胡敏

摘要 [目的]優(yōu)化綠豆核酸酶的提取條件并測(cè)定其活力。[方法]利用單因素和正交試驗(yàn)，考察提取時(shí)間、料液比、pH、芽長(zhǎng)幾個(gè)因素對(duì)從綠豆芽中提取核酸酶的影響，優(yōu)選出各影響因素的最佳水平，并進(jìn)行活力測(cè)定。[結(jié)果]提取時(shí)間20 h，料液比1∶12（g∶mL），pH 3.0，芽長(zhǎng)是綠豆長(zhǎng)的4倍時(shí)，綠豆核酸酶酶活最高為478.86 U/ mL 。影響綠豆核酸酶提取的因素主次順序依次為提取時(shí)間、pH、料液比、芽長(zhǎng)。采用飽和度為80%的硫酸銨鹽析沉淀后，酶活達(dá) 1 569.6 U/ mL ，較提純前提高了2.28倍。[結(jié)論]該研究可為核酸酶的開發(fā)利用提供參考。

關(guān)鍵詞 綠豆；核酸酶；提取；活力

中圖分類號(hào) S522 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2018）02-0149-03

Abstract [Objective]To optimize the extraction conditions of mung bean nuclease and determine its vitality.[Method]Single factor and orthogonal experiments were used to investigate the effects of extraction time，material to liquid ratio，pH and bud length on the extraction of nuclease from mung bean sprouts.The best level of each influencing factor was selected and the activity was determined.[Result]The extraction time was 20 h，the solidliquid ratio was 1∶12（g∶mL），pH 3，and the bud length was 4 times the length of mung bean，and the maximum activity of the mung bean nuclease enzyme was 478.86 U/ mL.The main and secondary factors affecting the extraction of mung bean nuclease are extraction time，pH，ratio of material and liquid，and length of bud.After precipitation of ammonium sulfate with saturation of 80%，the enzyme activity reached 1 569.6 U/ mL，which was 2.28 times higher than that before purification.[Conclusion]This study can provide reference for the development and utilization of nuclease.

Key words Mung bean； Nuclease； Extraction； Activity

核酸酶作用于核酸鏈中的磷酸二酯鍵。不同來源的核酸酶，可能具有不同的分子結(jié)構(gòu)和催化性能[1-2]。核酸酶可以從毒蛇的毒汁、綠豆芽、麥芽根中提取得到，也可以利用桔青霉生產(chǎn)。

綠豆核酸酶是來源于綠豆芽的5′-磷酸二酯酶，可將單鏈DNA水解為5′端帶磷酸基團(tuán)的單核苷酸或寡核苷酸[3]。雙鏈DNA、雙鏈RNA及DNA與RNA雜交鏈對(duì)此酶相對(duì)不敏感，但此酶量大時(shí)也能將雙鏈核酸完全降解。作用的最適pH為5.2～5.4[4]，最適溫度37 ℃，需要Zn2+、乙二胺四乙酸（EDTA）為抑制劑，0.01%十二烷基磺酸鈉（SDS）（pH 5.0）能夠使酶完全失活[5]。

目前，核酸酶可用作食品添加劑、生化藥物，在農(nóng)業(yè)上可作為植物生長(zhǎng)劑[6]，在飼料上用作高效安全的添加劑[7]，也可用于各種調(diào)味品[8]、功能性食物、核酸強(qiáng)化食品、保健品的生產(chǎn)[9]。采用磷酸二酯酶水解RNA法生產(chǎn)5′-核苷酸是目前核苷酸生產(chǎn)的主要方法。從世界整體情況來看，核苷酸總體上供不應(yīng)求，在全球范圍內(nèi)屬于緊缺產(chǎn)品，市場(chǎng)前景良好。

1 材料與方法

1.1 材料

原料：綠豆。主要儀器：752N紫外可見分光光度計(jì)、PDZ5-WS低速自動(dòng)平衡離心機(jī)、HHS型電熱恒溫水浴鍋、PHS-25型數(shù)顯酸度計(jì)。主要試劑：硫酸銨、醋酸鈉、醋酸、氯化鈉、硫酸鋅、甘油、高氯酸、大腸桿菌菌液、裂解液、苯酚、氯仿、無水乙醇、70%乙醇、RNaseA、ddH2O。

1.2 方法

1.2.1 綠豆預(yù)處理。稱取綠豆200 g，清洗5遍裝入燒杯中，用5層紗布覆蓋，加入25 ℃溫水浸泡。每2 h淋一次水，待豆芽長(zhǎng)到要求長(zhǎng)度取出待用[10]。

