摘 要：以凡納濱對(duì)蝦肌球蛋白為研究對(duì)象，用原子力顯微鏡觀察高密度CO2（dense phase carbon dioxide，DPCD）處理壓強(qiáng)、溫度和時(shí)間對(duì)肌球蛋白微觀形貌的影響，探討DPCD處理過程中肌球蛋白的聚集行為特征。結(jié)果表明：在不同的DPCD處理壓強(qiáng)、溫度和時(shí)間條件下，肌球蛋白變性和聚集的程度有顯著差異；DPCD誘導(dǎo)肌球蛋白變性聚集過程中，不僅有熱效應(yīng)引起的蛋白質(zhì)分子間的相互作用，還有高壓下CO2與蛋白質(zhì)分子間的相互作用。

關(guān)鍵詞：高密度CO2；微觀形貌；分子粒徑；肌球蛋白；凡納濱對(duì)蝦

Abstract： In the present research， the effect of dense phase carbon dioxide （DPCD） on the micromorphology of myosin extracted from Litopenaeus vannamei muscle was studied by atomic force microscopy （AFM）. DPCD treatments were carried out at different pressures and temperatures for different durations. The aggregation characteristics of myosin during the treatments were explored. The results showed that the degree of myosin denaturation and aggregation varied greatly as a function of pressure， temperature and treatment time. DPCD induced myosin denaturation and aggregation by thermally inducing protein-protein interaction as well as by inducing interaction between the protein and carbon dioxide at high pressure.

Keywords： dense phase carbon dioxide； micromorphology； protein particle diameter； myosin； Litopenaeus vannamei

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-201802001

中圖分類號(hào)：TS254.4 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1001-8123（2018）02-0001-07

引文格式：

劉書成， 董安迪， 羅帥， 等. 高密度CO2對(duì)蝦肌球蛋白微觀形貌的影響[J]. 肉類研究， 2018， 32（2）： 1-7. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-201802001. http：//www.rlyj.pub

LIU Shucheng， DONG Andi， LUO Shuai， et al. Effect of dense phase carbon dioxide on micromorphology of myosin from Litopenaeus vannamei muscle[J]. Meat Research， 2018， 32（2）： 1-7. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-201802001. http：//www.rlyj.pub

天然蛋白質(zhì)在外界環(huán)境（加熱、溶液pH值、高壓等）的誘導(dǎo)作用下，分子的空間結(jié)構(gòu)會(huì)發(fā)生改變，蛋白質(zhì)分子內(nèi)部、蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)-溶劑之間的作用力也會(huì)隨之發(fā)生改變，最終導(dǎo)致蛋白質(zhì)的變性聚集，形成新的結(jié)構(gòu)[1]，典型的表現(xiàn)就是肌球蛋白的凝膠化過程。肌球蛋白的凝膠化能力是其重要的食品功能特性之一，對(duì)于肉糜類產(chǎn)品（如肉丸、火腿腸等）的質(zhì)構(gòu)形成具有非常重要的作用。加熱、pH值、NaCl或超高壓等處理均可以誘導(dǎo)肌球蛋白形成凝膠[2-7]，評(píng)價(jià)一種處理方法能否使肌球蛋白形成凝膠，首先是看該處理方法能否使肌球蛋白發(fā)生變性和聚集，形成大的凝聚物，因?yàn)榇蟮哪畚锏漠a(chǎn)生是形成優(yōu)良彈性凝膠的前提[8]。

高密度CO2（dense phase carbon dioxide，DPCD）是近年來興起的一種非熱食品加工技術(shù)，主要用于食品的殺菌和鈍酶，有研究發(fā)現(xiàn)一定強(qiáng)度的DPCD處理也能使食品蛋白質(zhì)發(fā)生變性和聚集[9-12]，甚至形成凝膠[13-17]。本課題組前期研究表明，DPCD能夠誘導(dǎo)凡納濱對(duì)蝦（Litopenaeus vannamei）肉糜形成凝膠，而且所制備凝膠的感官特性、營(yíng)養(yǎng)特性、微觀結(jié)構(gòu)和質(zhì)構(gòu)特性等都顯著優(yōu)于熱誘導(dǎo)所形成的凝膠[17]。為闡明DPCD誘導(dǎo)蝦肉糜形成凝膠的機(jī)制，本研究以凡納濱對(duì)蝦肌球蛋白為對(duì)象，利用原子力顯微鏡觀察DPCD處理溫度、壓強(qiáng)和處理時(shí)間對(duì)肌球蛋白微觀形貌的影響，探討DPCD處理過程中肌球蛋白的聚集行為特征，為利用DPCD開發(fā)優(yōu)質(zhì)的肉類凝膠制品提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

