(chǎn)品種類繁多、價(jià)格實(shí)惠及選擇性強(qiáng)等優(yōu)勢(shì)已成為消費(fèi)者采購(gòu)魚肉制品的主要渠道。超市中的魚肉制品通常分為鮮活類、冰鮮類、冷凍類及以魚肉為原料的深加工品等，由于受到保鮮、?；顥l件的限制，鮮活類、冰鮮類魚肉制品的種類與后2 種魚肉制品相比相對(duì)較少。冷凍魚肉制品多以分段、切片等形式銷售，以魚肉為原料的深加工品多指烤魚片、魚罐頭等，均難以通過外觀鑒定魚肉種類，給部分水產(chǎn)商創(chuàng)造了可乘之機(jī)，以“低價(jià)魚冒充高價(jià)魚”、深加工品“原材料摻假”等手段欺騙消費(fèi)者。近年來，油魚冒充鱈魚[1]、巴沙魚冒充龍利魚等報(bào)道屢見不鮮，對(duì)于這類摻假造假的判定不能依賴于傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)觀察，必須建立在準(zhǔn)確、可靠的食品物種鑒定基礎(chǔ)上[2]。
DNA條形碼（DNA barcoding）于2003年由Hebert等[3]
首次提出，即利用標(biāo)準(zhǔn)的、有足夠變異的、易擴(kuò)增且相對(duì)較短的DNA片段，根據(jù)物種種內(nèi)的特異性和種間的多樣性而創(chuàng)建的一種新的身份識(shí)別系統(tǒng)，能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)物種進(jìn)行快速、準(zhǔn)確識(shí)別和鑒定。該技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于動(dòng)植物制品真?zhèn)舞b別、瀕危動(dòng)植物保護(hù)以及生物多樣性研究等多個(gè)領(lǐng)域[4-6]。一般認(rèn)為線粒體細(xì)胞色素C氧化酶亞基Ι（cytochrome coxidase subunit I，COI）基因是魚類制品DNA條形碼研究較為理想的目的基因。劉守海等[7]發(fā)現(xiàn)通過對(duì)COI基因的分析鑒定并結(jié)合形態(tài)特征可以對(duì)仔稚魚的種類進(jìn)行鑒定。在肉類摻假等食品檢測(cè)領(lǐng)域，以COI基因?yàn)槟康幕虻腄NA條形碼技術(shù)憑借良好的檢測(cè)效果得到廣泛的研究與應(yīng)用，其首先被應(yīng)用于魚類制品檢測(cè)中[8]。Wong等[9]對(duì)北美部分超市及餐館采集的海產(chǎn)品樣品進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)25%的樣品存在錯(cuò)貼標(biāo)簽的問題。邱德義等[2]對(duì)16 份抽檢的魚肉、魚丸等水產(chǎn)制品進(jìn)行鑒定，結(jié)果表明，除1 份樣品未能成功進(jìn)行擴(kuò)增外，其余15 份順利完成種類來源鑒定的樣品合格率僅為68.75%。李新光等[10]對(duì)不同魚肉制品進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)20 種冷凍魚的鑒定結(jié)果與形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果一致，但是烤魚片樣品與其標(biāo)簽上所標(biāo)示的原料多數(shù)不符，部分烤魚片樣品中還可檢出月尾魚頭鲀。王敏等[11]研究發(fā)現(xiàn)，購(gòu)于深圳批發(fā)市場(chǎng)和超市中的77 份零售魚肉制品的標(biāo)簽錯(cuò)貼率高達(dá)36.36%，其中標(biāo)為“龍利魚”的商品均為低價(jià)的淡水魚。
除了COI基因，以核糖體基因?yàn)榇淼牟糠趾嘶蚝途€粒體基因亦可作為DNA條形碼使用，且已受到越來越多的關(guān)注[12]。韋健紅等[13]的研究表明，COI基因和16S rRNA基因均能將廣地龍與其他地龍或蚯蚓物種鑒別開來。陳文炳等[14]通過對(duì)16S rRNA基因的部分序列進(jìn)行分析和對(duì)比，篩選出可用于精確鑒定日本鰻、美洲鰻和歐洲鰻3 個(gè)物種的標(biāo)準(zhǔn)DNA條形碼。張永等[15]通過16s rRNA部分序列從分子水平對(duì)13 種石首魚科魚類的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系進(jìn)行研究，為其分類和系統(tǒng)進(jìn)化提供了科學(xué)依據(jù)。陳信忠等[16]測(cè)定了12 種觀賞魚的COI基因和16S rRNA基因，發(fā)現(xiàn)通過這2 種基因可以對(duì)亞洲龍魚、神仙魚等觀賞魚進(jìn)行鑒別，但無法鑒別慈鯛等形態(tài)相似的觀賞魚或青龍魚、黃尾龍魚等同一品種、不同品系的觀賞魚。目前，16S rRNA基因的應(yīng)用多集中在分類學(xué)方面[17-19]，但在食品檢測(cè)領(lǐng)域，特別是魚肉制品摻假方面的報(bào)道相對(duì)較少。
本研究選取COI基因和16S rRNA基因作為魚類制品通用的DNA條形碼，對(duì)從超市中采集的冷凍魚肉和預(yù)包裝魚肉樣品進(jìn)行鑒別，旨在考察利用這2 種基因鑒別魚肉制品的可行性，為保障魚類食品的質(zhì)量安全以及政府部門監(jiān)管提供技術(shù)支持。
1 材料與方法
1.1 材料與試劑
2016年5月—2017年9月期間從石家莊16 個(gè)超市中購(gòu)買魚肉樣品，共計(jì)104 份，其中鱈魚、龍利魚、巴沙魚、黃花魚等冷凍魚肉樣品83 份，烤魚片、魚罐頭等經(jīng)過深加工的預(yù)包裝魚肉樣品21 份。冷凍魚肉樣品置于
-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆?，預(yù)包裝魚肉樣品置于常溫條件下保存?zhèn)溆谩?/p>
Wizard? Genomic DNA Purification Kit、Wizard? Magnetic DNA Purification Systerm for Food試劑盒 美國(guó)
Promega公司；2×Taq PCR Mastermix、DNA Marker、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、GelRed染料 天根生化科技（北京）有限公司；DNA Ligation Kit、T-Vector pMD?19（Simple） 寶生物工程（大連）有限公司；
Trans1-T1 Phage Resistant Chemically Competent Cell
北京全式金生物技術(shù)有限公司。
1.2 儀器與設(shè)備
