文狄 褚丹維 羅紹嬌 丁淑金 蒙幫明

摘要 [目的]從土壤中分離純化產(chǎn)高活性淀粉酶細(xì)菌，并研究其產(chǎn)酶條件。[方法]利用淀粉水解圈平板篩選法，從都勻市23份不同地點(diǎn)的土樣中分離并篩選到一株產(chǎn)胞外淀粉酶的菌株Z3，其水解圈/菌落直徑比達(dá)5.50；通過形態(tài)學(xué)、染色等方法，結(jié)合16S rDNA序列的比對(duì)鑒定該菌株為蠟狀芽孢桿菌（Bacillus cereus）。并對(duì)Z3菌株產(chǎn)酶條件進(jìn)行了研究。[結(jié)果]Z3菌株在1.0%淀粉的碳源、1.0%酵母膏+1.0%牛肉膏的氮源、0.2%的CaCl2·2H2O、30 mL裝液量于250 mL搖瓶中的溶氧量，pH為7.0，培養(yǎng)溫度為37 ℃的條件下，產(chǎn)酶能力最強(qiáng)。此外，Z3菌株所產(chǎn)淀粉酶的酶學(xué)分析顯示，其最適酶反應(yīng)pH為8.0，最適反應(yīng)溫度為39 ℃。[結(jié)論]該菌株是產(chǎn)淀粉酶較好的材料，具有一定的應(yīng)用前景。

關(guān)鍵詞 淀粉酶；水解圈；酶活力；產(chǎn)酶條件

中圖分類號(hào) S154.3 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2018）27-0006-04

Isolation and Purification of Bacteria Producing Highly Active Amylase in Soil

WEN Di，CHU Danwei，LUO Shaojiao et al

（College of Biological Science and Agriculture， Qiannan Normal University for Nationalities， Duyun， Guizhou 558000）

Abstract [Objective]Bacteria producing highly active amylase in soil was isolated and purificated，and enzyme production conditions were studied.[Method]Using starch hydrolysis circle model， a amylaseproducing strain Z3 was screened from 23 soil samples in Duyun. The hydrolysis circle/colony diameter ratio were 5.50； Z3 was identified as Bacillus cereus strain by the morphological observation， staining and 16S rDNA sequences alignment analysis. [Result]The optimum carbon source， nitrogen source， concentration of CaCl2·2H2O， dissolved oxygen， pH and temperature was 1% starch， 1% yeast extract+1% beef extract， 0.2% CaCl2·2H2O， adding 30 mL medium into 250 mL flask， pH 7.0 and 37 ℃respectively. Besides， the enzymatic analysis of Z3 amylase showed that its optimum pH and temperature was 80 and 39 ℃ respectively. [Conclusion]This study showed that Z3 strain was a good amylaseproducing material for the further industrial utilization.

Key words Amylase；Hydrolysis circle；Enzyme activity；Condition of enzyme production

基金項(xiàng)目 國家級(jí)“大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)計(jì)劃”（201610670040），貴州省教育廳普通高等學(xué)校創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目（黔教合人才團(tuán)隊(duì)字〔2015〕68），黔南民族師范學(xué)院一流培育學(xué)科建設(shè)項(xiàng)目（2017年生物學(xué)學(xué)科），貴州省教育廳本科教學(xué)工程項(xiàng)目（黔教高發(fā)（2015）337號(hào)）。

作者簡介 文狄（1985-），女，湖南湘鄉(xiāng)人，副教授，博士，從事昆蟲發(fā)育與遺傳研究。

收稿日期 2018-05-12；修回日期 2018-05-18

淀粉酶是一類具有生物催化功能并且可以分解淀粉分子的生物酶。淀粉酶廣泛存在于動(dòng)植物體以及各類微生物中，并且淀粉酶種類繁多，實(shí)用性強(qiáng)，可應(yīng)用于日常的工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、廢料的處理和微生態(tài)制劑等領(lǐng)域[1]。隨著科技的進(jìn)步和生活水平的提高，社會(huì)生產(chǎn)對(duì)于淀粉酶的需求日益增加，因此在淀粉酶生產(chǎn)的各個(gè)過程中，選擇適合的能產(chǎn)生高活性淀粉酶的菌株是我們進(jìn)行淀粉酶生產(chǎn)的關(guān)鍵[2]。該研究從土壤中分離純化出能產(chǎn)生高活性淀粉酶的菌株，并從不同碳源、氮源、溶氧量、CaCl2·2H2O濃度、溫度和pH等方面對(duì)其產(chǎn)酶條件進(jìn)行研究，通過對(duì)菌株產(chǎn)生的淀粉酶的酶學(xué)條件進(jìn)行分析和整理，以期獲得更經(jīng)濟(jì)、實(shí)用性更強(qiáng)的高活力淀粉酶[3]。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 土樣采集。