凡納濱對(duì)蝦，規(guī)格50～60 尾/kg，購(gòu)于廣東省湛江市霞山區(qū)東風(fēng)水產(chǎn)批發(fā)市場(chǎng)，保活運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室，用自來水清洗干凈后備用。

Lowry法蛋白質(zhì)含量測(cè)定試劑盒 上海荔達(dá)生物技術(shù)有限公司；三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）、二硫代蘇糖醇（dithiothreitol，DTT）（均為分析純） 廣州市齊云生物技術(shù)有限公司；十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electropheresis，SDS-PAGE）凝膠配制試劑盒、SDS蛋白上樣緩沖液 碧云天生物技術(shù)研究所；即用型蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)（寬） 寶生物工程（大連）有限公司；CO2（純度99.9%） 湛江氧氣廠；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

HA221-50-10-C超臨界裝置 南通市華安超臨界萃取有限公司；UV-2550紫外-可見分光光度計(jì) 日本島津儀器有限公司；PHS-3C精密pH計(jì) 上海雷磁儀器廠；CR22GⅡ高速冷凍離心機(jī) 日本日立公司；DYCZ-24DN雙垂直迷你電泳儀、DYY-6C雙穩(wěn)定時(shí)電泳儀電源 北京六一儀器廠；5417R冷凍離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf公司；HR3865/00組織勻漿機(jī) 荷蘭飛利浦公司；JYL-C022絞肉機(jī) 山東九陽股份有限公司；Bruker Multimode 8掃描探針顯微鏡 德國(guó)布魯克公司；云母片 長(zhǎng)春市泰元氟金云母有限公司。

1.3 方法

1.3.1 肌球蛋白的提取

參考Hwang等[18]的方法。新鮮蝦肉攪碎后，稱取肉樣，加入5 倍體積（m/V）的20 mmol/L磷酸緩沖液（pH 7.0），均質(zhì)后離心（5 500×g，10 min），取沉淀，重復(fù)上述過程2 次；向所得沉淀中加入3 倍體積

（m/V）的提取液（包含0.45 mol/L的KCl、5 mmol/L的ATP、7.5 mmol/L的MgCl2和0.15 mmol/L的DTT，pH 6.4），攪拌15 min后離心（10 000×g，10 min）；4 層紗布過濾后，取濾液與9 倍體積（V/V）的預(yù)冷蒸餾水混合，靜置10 min，離心（6 000×g，10 min）得沉淀；向沉淀中加入緩沖液（包含3 mol/L的KCl、0.6 mmol/L的DTT和0.12 mol/L的Tris-Maleate，pH 7.5），沉淀與緩沖液的配比為5∶1（m/V），于4 ℃靜置過夜；再加入包含0.11 mol/L

的ATP、55 mmol/L的MgCl2和5.5 mmol/L乙二醇二乙醚二胺四乙酸（ethylene glycol-bis-（2-aminoethyl）ether-N，N，N，N-tetraacetic acid，EGTA）的溶液（pH 7.5），沉淀與溶液的配比為10∶1（m/V），于4 ℃靜置2 h；向上述溶液中加入硫酸銨（室溫條件下1 L溶液中添加243～277 g硫酸銨，使硫酸銨的飽和度為40%～45%），用來分離純化肌球蛋白，離心（10 000×g，15 min）；將沉淀置于0.6 mol/L KCl-20 mmol/L磷酸緩沖液（pH 7.0）中透析至無SO42-檢出，期間更換透析液，整個(gè)過程中，溶液保持在4 ℃條件下。將透析后的溶液離心（10 000×g，15 min），上清液即為凡納濱對(duì)蝦肌球蛋白溶液。

用SDS-PAGE測(cè)得上述肌球蛋白溶液的肌球蛋白純度為96%；采用Lowry法[14]，以牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品，測(cè)得溶液的蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度為12～16 mg/mL。使用時(shí)稀釋到所需質(zhì)量濃度。