NanoDrop 2000C超微量分光光度計(jì) 美國(guó)Thermo Scientific公司；T-Gradient梯度PCR儀 德國(guó)Biometra公司；Fusion Fx5凝膠成像系統(tǒng) 法國(guó)Viber Lourmat
公司；DYY-7C電泳儀 北京六一生物科技有限公司。
1.3 方法
1.3.1 樣品處理
1.3.1.1 去油
對(duì)于魚罐頭、烤魚片等含油量較大的魚肉樣品，采用氯仿-甲醇法進(jìn)行去油前處理[20]。取適量樣品放入50 mL離心管中，超純水沖洗1～2 次，加入氯仿-甲醇水溶液（氯仿∶甲醇∶水=5∶10∶4，V/V），56 ℃孵育30 min，7 800 r/min條件下離心5 min，棄含油脂的液體。重復(fù)上述步驟清洗3～4 次后將樣品自然晾干，
-20 ℃保存?zhèn)溆?。冷凍魚肉樣品直接進(jìn)行研磨，不需要去油處理。
1.3.1.2 研磨
取適量已解凍魚肉樣品或已去油的預(yù)包裝魚肉樣品放入已滅菌的研缽內(nèi)，剪碎，加入液氮后用研磨杵研磨，將研磨后的樣品-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>
1.3.2 DNA提取和濃度測(cè)定
取100～200 mg研磨后的樣品，按照Wizard? Genomic DNA Purification Kit或Wizard? Magnetic DNA Purification Systerm for Food試劑盒所述方法提取DNA，立即使用或-20 ℃保存?zhèn)溆?。同時(shí)使用NanoDrop 2000C超微量分光光度計(jì)測(cè)定DNA質(zhì)量濃度，根據(jù)測(cè)定所得質(zhì)量濃度，將其稀釋為質(zhì)量濃度50～100 ng/μL。
1.3.3 PCR擴(kuò)增
COI和16S rRNA通用引物參照文獻(xiàn)[21-22]中的相關(guān)序列，如表1所示，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。
COI基因PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系：2×Taq PCR Mastermix 12.5 μL、引物終濃度0.05 μmol/L、DNA 2 μL，ddH2O補(bǔ)足至25 μL。反應(yīng)條件：95 ℃，2 min；94 ℃，30 s；52 ℃，40 s；72 ℃，1 min；35 個(gè)循環(huán)；72 ℃，10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，挑選擴(kuò)增條帶明顯且單一的產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序；或?qū)U(kuò)增陽性的PCR產(chǎn)物按照瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒說明進(jìn)行純化，回收片段連接pMD19-T載體，轉(zhuǎn)入Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)37 ℃過夜培養(yǎng)，挑取單個(gè)菌落于500 μL含有氨芐青霉素（終質(zhì)量濃度100 μg/mL）的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min搖床培養(yǎng)4～6 h，經(jīng)PCR檢測(cè)，挑選陽性克隆菌液200 μL進(jìn)行測(cè)序。
在使用COI基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增沒有出現(xiàn)擴(kuò)增條帶或擴(kuò)增條帶不理想時(shí)，使用16S rRNA基因進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)體系：2×Taq PCR Mastermix 12.5 μL、引物終濃度0.2 μmol/L、DNA 2 μL，ddH2O補(bǔ)足至25 μL。反應(yīng)條件：94 ℃，2 min；94 ℃，45 s；55 ℃，50 s；72 ℃，1 min；35 個(gè)循環(huán)；72 ℃，5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，挑選擴(kuò)增條帶明顯且單一的產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序。
1.3.4 序列比對(duì)
將測(cè)序成功的序列進(jìn)行拼接比對(duì)，在BOLD SYSTEMS（http：//www.boldsystems.org）或NCBI（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov）數(shù)據(jù)庫(kù)中對(duì)樣品的COI序列或16S rRNA序列進(jìn)行鑒定和相似度分析。
2 結(jié)果與分析
2.1 COI基因和16S rRNA基因的擴(kuò)增
由圖1可知，COI基因與16S rRNA基因引物2%瓊脂糖凝膠電泳的擴(kuò)增片段約為703 bp和615 bp，PCR產(chǎn)物的分子質(zhì)量與預(yù)期相符。
由表2可知，104 份魚肉樣品中共有91 份獲得測(cè)序結(jié)果。應(yīng)用COI或16S rRNA任一基因引物擴(kuò)增的樣品序列與BOLD SYSTEMS或NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)發(fā)現(xiàn)，序列相似度均在97%以上，匹配度高，表明COI和16S rRNA基因片段的擴(kuò)增和測(cè)序鑒定結(jié)果準(zhǔn)確可靠，這2 種基因均可有效鑒定魚肉樣品的種類。
2.2 冷凍魚樣品鑒定結(jié)果
2.2.1 冷凍鱈魚鑒定結(jié)果
由表3可知，20 份獨(dú)立包裝樣品中，1 份樣品名為“深海鱈魚片”，配料標(biāo)示為“鱈魚”，經(jīng)鑒定為Coryphaenoides acrolepis/Albatrossia pectoralis（粗麟突吻鱈/細(xì)鱗壯鱈）；1 份樣品名為“格陵蘭扁鱈魚”，配料標(biāo)示為Reinhardtius hippoglossoide（馬舌鰈），與鑒定結(jié)果一致；其余18 份樣品鑒定結(jié)果均與配料中描述的魚種類相符，學(xué)名一致。30 份以散裝稱重形式出售的樣品，其鑒定結(jié)果多為Coryphaenoides acrolepis/Albatrossia pectoralis（粗麟突吻鱈/細(xì)鱗壯鱈）或Gadus chalcogrammus（狹鱈），但1 份名為“鱈魚塊”和1 份名為“狹鱈魚柳”的樣品鑒定結(jié)果與其商標(biāo)不符，二者的鑒定結(jié)果分別為Decapterus maruadsi（藍(lán)圓鲹）和Lophius litulon（安康魚）。