采取校園內(nèi)綠化草坪、花壇、小樹林、實(shí)驗(yàn)樓后山、都勻市郊外、菜園、河邊等不同生境的土樣共23份，量取5～10 cm深土層土壤，置于4 ℃的冰箱保存，作為篩選菌株的材料備用。

1.1.2 培養(yǎng)基。

（1）天然培養(yǎng)基：牛肉膏5 g/L，蛋白胨10 g/L，氯化鈉5 g/L，瓊脂粉15～20 g/L，可溶性淀粉10 g/L，蒸餾水1 000 mL，pH 7.0～7.2（用1 mol/L鹽酸或氫氧化鈉調(diào)節(jié)），121 ℃滅菌30 min。

（2）分離平板培養(yǎng)基：可溶性淀粉4 g/L，酵母膏5 g/L，蛋白胨5 g/L，NaCl 5 g/L，KH2PO4 1 g/L，瓊脂12 g/L，蒸餾水1 000 mL，pH 6.0，121 ℃滅菌30 min。

（3）種子培養(yǎng)基：可溶性淀粉10 g/L，酵母膏5 g/L，蛋白胨5 g/L，KH2PO4 2 g/L，水1 000 mL，pH 6.0，121 ℃滅菌30 min。

（4）產(chǎn)酶液體培養(yǎng)基：可溶性淀粉10 g/L，酵母膏10 g/L，蛋白胨10 g/L，氯化鈉5 g/L，KH2PO4 2 g/L，CaCl2·2H2O 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.05%，MgSO4·7H2O質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.05%，F(xiàn)eSO4·7H2O質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.05%，蒸餾水1 000 mL，pH 7.0，121 ℃滅菌30 min。

（5）碘液：碘 1 g，碘化鉀 2 g，加蒸餾水定容至300 mL。

（6）檸檬酸緩沖液，pH 6.0。

1.1.3 試驗(yàn)試劑。

試劑均為市售分析純生化試劑。

1.1.4 試驗(yàn)儀器。

自動(dòng)壓力蒸汽滅菌器（廈門致微儀器有限公司）；電熱恒溫干燥箱使用說明書（北京科偉永興儀器有限公司）；S系列超凈工作臺(tái)（適用：VS-840K、VS-840K-U、VS-13000L、VS-1300L-U、HS-840、 HS-840-U、HS1300、HS-1300-U。北京安泰空氣技術(shù)有限公司）；ZXDP系列曲線控制恒溫培養(yǎng)箱（上海智城分析儀器制造有限公司）；電冰箱（青島海爾股份有限公司）；HC-2517高速離心機(jī)（安徽中科科學(xué)儀器有限公司）冰箱。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌種篩選。

初篩：稱量5 g土樣，放入裝有45 mL無菌水的三角瓶里，搖床20 min使土樣分散均勻，靜置5 min后再進(jìn)行濃度梯度稀釋，分別用移液槍量取10-5、10-6、10-7 濃度下的土樣稀釋液1 mL于滅菌平板上[4-5]，并用玻璃涂布棒涂布均勻，凝固后置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。菌體生長后滴加碘液，若有透明圈出現(xiàn)，表明淀粉被水解，即該菌株能產(chǎn)生胞外淀粉酶。

純化：挑選有明顯水解圈的細(xì)菌，在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中劃線分離，37 ℃培養(yǎng)24 h；重復(fù)上述操作，直至產(chǎn)生單菌落。

復(fù)篩：將純化后的菌株轉(zhuǎn)接到試管斜面，37 ℃培養(yǎng)24 h分別再點(diǎn)種到分離培養(yǎng)基上培養(yǎng)，菌體長成后再滴加碘液并比較水解圈大小，挑選水解圈直徑（D）與菌落直徑（d）比值大于2.5的6株形態(tài)較好的菌落作為該試驗(yàn)的出發(fā)菌株，并記錄二者比值的大小。