1.3.2 DPCD處理

將1.3.1節(jié)所得肌球蛋白溶液稀釋至0.01 mg/mL，取3 mL于試管中，用于DPCD處理。

間歇式DPCD處理流程參考張良等[19]的方法。實(shí)驗(yàn)開始時(shí)，首先打開制冷及冷卻循環(huán)，設(shè)置處理釜所需溫度，然后將樣品放入處理釜中，密封，開啟高壓泵泵入CO2氣體，待壓強(qiáng)上升至所需壓強(qiáng)，關(guān)閉高壓泵，封閉進(jìn)出處理釜的閥門，維持處理釜內(nèi)所需的壓強(qiáng)和溫度，靜態(tài)處理一段時(shí)間后，卸壓取出樣品，即完成一次處理。

設(shè)置處理溫度分別為30、35、40、45、50、60 ℃（處理壓強(qiáng)25 MPa，處理時(shí)間30 min），處理壓強(qiáng)分別為5、10、15、20、25、30 MPa（處理溫度45 ℃，處理時(shí)間30 min），處理時(shí)間分別為5、10、15、20、30、40 min（處理溫度45 ℃，處理壓強(qiáng)25 MPa），利用原子力顯微鏡觀察DPCD處理溫度、壓強(qiáng)和處理時(shí)間對(duì)肌球蛋白微觀形貌的影響。將水浴熱處理設(shè)為對(duì)照組，水浴熱處理的溫度水平與DPCD處理一致，處理時(shí)間30 min。

1.3.3 原子力顯微鏡掃描

掃描探針顯微鏡的探針型號(hào)為MPP-11100-10（Rtesp）；探針材料為0.01～0.0025 Ohm-cm Antimony （n）doped Si；探針懸臂規(guī)格為厚度3.75 μm、長(zhǎng)度125 μm、寬度35 μm、共振頻率300 kHz、力常數(shù)40 N/m；

探針正反面均無涂層。工作模式為智能模式，掃描范圍2 μm×2 μm，掃描速率2 Hz，掃描管型號(hào)7997JVLR。

樣品前處理：將蝦肌球蛋白溶液旋涂到預(yù)先處理好的干凈云母片上，用氮?dú)獯蹈桑瞥蓽y(cè)試樣品。蛋白質(zhì)顆粒的粒徑可以用干燥狀態(tài)下從云母片基底表面到蛋白質(zhì)顆粒表面的垂直距離表示，原子力顯微鏡掃描圖還可以反映蛋白質(zhì)的聚集程度。

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用掃描探針顯微鏡自帶的Nanoscope Aualysis分析軟件（德國(guó)布魯克公司）對(duì)掃描圖進(jìn)行分析；隨機(jī)選擇10 個(gè)蛋白質(zhì)顆粒，計(jì)算其平均粒徑大小，結(jié)果用平

均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示；用JMP 10.0軟件（賽仕軟件有限公司）對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析和Tukeys HSD多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 未處理凡納濱對(duì)蝦肌球蛋白的微觀形貌

由圖2～4可知，無論是DPCD處理還是單純熱處理，隨著處理溫度的增加，蝦肌球蛋白逐步發(fā)生聚集現(xiàn)象

（P<0.05），分子平均粒徑也顯著增加（P<0.05），且當(dāng)處理溫度高于40 ℃后，肌球蛋白的聚集均更加顯著（P<0.05），這主要是由于凡納濱對(duì)蝦肌球蛋白的熱變性溫度為42.8 ℃[20]，當(dāng)處理溫度接近或高于變性溫度后，肌球蛋白就會(huì)逐漸發(fā)生變性并聚集。在相同溫度條件下，DPCD處理的肌球蛋白的分子平均粒徑顯著小于單獨(dú)熱處理（P<0.05），說明相同溫度條件下DPCD誘導(dǎo)肌球蛋白的聚集程度弱于單純熱處理，這可能是由于肌球蛋白在DPCD處理過程中不僅受熱效應(yīng)的影響，還受到高壓下CO2分子效應(yīng)的影響。