2.2.2 冷凍龍利魚、巴沙魚鑒定結(jié)果
由表4可知，8 份龍利魚樣品和11 份巴沙魚樣品經(jīng)鑒定均為Pangasianodon hypophthalmus（低眼巨鯰），且相似度均大于99.00%。
2.2.3 冷凍黃花魚鑒定結(jié)果
由表5可知，9 份黃花魚樣品中，7 份樣品的商標(biāo)標(biāo)示與鑒定結(jié)果相符，2 份散裝稱質(zhì)量銷售的樣品鑒定結(jié)果與商標(biāo)不符，實(shí)為Chrysochir aureus（尖頭黃鰭牙?）。
2.2.4 其他冷凍魚鑒定結(jié)果
1 份商標(biāo)名為“二去北極冰魚”散裝稱質(zhì)量銷售的冷凍魚肉樣品經(jīng)16S rRNA基因鑒定為Patagonotothen ramsayi（拉氏南美南極魚），相似度為99%。
2.3 預(yù)包裝魚肉樣品鑒定結(jié)果
由表6可知，12 份預(yù)包裝魚肉樣品中，5 份樣品的商標(biāo)名稱與鑒定結(jié)果不符，其中3 份商標(biāo)名稱為“鱈魚片”的樣品經(jīng)鑒定為L(zhǎng)iparis（獅子魚屬），1 份商標(biāo)名稱為“馬面魚”的樣品和1 份商標(biāo)名稱為“鰩魚”的樣品經(jīng)鑒定分別為L(zhǎng)iparis mucosus（縱帶獅子魚）和Lophius litulon（安康魚）。
3 討 論
魚肉制品是人民日常飲食中不可或缺的組成部分，其肉質(zhì)細(xì)嫩鮮美、低脂肪、高蛋白、維生素及礦物質(zhì)含量豐富，易于消化，頗受消費(fèi)者喜愛。但是魚肉制品“摻假”“冒充”等問題會(huì)嚴(yán)重侵害消費(fèi)者的利益。本研究選取COI基因和16S rRNA基因作為DNA條形碼對(duì)冷凍魚肉樣品和經(jīng)過深加工的預(yù)包裝魚肉樣品進(jìn)行鑒定，共有91 份樣品獲得相應(yīng)序列，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，為上述2 種基因在魚類制品真?zhèn)舞b別中的應(yīng)用提供了科學(xué)依據(jù)和研究基礎(chǔ)。
本研究中鑒定冷凍魚肉樣品79 份，預(yù)包裝魚肉樣品12 份，鑒定結(jié)果與商標(biāo)的符合率分別為83.54%和58.33%。由上述鑒定結(jié)果可知，目前魚肉制品市場(chǎng)存在如下問題：1）散裝冷凍樣品商品名錯(cuò)標(biāo)現(xiàn)象嚴(yán)重，多以低價(jià)魚冒充高價(jià)魚。本研究中購(gòu)買獨(dú)立包裝冷凍樣品25 份，此種樣品包裝良好，配料標(biāo)注詳細(xì)，與鑒定結(jié)果相符。但散裝冷凍樣品包裝簡(jiǎn)易，摻假率可達(dá)24.07%（13/54）。散裝魚肉多以魚塊或去頭形式銷售，不易從外觀判定魚肉種類，例如頭尖牙大的Chrysochir aureus（尖頭黃鰭牙?）去頭后與Larimichthys polyactis（小黃魚）魚體相似，較難區(qū)分。此外，散裝魚肉類商品多數(shù)無相應(yīng)的產(chǎn)品介紹，僅簡(jiǎn)易標(biāo)記商品的俗名，無明確學(xué)名，甚至只標(biāo)明“魚塊”等名稱來混淆消費(fèi)者。本研究中“龍利魚”和“巴沙魚”樣品經(jīng)鑒定均為Pangasianodon hypophthalmus（低眼巨鯰）?！褒埨~”屬鰈形目、舌鰨科、舌鰨屬，是優(yōu)質(zhì)的海洋魚類[2，11]，而“巴沙魚”一般認(rèn)為屬于巨鯰屬，包括低眼巨鯰（茶魚）和博氏巨鯰（巴沙魚），是越南湄公河流域的淡水魚[23-25]。部分商家有意將低價(jià)的“巴沙魚”貼上“龍利魚”的標(biāo)簽，以獲得更大的利潤(rùn)。2）鱈魚市場(chǎng)命名混亂。香港食物安全中心發(fā)布的《有關(guān)識(shí)別及標(biāo)簽：油魚/
鱈魚的指引》中闡明：根據(jù)科學(xué)分類，“鱈魚”泛指鱈科的魚類及屬于鱈形目的相關(guān)品種，其中就包括市面上常見的“太平洋鱈”、“大西洋鱈”、“狹鱈”及“粗麟突吻鱈/細(xì)鱗壯鱈”[26]等。然而市場(chǎng)中的“鱈魚”常被用作多種非鱈形目魚類的俗稱，例如“銀鱈魚”和“白鱈魚”多指屬于裸蓋魚科鲉形目的Anoplopoma fimbria（裸蓋魚）及屬于南極魚科鱸形目的Dissostichus eleginoides（小鱗犬牙南極魚）和Dissostichus mawsoni（鱗頭犬牙南極魚）。針對(duì)上述情況，香港食物安全中心建議只有鱈形目魚類才可使用含有“鱈”字的俗名，就Anoplopoma fimbria、Dissostichu seleginoides、Dissostichus mawsoni 3 種魚類而言，在商標(biāo)、食物牌上同時(shí)標(biāo)明魚類學(xué)名和科學(xué)文獻(xiàn)或農(nóng)業(yè)組織建議的俗名時(shí)，才可繼續(xù)使用市場(chǎng)上“銀鱈魚”和“白鱈魚”的俗名。本研究中購(gòu)買的6 份“銀鱈魚”實(shí)為Dissostichus eleginoides（小鱗犬牙南極魚），“扁鱈魚”經(jīng)鑒定為Reinhardtius hippoglossoide（馬舌鰈），鑒定結(jié)果與其配料中標(biāo)注的學(xué)名相符，但是與商標(biāo)中的俗名“鱈魚”不符。這種命名混亂的現(xiàn)象近幾年多有報(bào)道，但目前我國(guó)尚未出臺(tái)針對(duì)鱈魚命名的標(biāo)準(zhǔn)或相應(yīng)的市場(chǎng)規(guī)范準(zhǔn)則[27]，
此亂象并未得到改善。3）預(yù)包裝魚肉產(chǎn)品配料不明或不符。我國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 7718—2011《預(yù)包裝食品標(biāo)簽通則》中規(guī)定，在食品標(biāo)簽中應(yīng)清晰地標(biāo)示反映食品真實(shí)屬性的專用名稱，不得使用易使消費(fèi)者誤解或混淆的常用名稱或通俗名稱[28]。但是市場(chǎng)上仍有許多烤魚片、魚罐頭產(chǎn)品配料上只標(biāo)明“深海魚”、“新鮮魚肉”、“鱈魚”等名稱，使消費(fèi)者難以判斷。李楠等[29]選取27 份烤魚片、魚干樣品進(jìn)行品種鑒定，發(fā)現(xiàn)13 份配料標(biāo)注為“鱈魚”“鰩魚”或“魚片”的樣品中可檢出河豚魚成分，部分河豚魚種含有劇毒物質(zhì)河豚毒素，對(duì)消費(fèi)者的身體健康有嚴(yán)重威脅。本研究中雖未檢出含有毒性的魚種，但是以Liparis（獅子魚屬）冒充鱈魚或馬面魚、以Lophius litulon（安康魚）冒充鰩魚等原材料造假、配料中標(biāo)注與商品名稱不符現(xiàn)象較為嚴(yán)重。