1.2.2 淀粉酶活力測定。

發(fā)酵液在37 ℃、180 r/min培養(yǎng)24 h，5 000 r/min離心10 min后，取上清液即為粗酶液。

取5 mL 0.5%可溶性淀粉溶液，37 ℃水浴10 min，再加入0.5 mL適當(dāng)稀釋的粗酶液，混勻，37 ℃準(zhǔn)確反應(yīng)10 min后冰浴中終止反應(yīng)。與碘液作用顯色后測定在660 nm波長時(shí)的吸光度（A）值。測定結(jié)果根據(jù)淀粉標(biāo)準(zhǔn)曲線換算成淀粉濃度，以所測定條件下的最高活力為1，其他樣品用最高活力校正為相對(duì)酶活力[6]。

1.2.3 菌種鑒定。

根據(jù)《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》鑒定細(xì)胞形態(tài)。細(xì)菌分子學(xué)鑒定利用16S rDNA的序列比對(duì)，首先提取細(xì)菌總DNA[7]，用16S rDNA通用引物F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和 R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′PCR擴(kuò)增[3]；PCR擴(kuò)增條件為95 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，循環(huán)29次。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)DNA純化回收后，送上海生工生物工程股份有限公司測序。將16S rDNA測序結(jié)果在NCBI上進(jìn)行Blast，分析序列相似性，鑒定菌株種類。

1.2.4 不同碳源對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響。

取出發(fā)菌株活化后接入種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h，再按1%接種量接種到不同碳源配制的產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r/min培養(yǎng)24 h，取粗酶液離心并測酶活，以確定最適碳源。

1.2.5 不同氮源對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響。

取出發(fā)菌株活化后接入種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h，再按1%接種量接種種子到不同氮源配制的產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r/min培養(yǎng)24 h，取粗酶液離心并測酶活以確定最適氮源[8]。

1.2.6 培養(yǎng)基最適發(fā)酵pH的確定。

取出發(fā)菌株活化后接入種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h，再按1%接種量接種種子到pH為4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5和100的產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r/min培養(yǎng)24 h，取粗酶液離心并測酶活以確定最適初始pH[8]。

1.2.7 最適培養(yǎng)溫度的確定。

取出發(fā)菌株活化后接入種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h，再按1%接種量接種種子到產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，分別在27、29、31、33、35、37、39、41、43、45和47 ℃下培養(yǎng)24 h，取粗酶液離心并測酶活，以確定最適初始pH。

1.2.8 培養(yǎng)基溶氧量對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響。

取出發(fā)菌株活化后接入種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h，再按1%接種量接種種子到產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，分別裝入培養(yǎng)基20、25、30、35、40、45和50 mL于250 mL三角瓶，37 ℃、180 r/min培養(yǎng)24 h，取粗酶液離心并測酶活以確定最適溶氧量[8]。

1.2.9 CaCl2·2H2O濃度對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響。

向產(chǎn)酶培養(yǎng)基中加入質(zhì)量濃度依次為0%、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%和1.0%的CaCl2·2H2O，37 ℃、180 r/min培養(yǎng)24 h，取粗酶液離心并測酶活以確定最適CaCl2·2H2O濃度。

1.2.10 酶反應(yīng)最適pH的確定。

用pH為4.0、4.5、5.0、55、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5和10.0的檸檬酸緩沖溶液配制可溶性淀粉溶液，取粗酶液離心并在不同pH條件下測酶活，以確定酶反應(yīng)的最適pH[8]。

1.2.11 酶反應(yīng)最適溫度的確定。

取在已優(yōu)化條件下培養(yǎng)獲得的粗酶液離心，在27、29、31、33、35、37、39、41、43、45和47 ℃不同溫度下測酶活，以確定酶反應(yīng)的最適溫度。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)胞外淀粉酶的初篩

從所有土樣中共篩選到44株能水解淀粉的細(xì)菌，在篩選平板上均能產(chǎn)生明顯的水解圈，分別將這44株細(xì)菌編號(hào)Z1～Z44，并接種到斜面試管培養(yǎng)后低溫保存[8]。其中Z3菌株在平板上產(chǎn)生的水解圈如圖1所示。

2.2 產(chǎn)胞外淀粉酶的復(fù)篩

將所有純化后的菌種分別點(diǎn)種培養(yǎng)，再向菌落上噴灑碘液，比較水解圈的大小，挑取水解圈直徑（D）與菌落直徑（d）比值大于2.50的6株菌株（表1）進(jìn)行3次點(diǎn)種培養(yǎng)，選擇直徑比最大的Z3菌株作為出發(fā)菌株[9]。菌株在平板上產(chǎn)生的水解圈如圖1所示。