在單純的熱處理過程中，主要是溶液中的肌球蛋白分子間的相互作用；而在DPCD處理過程中，不僅存在肌球蛋白分子間的相互作用，還存在DPCD與水分子的相互作用和DPCD與蛋白質(zhì)分子間的相互作用。DPCD與水分子的相互作用可以使溶液的pH值下降，改變肌球蛋白分子周圍的微環(huán)境，可能使蛋白質(zhì)發(fā)生變性[21]；DPCD與蛋白質(zhì)分子間的相互作用（如疏水相互作用、氫鍵、靜電作用等[22-23]）可能會(huì)減弱蛋白質(zhì)分子間的相互作用。

在肌球蛋白受熱誘導(dǎo)形成凝膠的過程中，主要是熱效應(yīng)使肌球蛋白發(fā)生變性，進(jìn)一步引起肌球蛋白分子之間頭部與頭部和尾部與尾部的相互作用，從而發(fā)生聚集，形成凝膠。Sharp等[24]研究肌球蛋白分子的熱誘導(dǎo)現(xiàn)象，發(fā)現(xiàn)在40 ℃條件下肌球蛋白分子通過頭部聚集形成球狀低聚物，50 ℃條件下低聚物會(huì)進(jìn)一步發(fā)生聚集，溫度達(dá)到60 ℃時(shí)形成具有一定粒徑分布的聚合物，在這個(gè)過程中肌球蛋白尾部的作用較弱。Hayakawa等[25]利用透射電子顯微鏡觀察不同溫度處理后雞胸肉肌球蛋白分子的微觀形貌變化，也發(fā)現(xiàn)肌球蛋白分子頭部之間的聚集作用始終占主導(dǎo)地位。

在肌球蛋白的DPCD處理過程中不僅有熱效應(yīng)，還有高壓下CO2與蛋白質(zhì)分子間的相互作用[23]；隨著溫度的升高，CO2的分子熱運(yùn)動(dòng)加劇，增加了CO2與蛋白質(zhì)的接觸機(jī)會(huì)，從而增強(qiáng)了其相互作用?？赡苷怯捎诟邏合翪O2與蛋白質(zhì)間的相互作用減弱了蛋白質(zhì)分子間的相互作用，隨著處理溫度的升高，肌球蛋白的聚集程度減弱。

Li Renjie等[26]用高壓CO2處理類甜蛋白（thaumatin-like protein，TLP），并用原子力顯微鏡觀察到了同樣的實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象。Hu Wanfeng等[27]用35 ℃和8 MPa的高壓CO2處理多酚氧化酶20 min，其分子粒徑從116 nm增加到627 nm，均與本研究的結(jié)果一致。因此，DPCD處理與熱處理均能使蛋白質(zhì)發(fā)生變性和聚集，但是單純熱處理與DPCD處理對(duì)蛋白質(zhì)的影響機(jī)制有顯著差異。

2.3 DPCD處理壓強(qiáng)對(duì)凡納濱對(duì)蝦肌球蛋白微觀形貌的影響

由圖5～6可知，與未處理時(shí)相比，5～10 MPa壓強(qiáng)范圍內(nèi)的蝦肌球蛋白發(fā)生了顯著聚集，分子平均粒徑逐漸增大（P<0.05），形成了較大的形狀不規(guī)則的聚集體；當(dāng)壓強(qiáng)為15 MPa時(shí)，蝦肌球蛋白的聚集程度減弱，分子平均粒徑逐漸減?。≒<0.05）；當(dāng)壓強(qiáng)在20～30 MPa范圍內(nèi)時(shí)，蝦肌球蛋白的分子平均粒徑小于未處理組

（P<0.05）。在5～10 MPa范圍內(nèi)時(shí)，CO2主要以氣體和亞臨界氣體狀態(tài)存在，在水中的溶解度相對(duì)較低，此時(shí)肌球蛋白較大程度的聚集可能主要是由熱效應(yīng)引起的，而CO2與蛋白質(zhì)間的相互作用較弱。隨著處理壓強(qiáng)的增加，CO2進(jìn)入超臨界狀態(tài)，在水中的溶解度也大大增加，顯著增強(qiáng)了DPCD與蛋白質(zhì)間的相互作用，使蛋白質(zhì)分子之間的相互作用相對(duì)減弱，從而使肌球蛋白的聚集程度減弱[23]。