在關(guān)于肉類樣品鑒定的報(bào)道中多使用COI基因，
16S rRNA基因的應(yīng)用較少。本研究的鑒定結(jié)果表明，這2 種基因均可用于冷凍魚肉和預(yù)包裝魚肉樣品的鑒定。對(duì)比COI基因和16S rRNA基因的鑒定結(jié)果發(fā)現(xiàn)，前者在BOLD SYSTEMS數(shù)據(jù)庫(kù)中的鑒定結(jié)果常為明確的單一物種，相似度可達(dá)100%（個(gè)別物種相似度為99.5%以上），而16S rRNA基因在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中比對(duì)結(jié)果的相似度最高僅為99%，且提供的同源物種信息常不止一種。因此，在BOLD SYSTEMS數(shù)據(jù)庫(kù)中比對(duì)COI基因更易于進(jìn)行物種的鑒定與分析。但本研究對(duì)相同樣品進(jìn)行鑒定時(shí)發(fā)現(xiàn)，擴(kuò)增COI基因時(shí)易出現(xiàn)無目的條帶或目的條帶亮度很弱等問題，回收擴(kuò)增產(chǎn)物連接載體也無法完成測(cè)序，而16S rRNA基因擴(kuò)增效果穩(wěn)定，目的條帶明顯，擴(kuò)增產(chǎn)物可直接進(jìn)行測(cè)序，有效節(jié)省了時(shí)間。綜上所述，在進(jìn)行魚肉制品物種鑒定時(shí)可以考慮COI基因和
16S rRNA基因的聯(lián)合使用，既能夠保證鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性，又可以提高鑒定效率。
本研究中冷凍魚肉樣品和預(yù)包裝魚肉樣品的鑒定成功率分別為95.18%和57.14%，共有13 份樣品未能成功進(jìn)行物種鑒定，其中4 份冷凍魚肉樣品和4 份預(yù)包裝魚肉樣品的COI基因或16S rRNA基因可擴(kuò)增出明顯的目的條帶，但可能由于測(cè)序人員的操作或送樣過程中PCR產(chǎn)物保存不當(dāng)?shù)仍驅(qū)е缕湮茨軠y(cè)序成功，5 份預(yù)包裝魚肉樣品未能擴(kuò)增出目的條帶，可能與DNA被破壞有關(guān)。魚罐頭、烤魚片等魚肉制品經(jīng)過復(fù)雜的前處理和高溫加工，細(xì)胞結(jié)構(gòu)被破壞，導(dǎo)致DNA降解，此外，食品中的脂類、酚類等添加劑會(huì)在DNA提取過程中起到抑制作用[30-32]，這些因素均會(huì)影響后續(xù)的鑒定結(jié)果。因此，深加工魚肉樣品的核酸提取、物種鑒定方法還需要進(jìn)一步的探索和優(yōu)化。
4 結(jié) 論
本研究以COI基因和16S rRNA基因作為魚類樣品的DNA條形碼，實(shí)現(xiàn)了對(duì)91 份冷凍魚肉及預(yù)包裝魚肉樣品物種來源的準(zhǔn)確鑒定，進(jìn)一步表明這2 種基因用于魚類制品真?zhèn)舞b定的可行性，說明市場(chǎng)中存在“散裝制品商品名錯(cuò)標(biāo)現(xiàn)象嚴(yán)重，多以低價(jià)魚冒充高價(jià)魚”、“鱈魚市場(chǎng)命名混亂現(xiàn)象依舊存在”以及“預(yù)包裝魚肉制品原材料造假、配料標(biāo)注不明確”等問題，為有關(guān)部門打擊摻假等違法違規(guī)行為提供了技術(shù)支撐，對(duì)維護(hù)食品安全、促進(jìn)動(dòng)物源性食品行業(yè)健康發(fā)展具有重要意義。
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摘 要：以COΙ基因和16S rRNA基因作為魚類制品通用的DNA條形碼，對(duì)超市中采集的91 份冷凍魚肉樣品及經(jīng)過深加工的預(yù)包裝魚肉樣品進(jìn)行物種鑒定。結(jié)果表明：COΙ基因和16S rRNA基因均可用于魚類制品物種真?zhèn)蔚蔫b別；冷凍魚肉樣品和預(yù)包裝魚肉樣品與其商標(biāo)的符合率分別為83.54%和58.33%；市場(chǎng)中存在魚類制品商品標(biāo)簽標(biāo)示錯(cuò)誤、配料標(biāo)注不明確等問題，為相關(guān)部門對(duì)魚類制品的監(jiān)管提供了有力的技術(shù)支持。
關(guān)鍵詞：DNA條形碼；COI基因；16S rRNA基因；魚肉制品；真?zhèn)舞b別
Abstract： This study was conducted to identify the species origin of 91 samples of frozen fish products and highly processed， pre-packaged fish products collected from supermarkets using DNA barcoding technique based on homologous sequence analysis of the COI and 16S rRNA genes. The results confirmed that both COI and 16S rRNA gene sequencing were useful for species authentication of fish products. The species origin of 66 of 79 （83.54%） frozen fish products and 7 of 12 （58.33%） highly processed， pre-packaged fish products was consistent with the product claims， which indicated that some problems such as mislabeling and ambiguous ingredient designation of fish products existed in the fish market. This research can provide technical support for the supervisory authorities concerned .