2.3 Z3菌株的鑒定

2.3.1 Z3菌株的形態(tài)學(xué)鑒定。Z3菌株革蘭氏陽性，細(xì)胞呈桿狀，無莢膜，有明顯的芽孢（圖2、3）。

2.3.2 Z3菌株的分子學(xué)鑒定。

16S rDNA 序列是細(xì)菌鑒定的重要指標(biāo)，利用PCR擴(kuò)增Z3菌株的16S rDNA序列，并用NCBI的Blast進(jìn)行核苷酸同源性比對(duì)，結(jié)果表明Z3菌株為蠟狀芽胞桿菌（Bacillus cereus）。

2.4 液體發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

為優(yōu)化發(fā)酵條件，對(duì)Z3菌株的發(fā)酵培養(yǎng)基碳源、氮源的種類、發(fā)酵培養(yǎng)基的初始pH、發(fā)酵溫度、溶氧量和Ca2+進(jìn)行考察，以確定Z3菌株的最佳產(chǎn)酶條件。

2.4.1 碳源對(duì)Z3菌株產(chǎn)酶的影響。

以1%蛋白胨為氮源，用不同碳源配制產(chǎn)酶液體培養(yǎng)基培養(yǎng)菌株Z3，37 ℃、180 r/min培養(yǎng)24 h，取粗酶液離心并測酶活。結(jié)果如圖4所示，以質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的可溶性淀粉作為碳源時(shí)，Z3菌株酶活力最高，定義為1，相對(duì)酶活從高到低，依次是1%麥芽糖、1%乳糖、1%蔗糖、1%葡萄糖，相對(duì)酶活分別為0.84、0.81、078、076。

2.4.2 氮源對(duì)Z3菌株產(chǎn)酶的影響。

以1%可溶性淀粉為碳源，用不同氮源配制產(chǎn)酶液體培養(yǎng)基培養(yǎng)菌株Z3，37 ℃、180 r/min培養(yǎng)24 h，取粗酶液離心并測酶活[9]。結(jié)果如圖5所示，以1%酵母膏+1%牛肉膏作為氮源時(shí)菌株Z3酶活力最高。

2.4.3 溶氧量對(duì)Z3菌株產(chǎn)酶的影響。

在不同的溶氧條件下培養(yǎng)Z3菌株，37 ℃、180 r/min培養(yǎng)24 h，取粗酶液離心并測定不同溶氧條件下的酶活。結(jié)果如圖6所示，250 mL搖瓶中裝液量為30 mL時(shí)為最佳溶氧量，其后依次為裝液量為50、40、45、35、25、20 mL。整體趨勢為隨著裝液量的增加，單位體積的粗酶液相對(duì)酶活力逐漸增大，當(dāng)裝液量達(dá)到30 mL/250 mL時(shí)酶活力達(dá)到峰值，然后稍有下降，并趨于平穩(wěn)。

2.4.4 CaCl2·2H2O濃度對(duì)Z3菌株產(chǎn)酶的影響。

向產(chǎn)酶培養(yǎng)基中加入不同質(zhì)量濃度的CaCl2·2H2O，對(duì)Z3菌株進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)酶試驗(yàn)，然后進(jìn)行粗酶液酶活測定。結(jié)果圖7所示，隨著CaCl2·2H2O濃度的增加，Z3菌株產(chǎn)酶相對(duì)活力逐漸升高，到達(dá)峰值之后，稍有下降，其后趨于穩(wěn)定，其中當(dāng)CaCl2·2H2O濃度為0.2%時(shí)，單位體積粗酶液相對(duì)酶活最高，其后依次是0.6%、0.4%、1.0%、0.8%、0%，其相對(duì)酶活分別為087、0.82、0.81、0.77、0.61。

2.4.5 培養(yǎng)基初始pH對(duì)Z3菌株產(chǎn)酶的影響。

將已優(yōu)化的產(chǎn)酶培養(yǎng)基pH設(shè)置為4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0，接種Z3菌株，37 ℃、180 r/min培養(yǎng)24 h，測定以上pH情況下Z3菌株產(chǎn)淀粉酶的相對(duì)酶活力，結(jié)果如圖8所示。當(dāng)pH范圍從4.0逐漸增大到7.0時(shí)，Z3菌株粗酶液相對(duì)酶活力逐漸增加；當(dāng)pH達(dá)到7.0時(shí)，相對(duì)酶活力達(dá)到峰值；當(dāng)pH繼續(xù)增加，從7.0到10.0時(shí)，Z3菌株粗酶液相對(duì)酶活力逐漸降低。以上數(shù)據(jù)表明，Z3菌株發(fā)酵最佳pH為7.0，呈中性。