Li Renjie等[26]用高壓CO2處理TLP，并用原子力顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，在20 MPa、35 ℃條件下，DPCD處理15 min后，部分TLP聚集，形成規(guī)則、致密的聚集體，也有部分TLP被解離，形成更小、不規(guī)則的顆粒；Hu Wanfeng等[27]發(fā)現(xiàn)，當(dāng)DPCD處理壓強(qiáng)從0.1 MPa增加到1.0 MPa時(shí)，大豆蛋白溶液pH值從6.4降至4.9，蛋白質(zhì)粒徑從0.2 μm增至0.5 μm，這均與本研究的結(jié)果一致。因此，DPCD既能使蛋白質(zhì)發(fā)生聚集，又能使其發(fā)生解離。一般來說，在較低的處理壓強(qiáng)下，蛋白質(zhì)分子間的相互作用強(qiáng)于CO2與蛋白質(zhì)間的相互作用，蛋白質(zhì)發(fā)生變性后隨即發(fā)生聚集，分子平均粒徑變大；當(dāng)處理壓強(qiáng)較高時(shí)，CO2與蛋白質(zhì)間的相互作用增強(qiáng)，使蛋白質(zhì)分子間的相互作用減弱，蛋白質(zhì)雖然發(fā)生了變性，但聚集較弱，分子平均粒徑較小。

2.4 DPCD處理時(shí)間對(duì)凡納濱對(duì)蝦肌球蛋白微觀形貌的影響

由圖7～8可知，DPCD處理5 min即可使蝦肌球蛋白發(fā)生明顯的聚集，分子平均粒徑顯著增加（P<0.05），此時(shí)形成的聚集體緊密，而且顆粒粒徑大小呈現(xiàn)不均勻分布；隨著處理時(shí)間的增加，肌球蛋白分子的聚集程度顯著減弱（P<0.05），這同樣與DPCD與肌球蛋白分子之間的相互作用有關(guān)。處理時(shí)間短時(shí)可能熱效應(yīng)占主導(dǎo)地位，肌球蛋白分子間的相互作用強(qiáng)于DPCD與蛋白質(zhì)間的相互作用；隨著處理時(shí)間增加，DPCD與蛋白質(zhì)的相互作用逐漸增強(qiáng)，使肌球蛋白分子之間的相互作用減弱，從而使肌球蛋白的聚集程度減弱。

由以上分析可知，DPCD能夠誘導(dǎo)肌球蛋白發(fā)生變性和聚集，但是在不同的DPCD處理強(qiáng)度下，肌球蛋白變性和聚集程度是有差異的，其機(jī)制可能包括以下幾方面：1）DPCD能使溶液的pH值下降，改變?nèi)芤旱奈h(huán)境[21]；2）DPCD能使蛋白質(zhì)的α-螺旋含量下降、β-折疊含量上升，促進(jìn)蛋白質(zhì)的變性和聚集[22，28]；3）DPCD與蛋白質(zhì)分子間的相互作用（如疏水相互作用、氫鍵、靜電相互作用等[23]）能夠影響蛋白質(zhì)分子間的相互作用等。

3 結(jié) 論

利用原子力顯微鏡觀察DPCD處理對(duì)凡納濱對(duì)蝦肌球蛋白分子微觀形貌的影響，結(jié)論如下：1）純化的肌球蛋白分子呈橢圓球形、表面光滑并且有清晰的邊緣，分子平均粒徑為4.78 nm；2）DPCD處理能誘導(dǎo)肌球蛋白發(fā)生變性和聚集，但在不同的處理強(qiáng)度下，肌球蛋白變性和聚集的程度有顯著差異；3）DPCD誘導(dǎo)肌球蛋白變性和聚集過程中，不僅有熱效應(yīng)引起的蛋白質(zhì)分子間的相互作用，而且還有高壓下CO2與蛋白質(zhì)分子間的相互作用。本研究結(jié)果為DPCD誘導(dǎo)蛋白質(zhì)形成凝膠的機(jī)制研究和技術(shù)開發(fā)提供了參考。

參考文獻(xiàn)：

[1] TOTOSAUS A， MONTEJANO J G， SALAZAR J A， et al. A review of physical and chemical protein-gel induction[J]. International Journal of Food Science and Technology， 2002， 37（6）： 589-601. DOI：10.1046/j.1365-2621.2002.00623.x.