Keywords： DNA barcoding； COI gene； 16S rRNA gene； fish products； authentication
DOI：10.7506/rlyj1001-8123-201802007
中圖分類號(hào)：TS254.7 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1001-8123（2018）02-0040-06
引文格式：
石蕊寒， 南匯珠， 丁紅田， 等. DNA條形碼技術(shù)鑒別市售魚肉制品真?zhèn)蝃J]. 肉類研究， 2018， 32（2）： 40-45. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-201802007. http：//www.rlyj.pub
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隨著我國(guó)魚肉制品貿(mào)易的飛速發(fā)展和人民生活水平的日益提高，一些不法商家見利忘義，大肆地?fù)郊僭旒?，影響了?guó)內(nèi)外貿(mào)易的正常秩序，也損害了消費(fèi)者的身體健康和經(jīng)濟(jì)利益。超市作為零售終端，以其產(chǎn)品種類繁多、價(jià)格實(shí)惠及選擇性強(qiáng)等優(yōu)勢(shì)已成為消費(fèi)者采購(gòu)魚肉制品的主要渠道。超市中的魚肉制品通常分為鮮活類、冰鮮類、冷凍類及以魚肉為原料的深加工品等，由于受到保鮮、?；顥l件的限制，鮮活類、冰鮮類魚肉制品的種類與后2 種魚肉制品相比相對(duì)較少。冷凍魚肉制品多以分段、切片等形式銷售，以魚肉為原料的深加工品多指烤魚片、魚罐頭等，均難以通過外觀鑒定魚肉種類，給部分水產(chǎn)商創(chuàng)造了可乘之機(jī)，以“低價(jià)魚冒充高價(jià)魚”、深加工品“原材料摻假”等手段欺騙消費(fèi)者。近年來，油魚冒充鱈魚[1]、巴沙魚冒充龍利魚等報(bào)道屢見不鮮，對(duì)于這類摻假造假的判定不能依賴于傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)觀察，必須建立在準(zhǔn)確、可靠的食品物種鑒定基礎(chǔ)上[2]。
DNA條形碼（DNA barcoding）于2003年由Hebert等[3]
首次提出，即利用標(biāo)準(zhǔn)的、有足夠變異的、易擴(kuò)增且相對(duì)較短的DNA片段，根據(jù)物種種內(nèi)的特異性和種間的多樣性而創(chuàng)建的一種新的身份識(shí)別系統(tǒng)，能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)物種進(jìn)行快速、準(zhǔn)確識(shí)別和鑒定。該技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于動(dòng)植物制品真?zhèn)舞b別、瀕危動(dòng)植物保護(hù)以及生物多樣性研究等多個(gè)領(lǐng)域[4-6]。一般認(rèn)為線粒體細(xì)胞色素C氧化酶亞基Ι（cytochrome coxidase subunit I，COI）基因是魚類制品DNA條形碼研究較為理想的目的基因。劉守海等[7]發(fā)現(xiàn)通過對(duì)COI基因的分析鑒定并結(jié)合形態(tài)特征可以對(duì)仔稚魚的種類進(jìn)行鑒定。在肉類摻假等食品檢測(cè)領(lǐng)域，以COI基因?yàn)槟康幕虻腄NA條形碼技術(shù)憑借良好的檢測(cè)效果得到廣泛的研究與應(yīng)用，其首先被應(yīng)用于魚類制品檢測(cè)中[8]。Wong等[9]對(duì)北美部分超市及餐館采集的海產(chǎn)品樣品進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)25%的樣品存在錯(cuò)貼標(biāo)簽的問題。邱德義等[2]對(duì)16 份抽檢的魚肉、魚丸等水產(chǎn)制品進(jìn)行鑒定，結(jié)果表明，除1 份樣品未能成功進(jìn)行擴(kuò)增外，其余15 份順利完成種類來源鑒定的樣品合格率僅為68.75%。李新光等[10]對(duì)不同魚肉制品進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)20 種冷凍魚的鑒定結(jié)果與形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果一致，但是烤魚片樣品與其標(biāo)簽上所標(biāo)示的原料多數(shù)不符，部分烤魚片樣品中還可檢出月尾魚頭鲀。王敏等[11]研究發(fā)現(xiàn)，購(gòu)于深圳批發(fā)市場(chǎng)和超市中的77 份零售魚肉制品的標(biāo)簽錯(cuò)貼率高達(dá)36.36%，其中標(biāo)為“龍利魚”的商品均為低價(jià)的淡水魚。
除了COI基因，以核糖體基因?yàn)榇淼牟糠趾嘶蚝途€粒體基因亦可作為DNA條形碼使用，且已受到越來越多的關(guān)注[12]。韋健紅等[13]的研究表明，COI基因和16S rRNA基因均能將廣地龍與其他地龍或蚯蚓物種鑒別開來。陳文炳等[14]通過對(duì)16S rRNA基因的部分序列進(jìn)行分析和對(duì)比，篩選出可用于精確鑒定日本鰻、美洲鰻和歐洲鰻3 個(gè)物種的標(biāo)準(zhǔn)DNA條形碼。張永等[15]通過16s rRNA部分序列從分子水平對(duì)13 種石首魚科魚類的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系進(jìn)行研究，為其分類和系統(tǒng)進(jìn)化提供了科學(xué)依據(jù)。陳信忠等[16]測(cè)定了12 種觀賞魚的COI基因和16S rRNA基因，發(fā)現(xiàn)通過這2 種基因可以對(duì)亞洲龍魚、神仙魚等觀賞魚進(jìn)行鑒別，但無法鑒別慈鯛等形態(tài)相似的觀賞魚或青龍魚、黃尾龍魚等同一品種、不同品系的觀賞魚。目前，16S rRNA基因的應(yīng)用多集中在分類學(xué)方面[17-19]，但在食品檢測(cè)領(lǐng)域，特別是魚肉制品摻假方面的報(bào)道相對(duì)較少。