1.2.2 底物DNA的制備。取1.5 mL大腸桿菌菌液，離心，棄上清，加入40 μL裂解液，37 ℃水浴30 min。加入132 μL氯化鈉，離心，取上清置新離心管中。加入300 μL苯酚和300 μL氯仿，混勻，離心，取上清置新離心管中。加入600 μL氯仿，離心，取上清置新離心管中。加入800 μL無水乙醇，-20 ℃靜置10 min，離心，棄上清。加入300 μL 70%乙醇清洗，晾干，加入2 μL RNaseA、30 μL ddH2O，使用濃度純度分析儀在波長(zhǎng)260 nm處測(cè)定底物DNA濃度。置于4 ℃冰箱備用[11-12]。底物也可選用長(zhǎng)春花基因組DNA。

1.2.3 單因素試驗(yàn)。

1.2.3.1 提取時(shí)間對(duì)綠豆核酸酶提取的影響。

取綠豆芽4 g，在冰上研磨加入0.2 mol/L醋酸鈉緩沖溶液（含0.1 mol ZnSO4），分別提取4、8、12、16、20、24、28、32 h。過濾棄濾渣，濾液65 ℃水浴15 min，3 500 r/min離心取上清，分別測(cè)定其核酸酶活力。

1.2.3.2 料液比對(duì)綠豆核酸酶提取的影響。

取綠豆芽4 g，在冰上研磨分別加入8、16、24、32、40、48、56、64 mL的0.2 mol/L醋酸鈉緩沖溶液（含0.1 mol ZnSO4），使料液比分別為1∶2、1∶4、1∶6、1∶8、1∶10、1∶12、1∶14、1∶16（g/mL）。過濾棄濾渣，濾液65 ℃水浴15 min，3 500 r/min離心取上清，分別測(cè)定其核酸酶活力。

1.2.3.3 pH對(duì)綠豆核酸酶提取的影響。

取綠豆芽4 g，在冰上研磨分別加入pH 2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0的0.2 mol/L醋酸鈉緩沖溶液（含0.1 mol ZnSO4）。過濾棄濾渣，濾液65 ℃水浴15 min，3 500 r/min離心取上清，分別測(cè)定其核酸酶活力。

1.2.3.4

芽長(zhǎng)對(duì)綠豆核酸酶提取的影響。分別取芽長(zhǎng)為綠豆長(zhǎng)度1、2、3、4、5、6、7、8倍的綠豆芽4 g，在冰上研磨加入0.2 mol/L醋酸鈉緩沖溶液（含0.1 mol ZnSO4）。過濾棄濾渣，濾液65 ℃水浴15 min，離心取上清，分別測(cè)定其核酸酶活力。

1.2.4 綠豆核酸酶活力的測(cè)定。

取甲乙2支2 mL離心管，分別加入稀釋5倍、濃度為1.8 μg/mL的底物DNA 50 μL和pH 5.0的0.2 mol/L醋酸鈉緩沖溶液40 μL，于65 ℃水浴中預(yù)熱10 min，然后在甲管中加入10 μL酶液，繼續(xù)保溫10 min。甲乙兩管再分別加入高氯酸溶液（2.5%）100 μL[13-14]，乙管補(bǔ)加10 μL酶液，冷卻放置15 min，3 500 r/min離心15 min，取上清。在波長(zhǎng)260 nm處測(cè)OD260。以先加高氯酸的離心管為對(duì)照，在上述條件下，每1 min形成的核苷酸能使波長(zhǎng)260 nm處的光密度差為1.0的量，定義為1個(gè)酶活單位。計(jì)算公式如下：

酶活力=（OD260甲-OD260乙）×1.8/10 （1）

1.2.5 正交試驗(yàn)。通過對(duì)料液比、提取時(shí)間、pH、芽長(zhǎng)單因素的研究，選擇4個(gè)合適的水平，進(jìn)行4因素4水平的正交試驗(yàn)。

1.2.6 綠豆核酸酶粗酶液的提純。

1.2.6.1 硫酸銨分級(jí)沉淀。取2 mL正交試驗(yàn)最優(yōu)組合的粗酶液分別加入8 mL 30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%的硫酸銨溶液，靜置48 h。

1.2.6.2 透析。將鹽析溶液加入透析袋中，流水透析48 h，3 500 r/min離心取上清，測(cè)定核酸酶活力。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 提取時(shí)間對(duì)綠豆核酸酶提取效果的影響。