2.4.6 培養(yǎng)溫度對(duì)Z3菌株產(chǎn)酶的影響。

將Z3菌株置于27、29、31、33、35、37、39、41、43、45和47 ℃溫度下培養(yǎng)，180 r/min培養(yǎng)24 h，測定不同溫度培養(yǎng)條件下Z3菌株粗酶液的酶活力，結(jié)果如圖9所示。當(dāng)溫度從27 ℃上升到37 ℃時(shí)，Z3菌株粗酶液的相對(duì)酶活力逐漸增強(qiáng)；培養(yǎng)溫度在37 ℃，Z3菌株粗酶液的相對(duì)酶活力最高。當(dāng)溫度從37 ℃繼續(xù)上升到47 ℃時(shí)，Z3菌株粗酶液的相對(duì)酶活力逐漸減小；試驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，Z3菌株發(fā)酵最適溫度為37 ℃。

2.5 Z3菌株所產(chǎn)淀粉酶的酶學(xué)性質(zhì)

2.5.1 酶反應(yīng)的最適pH。

將Z3菌株在產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，37 ℃，180 r/min培養(yǎng)24 h，再用pH為4.0、4.5、5.0、5.5、60、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0的檸檬酸緩沖液配制可溶性淀粉溶液，取粗酶液離心并測相對(duì)酶活。結(jié)果如圖10所示，當(dāng)酶反應(yīng)的pH在4.0到8.0范圍內(nèi)，隨pH的升高，相對(duì)酶活力逐漸增強(qiáng)；在pH為8.0時(shí)，Z3菌株淀粉酶相對(duì)酶活力達(dá)到峰值；當(dāng)酶反應(yīng)的pH在8.0～10.0范圍內(nèi)，隨pH的繼續(xù)上升，相對(duì)酶活力逐漸減弱；以上數(shù)據(jù)表明，Z3菌株所產(chǎn)淀粉酶為偏堿性淀粉酶。

2.5.2 酶反應(yīng)的最適溫度。

將Z3菌株在37 ℃、180 r/min培養(yǎng)24 h，分別在27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47 ℃不同溫度下測菌株Z3所產(chǎn)胞外淀粉酶的相對(duì)酶活力。結(jié)果如圖11所示，在27～39 ℃時(shí)，隨反應(yīng)溫度的升高，相對(duì)酶活逐漸增強(qiáng)；當(dāng)反應(yīng)溫度在39 ℃時(shí)，相對(duì)酶活最高；在39～47 ℃時(shí)，隨反應(yīng)溫度的升高，相對(duì)酶活力逐漸減弱。數(shù)據(jù)表明，Z3所產(chǎn)胞外淀粉酶最佳反應(yīng)溫度為39 ℃。

3 結(jié)論與討論

該研究通過淀粉水解圈平板篩選法，從都勻市不同地點(diǎn)采集到23份土樣中，分離到44株產(chǎn)胞外淀粉酶的細(xì)菌，并通過復(fù)篩從6株水解圈/菌落直徑比相對(duì)較大的菌株中篩選得到一株產(chǎn)淀粉酶活力較高的菌株Z3，其水解圈/菌落直徑比達(dá)5.5。通過檢測相對(duì)酶活力，對(duì)Z3菌株產(chǎn)酶條件進(jìn)行研究，結(jié)果顯示：培養(yǎng)基Z3菌株產(chǎn)酶最適碳源為1.0%淀粉；氮源

為1.0%酵母膏+1.0%牛肉膏；最適溶氧量為250 mL搖瓶裝30 mL培養(yǎng)基；最適CaCl2·2H2O濃度為0.2%的CaCl2·2H2O；最佳培養(yǎng)基pH為7.0；培養(yǎng)最佳溫度為37 ℃。此外，該研究還對(duì)菌株Z3所產(chǎn)淀粉酶的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行初步研究，數(shù)據(jù)顯示其最適酶反應(yīng)pH為8.0，但在pH 10.0的強(qiáng)堿性環(huán)境仍具有相對(duì)較高的酶活；其最適酶反應(yīng)溫度為39 ℃，且在27～47 ℃的較寬溫度條件下均具有一定酶活，表明Z3菌株

所產(chǎn)淀粉酶為偏堿性且適溫性較廣，可以作為工業(yè)生產(chǎn)進(jìn)一步開發(fā)利用。

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