本研究選取COI基因和16S rRNA基因作為魚類制品通用的DNA條形碼，對(duì)從超市中采集的冷凍魚肉和預(yù)包裝魚肉樣品進(jìn)行鑒別，旨在考察利用這2 種基因鑒別魚肉制品的可行性，為保障魚類食品的質(zhì)量安全以及政府部門監(jiān)管提供技術(shù)支持。
1 材料與方法
1.1 材料與試劑
2016年5月—2017年9月期間從石家莊16 個(gè)超市中購(gòu)買魚肉樣品，共計(jì)104 份，其中鱈魚、龍利魚、巴沙魚、黃花魚等冷凍魚肉樣品83 份，烤魚片、魚罐頭等經(jīng)過深加工的預(yù)包裝魚肉樣品21 份。冷凍魚肉樣品置于
-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆?，預(yù)包裝魚肉樣品置于常溫條件下保存?zhèn)溆谩?/p>
Wizard? Genomic DNA Purification Kit、Wizard? Magnetic DNA Purification Systerm for Food試劑盒 美國(guó)
Promega公司；2×Taq PCR Mastermix、DNA Marker、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、GelRed染料 天根生化科技（北京）有限公司；DNA Ligation Kit、T-Vector pMD?19（Simple） 寶生物工程（大連）有限公司；
Trans1-T1 Phage Resistant Chemically Competent Cell
北京全式金生物技術(shù)有限公司。
1.2 儀器與設(shè)備
NanoDrop 2000C超微量分光光度計(jì) 美國(guó)Thermo Scientific公司；T-Gradient梯度PCR儀 德國(guó)Biometra公司；Fusion Fx5凝膠成像系統(tǒng) 法國(guó)Viber Lourmat
公司；DYY-7C電泳儀 北京六一生物科技有限公司。
1.3 方法
1.3.1 樣品處理
1.3.1.1 去油
對(duì)于魚罐頭、烤魚片等含油量較大的魚肉樣品，采用氯仿-甲醇法進(jìn)行去油前處理[20]。取適量樣品放入50 mL離心管中，超純水沖洗1～2 次，加入氯仿-甲醇水溶液（氯仿∶甲醇∶水=5∶10∶4，V/V），56 ℃孵育30 min，7 800 r/min條件下離心5 min，棄含油脂的液體。重復(fù)上述步驟清洗3～4 次后將樣品自然晾干，
-20 ℃保存?zhèn)溆?。冷凍魚肉樣品直接進(jìn)行研磨，不需要去油處理。
1.3.1.2 研磨
取適量已解凍魚肉樣品或已去油的預(yù)包裝魚肉樣品放入已滅菌的研缽內(nèi)，剪碎，加入液氮后用研磨杵研磨，將研磨后的樣品-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>
1.3.2 DNA提取和濃度測(cè)定
取100～200 mg研磨后的樣品，按照Wizard? Genomic DNA Purification Kit或Wizard? Magnetic DNA Purification Systerm for Food試劑盒所述方法提取DNA，立即使用或-20 ℃保存?zhèn)溆?。同時(shí)使用NanoDrop 2000C超微量分光光度計(jì)測(cè)定DNA質(zhì)量濃度，根據(jù)測(cè)定所得質(zhì)量濃度，將其稀釋為質(zhì)量濃度50～100 ng/μL。
1.3.3 PCR擴(kuò)增
COI和16S rRNA通用引物參照文獻(xiàn)[21-22]中的相關(guān)序列，如表1所示，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。
COI基因PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系：2×Taq PCR Mastermix 12.5 μL、引物終濃度0.05 μmol/L、DNA 2 μL，ddH2O補(bǔ)足至25 μL。反應(yīng)條件：95 ℃，2 min；94 ℃，30 s；52 ℃，40 s；72 ℃，1 min；35 個(gè)循環(huán)；72 ℃，10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，挑選擴(kuò)增條帶明顯且單一的產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序；或?qū)U(kuò)增陽性的PCR產(chǎn)物按照瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒說明進(jìn)行純化，回收片段連接pMD19-T載體，轉(zhuǎn)入Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)37 ℃過夜培養(yǎng)，挑取單個(gè)菌落于500 μL含有氨芐青霉素（終質(zhì)量濃度100 μg/mL）的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min搖床培養(yǎng)4～6 h，經(jīng)PCR檢測(cè)，挑選陽性克隆菌液200 μL進(jìn)行測(cè)序。
在使用COI基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增沒有出現(xiàn)擴(kuò)增條帶或擴(kuò)增條帶不理想時(shí)，使用16S rRNA基因進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)體系：2×Taq PCR Mastermix 12.5 μL、引物終濃度0.2 μmol/L、DNA 2 μL，ddH2O補(bǔ)足至25 μL。反應(yīng)條件：94 ℃，2 min；94 ℃，45 s；55 ℃，50 s；72 ℃，1 min；35 個(gè)循環(huán)；72 ℃，5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，挑選擴(kuò)增條帶明顯且單一的產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序。
1.3.4 序列比對(duì)