由圖1可知，在提取20 h之前，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，提取液中綠豆核酸酶酶活不斷提高；在提取20 h時(shí)達(dá)到最大值，酶活為293.76 U/mL；在20 h之后繼續(xù)延長(zhǎng)提取時(shí)間，提取液中的綠豆核酸酶酶活逐漸下降。原因?yàn)樘崛?0 h之前是豆芽中的綠豆核酸酶不斷被提取到提取液中的過程，提取液中酶濃度不斷增高使酶活增高；在提取20 h時(shí)綠豆芽中絕大多數(shù)的綠豆核酸酶被提取出來；再延長(zhǎng)提取時(shí)間導(dǎo)致綠豆核酸酶在提取環(huán)境下存留時(shí)間過長(zhǎng)引起部分酶活降低或者失活。

2.1.2 料液比對(duì)綠豆核酸酶提取效果的影響。

由圖2可知，在料液比1∶2～1∶8（g∶mL）時(shí)酶活力變化不明顯，1∶8～1∶12（g∶mL）時(shí)有明顯增長(zhǎng)，1∶12～1∶16（g∶mL）時(shí)有小幅下降，其中在料液比為1∶12（g∶mL）時(shí)達(dá)到最大值，酶活為281.34 U/mL。原因?yàn)檫^大的料液比會(huì)稀釋酶的濃度，使單位體積提取液中酶活降低；而過低的料液比會(huì)導(dǎo)致綠豆核酸酶從綠豆芽中提取到緩沖溶液的速度緩慢。

2.1.3 pH對(duì)綠豆核酸酶提取的影響。由圖3可知，在其他提取條件相同時(shí)，用pH 4.0的0.2 mol/L醋酸鈉緩沖溶液提取時(shí)，酶活達(dá)到最大值，為273.42 U/ mL；酸度過高時(shí)酶活有一定幅度的下降，當(dāng)pH大于4.0時(shí)酶活有明顯下降。說明過酸和過堿的提取環(huán)境都會(huì)造成酶活力的下降。

2.1.4 芽長(zhǎng)對(duì)綠豆核酸酶提取的影響。

由圖 4可知，綠豆芽長(zhǎng)為綠豆5倍長(zhǎng)時(shí)酶活力達(dá)到最大值，為293.40 U/mL；當(dāng)綠豆芽長(zhǎng)小于綠豆5倍長(zhǎng)時(shí)，隨著長(zhǎng)度的增加酶活逐漸增加；在綠豆芽長(zhǎng)大于綠豆5倍芽長(zhǎng)時(shí)，隨著芽長(zhǎng)的增加酶活逐漸降低。

2.2 正交試驗(yàn)

綠豆核酸酶提取的正交試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)見表1，結(jié)果見表2。正交試驗(yàn)結(jié)果顯示，影響綠豆核酸酶提取因素的主次順序依次為提取時(shí)間、pH、料液比、芽長(zhǎng)，由k值分析得出的最優(yōu)組合為A3B3C2D2，由表2的直觀分析得出最優(yōu)組合為A3B3C1D2。綜合考慮，選取A3B3C1D2為最優(yōu)組合，即提取時(shí)間20 h，料液比1∶12（g∶mL），pH 3.0，芽長(zhǎng)為綠豆長(zhǎng)的4倍，此條件下綠豆核酸酶酶活為478.86 U/ mL。

2.3 綠豆核酸酶粗酶的提純

由圖5可知，在硫酸銨飽和度為80%時(shí)提純效果最好，酶活為1 569.6 U/mL ，酶活力較提純前提高了2.28倍。

3 結(jié)論

該試驗(yàn)以綠豆為材料，以綠豆核酸酶酶活為考察指標(biāo)，在以提取時(shí)間為單因素的試驗(yàn)中提取時(shí)間為20 h時(shí)，酶活最高為293.76 U/mL；在以料液比為單因素的試驗(yàn)中料液比為1∶12（g∶mL）時(shí)，酶活最高為281.34 U/mL；在以pH為單因素的試驗(yàn)中pH 4.0時(shí)，酶活最高為273.42 U/mL；在以芽長(zhǎng)為單因素的試驗(yàn)中芽長(zhǎng)為綠豆的5倍長(zhǎng)時(shí)，酶活最高為293.40 U/mL。通過正交試驗(yàn)結(jié)果分析得出最佳提取條件為提取時(shí)間20 h，料液比1∶12（g∶mL），pH 3.0，芽長(zhǎng)為綠豆的4倍長(zhǎng)，在最佳條件下得綠豆核酸酶粗酶液的酶活為478.86 U/mL。

在硫酸銨分級(jí)沉淀試驗(yàn)中，采用飽和度為80%的硫酸銨提純效果最好。綠豆核酸酶酶活為1 569.6 U/mL ，酶活力較提純前提高了2.28倍。

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