將測(cè)序成功的序列進(jìn)行拼接比對(duì)，在BOLD SYSTEMS（http：//www.boldsystems.org）或NCBI（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov）數(shù)據(jù)庫(kù)中對(duì)樣品的COI序列或16S rRNA序列進(jìn)行鑒定和相似度分析。
2 結(jié)果與分析
2.1 COI基因和16S rRNA基因的擴(kuò)增
由圖1可知，COI基因與16S rRNA基因引物2%瓊脂糖凝膠電泳的擴(kuò)增片段約為703 bp和615 bp，PCR產(chǎn)物的分子質(zhì)量與預(yù)期相符。
由表2可知，104 份魚肉樣品中共有91 份獲得測(cè)序結(jié)果。應(yīng)用COI或16S rRNA任一基因引物擴(kuò)增的樣品序列與BOLD SYSTEMS或NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)發(fā)現(xiàn)，序列相似度均在97%以上，匹配度高，表明COI和16S rRNA基因片段的擴(kuò)增和測(cè)序鑒定結(jié)果準(zhǔn)確可靠，這2 種基因均可有效鑒定魚肉樣品的種類。
2.2 冷凍魚樣品鑒定結(jié)果
2.2.1 冷凍鱈魚鑒定結(jié)果
由表3可知，20 份獨(dú)立包裝樣品中，1 份樣品名為“深海鱈魚片”，配料標(biāo)示為“鱈魚”，經(jīng)鑒定為Coryphaenoides acrolepis/Albatrossia pectoralis（粗麟突吻鱈/細(xì)鱗壯鱈）；1 份樣品名為“格陵蘭扁鱈魚”，配料標(biāo)示為Reinhardtius hippoglossoide（馬舌鰈），與鑒定結(jié)果一致；其余18 份樣品鑒定結(jié)果均與配料中描述的魚種類相符，學(xué)名一致。30 份以散裝稱重形式出售的樣品，其鑒定結(jié)果多為Coryphaenoides acrolepis/Albatrossia pectoralis（粗麟突吻鱈/細(xì)鱗壯鱈）或Gadus chalcogrammus（狹鱈），但1 份名為“鱈魚塊”和1 份名為“狹鱈魚柳”的樣品鑒定結(jié)果與其商標(biāo)不符，二者的鑒定結(jié)果分別為Decapterus maruadsi（藍(lán)圓鲹）和Lophius litulon（安康魚）。
2.2.2 冷凍龍利魚、巴沙魚鑒定結(jié)果
由表4可知，8 份龍利魚樣品和11 份巴沙魚樣品經(jīng)鑒定均為Pangasianodon hypophthalmus（低眼巨鯰），且相似度均大于99.00%。
2.2.3 冷凍黃花魚鑒定結(jié)果
由表5可知，9 份黃花魚樣品中，7 份樣品的商標(biāo)標(biāo)示與鑒定結(jié)果相符，2 份散裝稱質(zhì)量銷售的樣品鑒定結(jié)果與商標(biāo)不符，實(shí)為Chrysochir aureus（尖頭黃鰭牙?）。
2.2.4 其他冷凍魚鑒定結(jié)果
1 份商標(biāo)名為“二去北極冰魚”散裝稱質(zhì)量銷售的冷凍魚肉樣品經(jīng)16S rRNA基因鑒定為Patagonotothen ramsayi（拉氏南美南極魚），相似度為99%。
2.3 預(yù)包裝魚肉樣品鑒定結(jié)果
由表6可知，12 份預(yù)包裝魚肉樣品中，5 份樣品的商標(biāo)名稱與鑒定結(jié)果不符，其中3 份商標(biāo)名稱為“鱈魚片”的樣品經(jīng)鑒定為L(zhǎng)iparis（獅子魚屬），1 份商標(biāo)名稱為“馬面魚”的樣品和1 份商標(biāo)名稱為“鰩魚”的樣品經(jīng)鑒定分別為L(zhǎng)iparis mucosus（縱帶獅子魚）和Lophius litulon（安康魚）。
3 討 論
魚肉制品是人民日常飲食中不可或缺的組成部分，其肉質(zhì)細(xì)嫩鮮美、低脂肪、高蛋白、維生素及礦物質(zhì)含量豐富，易于消化，頗受消費(fèi)者喜愛。但是魚肉制品“摻假”“冒充”等問題會(huì)嚴(yán)重侵害消費(fèi)者的利益。本研究選取COI基因和16S rRNA基因作為DNA條形碼對(duì)冷凍魚肉樣品和經(jīng)過深加工的預(yù)包裝魚肉樣品進(jìn)行鑒定，共有91 份樣品獲得相應(yīng)序列，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，為上述2 種基因在魚類制品真?zhèn)舞b別中的應(yīng)用提供了科學(xué)依據(jù)和研究基礎(chǔ)。
本研究中鑒定冷凍魚肉樣品79 份，預(yù)包裝魚肉樣品12 份，鑒定結(jié)果與商標(biāo)的符合率分別為83.54%和58.33%。由上述鑒定結(jié)果可知，目前魚肉制品市場(chǎng)存在如下問題：1）散裝冷凍樣品商品名錯(cuò)標(biāo)現(xiàn)象嚴(yán)重，多以低價(jià)魚冒充高價(jià)魚。本研究中購(gòu)買獨(dú)立包裝冷凍樣品25 份，此種樣品包裝良好，配料標(biāo)注詳細(xì)，與鑒定結(jié)果相符。但散裝冷凍樣品包裝簡(jiǎn)易，摻假率可達(dá)24.07%（13/54）。散裝魚肉多以魚塊或去頭形式銷售，不易從外觀判定魚肉種類，例如頭尖牙大的Chrysochir aureus（尖頭黃鰭牙?）去頭后與Larimichthys polyactis（小黃魚）魚體相似，較難區(qū)分。此外，散裝魚肉類商品多數(shù)無相應(yīng)的產(chǎn)品介紹，僅簡(jiǎn)易標(biāo)記商品的俗名，無明確學(xué)名，甚至只標(biāo)明“魚塊”等名稱來混淆消費(fèi)者。本研究中“龍利魚”和“巴沙魚”樣品經(jīng)鑒定均為Pangasianodon hypophthalmus（低眼巨鯰）?！褒埨~”屬鰈形目、舌鰨科、舌鰨屬，是優(yōu)質(zhì)的海洋魚類[2，11]，而“巴沙魚”一般認(rèn)為屬于巨鯰屬，包括低眼巨鯰（茶魚）和博氏巨鯰（巴沙魚），是越南湄公河流域的淡水魚[23-25]。部分商家有意將低價(jià)的“巴沙魚”貼上“龍利魚”的標(biāo)簽，以獲得更大的利潤(rùn)。2）鱈魚市場(chǎng)命名混亂。香港食物安全中心發(fā)布的《有關(guān)識(shí)別及標(biāo)簽：油魚/
鱈魚的指引》中闡明：根據(jù)科學(xué)分類，“鱈魚”泛指鱈科的魚類及屬于鱈形目的相關(guān)品種，其中就包括市面上常見的“太平洋鱈”、“大西洋鱈”、“狹鱈”及“粗麟突吻鱈/細(xì)鱗壯鱈”[26]等。然而市場(chǎng)中的“鱈魚”常被用作多種非鱈形目魚類的俗稱，例如“銀鱈魚”和“白鱈魚”多指屬于裸蓋魚科鲉形目的Anoplopoma fimbria（裸蓋魚）及屬于南極魚科鱸形目的Dissostichus eleginoides（小鱗犬牙南極魚）和Dissostichus mawsoni（鱗頭犬牙南極魚）。針對(duì)上述情況，香港食物安全中心建議只有鱈形目魚類才可使用含有“鱈”字的俗名，就Anoplopoma fimbria、Dissostichu seleginoides、Dissostichus mawsoni 3 種魚類而言，在商標(biāo)、食物牌上同時(shí)標(biāo)明魚類學(xué)名和科學(xué)文獻(xiàn)或農(nóng)業(yè)組織建議的俗名時(shí)，才可繼續(xù)使用市場(chǎng)上“銀鱈魚”和“白鱈魚”的俗名。本研究中購(gòu)買的6 份“銀鱈魚”實(shí)為Dissostichus eleginoides（小鱗犬牙南極魚），“扁鱈魚”經(jīng)鑒定為Reinhardtius hippoglossoide（馬舌鰈），鑒定結(jié)果與其配料中標(biāo)注的學(xué)名相符，但是與商標(biāo)中的俗名“鱈魚”不符。這種命名混亂的現(xiàn)象近幾年多有報(bào)道，但目前我國(guó)尚未出臺(tái)針對(duì)鱈魚命名的標(biāo)準(zhǔn)或相應(yīng)的市場(chǎng)規(guī)范準(zhǔn)則[27]，
此亂象并未得到改善。3）預(yù)包裝魚肉產(chǎn)品配料不明或不符。我國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 7718—2011《預(yù)包裝食品標(biāo)簽通則》中規(guī)定，在食品標(biāo)簽中應(yīng)清晰地標(biāo)示反映食品真實(shí)屬性的專用名稱，不得使用易使消費(fèi)者誤解或混淆的常用名稱或通俗名稱[28]。但是市場(chǎng)上仍有許多烤魚片、魚罐頭產(chǎn)品配料上只標(biāo)明“深海魚”、“新鮮魚肉”、“鱈魚”等名稱，使消費(fèi)者難以判斷。李楠等[29]選取27 份烤魚片、魚干樣品進(jìn)行品種鑒定，發(fā)現(xiàn)13 份配料標(biāo)注為“鱈魚”“鰩魚”或“魚片”的樣品中可檢出河豚魚成分，部分河豚魚種含有劇毒物質(zhì)河豚毒素，對(duì)消費(fèi)者的身體健康有嚴(yán)重威脅。本研究中雖未檢出含有毒性的魚種，但是以Liparis（獅子魚屬）冒充鱈魚或馬面魚、以Lophius litulon（安康魚）冒充鰩魚等原材料造假、配料中標(biāo)注與商品名稱不符現(xiàn)象較為嚴(yán)重。
在關(guān)于肉類樣品鑒定的報(bào)道中多使用COI基因，
16S rRNA基因的應(yīng)用較少。本研究的鑒定結(jié)果表明，這2 種基因均可用于冷凍魚肉和預(yù)包裝魚肉樣品的鑒定。對(duì)比COI基因和16S rRNA基因的鑒定結(jié)果發(fā)現(xiàn)，前者在BOLD SYSTEMS數(shù)據(jù)庫(kù)中的鑒定結(jié)果常為明確的單一物種，相似度可達(dá)100%（個(gè)別物種相似度為99.5%以上），而16S rRNA基因在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中比對(duì)結(jié)果的相似度最高僅為99%，且提供的同源物種信息常不止一種。因此，在BOLD SYSTEMS數(shù)據(jù)庫(kù)中比對(duì)COI基因更易于進(jìn)行物種的鑒定與分析。但本研究對(duì)相同樣品進(jìn)行鑒定時(shí)發(fā)現(xiàn)，擴(kuò)增COI基因時(shí)易出現(xiàn)無目的條帶或目的條帶亮度很弱等問題，回收擴(kuò)增產(chǎn)物連接載體也無法完成測(cè)序，而16S rRNA基因擴(kuò)增效果穩(wěn)定，目的條帶明顯，擴(kuò)增產(chǎn)物可直接進(jìn)行測(cè)序，有效節(jié)省了時(shí)間。綜上所述，在進(jìn)行魚肉制品物種鑒定時(shí)可以考慮COI基因和
16S rRNA基因的聯(lián)合使用，既能夠保證鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性，又可以提高鑒定效率。
本研究中冷凍魚肉樣品和預(yù)包裝魚肉樣品的鑒定成功率分別為95.18%和57.14%，共有13 份樣品未能成功進(jìn)行物種鑒定，其中4 份冷凍魚肉樣品和4 份預(yù)包裝魚肉樣品的COI基因或16S rRNA基因可擴(kuò)增出明顯的目的條帶，但可能由于測(cè)序人員的操作或送樣過程中PCR產(chǎn)物保存不當(dāng)?shù)仍驅(qū)е缕湮茨軠y(cè)序成功，5 份預(yù)包裝魚肉樣品未能擴(kuò)增出目的條帶，可能與DNA被破壞有關(guān)。魚罐頭、烤魚片等魚肉制品經(jīng)過復(fù)雜的前處理和高溫加工，細(xì)胞結(jié)構(gòu)被破壞，導(dǎo)致DNA降解，此外，食品中的脂類、酚類等添加劑會(huì)在DNA提取過程中起到抑制作用[30-32]，這些因素均會(huì)影響后續(xù)的鑒定結(jié)果。因此，深加工魚肉樣品的核酸提取、物種鑒定方法還需要進(jìn)一步的探索和優(yōu)化。
4 結(jié) 論
本研究以COI基因和16S rRNA基因作為魚類樣品的DNA條形碼，實(shí)現(xiàn)了對(duì)91 份冷凍魚肉及預(yù)包裝魚肉樣品物種來源的準(zhǔn)確鑒定，進(jìn)一步表明這2 種基因用于魚類制品真?zhèn)舞b定的可行性，說明市場(chǎng)中存在“散裝制品商品名錯(cuò)標(biāo)現(xiàn)象嚴(yán)重，多以低價(jià)魚冒充高價(jià)魚”、“鱈魚市場(chǎng)命名混亂現(xiàn)象依舊存在”以及“預(yù)包裝魚肉制品原材料造假、配料標(biāo)注不明確”等問題，為有關(guān)部門打擊摻假等違法違規(guī)行為提供了技術(shù)支撐，對(duì)維護(hù)食品安全、促進(jìn)動(dòng)物源性食品行業(yè)健康發(fā)展具有重要意義。
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