鄧治 金志強 劉輝 楊洪 代龍軍 李德軍

摘 要 肌動蛋白解聚因子（Actin Depolymerizing Factor，ADF）是一種重要的肌動蛋白結合蛋白。ADF通過參與調控肌動蛋白的裝配和解聚在多種生理過程中發(fā)揮重要作用。本研究通過RT-PCR技術從橡膠樹膠乳中獲得HbADF6基因的cDNA和基因組序列，序列分析顯示HbADF6基因的開放閱讀框為441 bp，共編碼146個氨基酸，基因組序列由2個內含子和3個外顯子組成。實時熒光定量PCR結果表明，HbADF6基因在所有檢測組織中均表達，其中樹皮中表達量最高，葉片中表達量最低。HbADF6基因的表達受乙烯利（ET）和碘化鉀（KI）調控，并與排膠時間和死皮有關。此結果表明HbADF6基因可能在橡膠樹乙烯響應、死皮和排膠過程中發(fā)揮重要作用。

關鍵詞 肌動蛋白解聚因子；巴西橡膠樹；排膠；表達分析

中圖分類號 S794.1 文獻標識碼 A

Abstract Actin depolymerizing factor （ADF） is an important class of actin binding proteins. ADF is involved in regulating actin assembly and disassembly and plays an important role in several physiology process. In this study， the cDNA and genomic sequence of HbADF6 were isolated from H. brasiliensis by RT-PCR. Sequence analysis showed that the open reading frame sequence of HbADF6 was 441 bp in length， which encoding 149 amino acids. The genomic sequence contained two introns and three exons. Quantitative real-time PCR results showed that HbADF6 expressed in all test tissues， with the highest expression in barks and lowest expression in leaves. HbADF6 expression was regulated by ethylene （ET） and potassium iodide （KI）. In addition， HbADF6 expression associated with latex flow time and tapping panel dryness （TPD）. The results suggest that HbADF6 may play important roles in ethylene resposnse， TPD and latex flow in Hevea brasiliensis.

Key words actin depolymerizing factor； Hevea brasiliensis； latex flow； expression analysis

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2018.05.011

作為細胞骨架中微絲的主要組成成分，肌動蛋白廣泛存在于所有真核細胞中。它參與很多重要的細胞過程，如囊泡運輸、細胞器運動和重排、胞質運動和頂端生長等[1]。大量的肌動蛋白結合蛋白直接調控肌動蛋白動態(tài)結構，使其呈高度有序的狀態(tài)。肌動蛋白解聚因子（Actin Depolymerizing Factor，ADF）是真核生物中重要的肌動蛋白結合蛋白，由多基因家族成員組成，蛋白分子量在13～19 ku之間[2]。典型的ADF家族成員能結合球形肌動蛋白（G-肌動蛋白）和纖絲型肌動蛋白（F-肌動蛋白），切割F-肌動蛋白為小片段，從而提供新的肌動蛋白絲起始位點，增加肌動蛋白單體在肌動蛋白絲末端的解離速度，為F-肌動蛋白正端聚合提供更多單體，從而提高肌動蛋白聚合及解聚的動態(tài)變化[3]。1993年Kim等[4]從百合中分離到植物ADF基因，隨后在苔蘚、水稻、擬南芥、小麥、巴西橡膠樹等植物中都鑒定到ADF基因。ADF基因在植物生長和發(fā)育過程中發(fā)揮著重要作用。擬南芥中過表達GhADF7基因引起花粉粒存活率下降，減慢花粉管的生長，轉基因植株部分雄性不育[5]。GhADF1基因下調表達改變細胞壁的形態(tài)和延長纖維細胞的長度[6]。黑暗條件下擬南芥adf4突變體幼苗胚軸和根均長于野生型[7]。此外，ADF基因還與脅迫響應有關。小麥TaADF4基因通過調節(jié)肌動蛋白細胞骨架正調控小麥植物免疫反應[8]。異源過表達OsADF3基因能提高擬南芥對甘露醇和干旱脅迫的抗性[9]。adf4突變后顯著提高擬南芥對白粉病的抗性，敲減第I亞類的ADFs（ADF1-4Ri）后該抗性得到進一步增強[10]。

巴西橡膠樹（簡稱橡膠樹）是一種重要的熱帶經濟林木。割膠產生的膠乳作為橡膠樹的次生代謝產物，是天然橡膠最主要的來源。橡膠樹排膠時間是影響膠乳產量的關鍵因素之一，乳管傷口堵塞物的形成決定著排膠時間。已有研究結果發(fā)現，隨著排膠的進程，橡膠樹乳管傷口末端逐漸形成“蛋白質網”結構[11-12]。膠乳中肌動蛋白含量逐漸減少，乳管傷口末端“蛋白質網”的形成與肌動蛋白聚集同時發(fā)生[13-14]。推測肌動蛋白微絲骨架在“蛋白質網”的形成過程中可能發(fā)揮著重要作用，從而影響橡膠樹乳管傷口堵塞物的形成[15]。根據上述結果筆者推測橡膠樹ADF可能通過調節(jié)肌動蛋白動態(tài)變化在乳管堵塞過程中發(fā)揮作用。此前，本項目組克隆了橡膠樹膠乳ADF家族基因中的1個成員HbADF[16]，研究發(fā)現HbADF表達與橡膠樹排膠和死皮相關[17]。本研究克隆橡膠樹膠乳中另一個ADF家族成員HbADF6基因的cDNA和基因組序列，對其表達模式和系統(tǒng)進化關系進行分析。為進一步研究HbADF6基因的生物學功能奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究所用橡膠樹（Hevea brasiliensis Muell. Arg.）均種植于中國熱帶農業(yè)科學院試驗農場。選取10 a割齡的橡膠樹品系PR107為實驗樹，采集不同死皮（Tapping Panel Dryness， TPD）等級橡膠樹膠乳樣品。采集開割橡膠樹品系熱研7-33-97的膠乳、葉片、樹皮、雌花和雄花作為組織樣品。選取未開割的橡膠樹品系熱研7-33-97幼樹，分別用1%乙烯利（ET）和3%碘化鉀（KI）對割面上下2 cm進行處理，KI處理后用黑色塑料布對處理部位進行包裹使其避光。分別于ET處理后0、4、8、24、48、72 h采集膠乳，KI處理后0、6、24、48 h采集膠乳。選取3 a割齡的橡膠樹品系熱研7-33-97為材料，進行1% ET處理，采集割膠后5 min以內、5 min后至35 min、35 min后至停止排膠3個時間段的膠乳，分別記為T1、T2和T3，采集相應時間段不作處理的橡膠樹膠乳作為對照。

通用植物總RNA提取試劑盒購自北京百泰克生物技術有限公司，PrimeScriptTM RT reagent kit with gDNA eraser、PyrobestTM DNA聚合酶、T4 DNA連接酶、pMD18-T載體和DNA Markers等購自大連寶生物公司，SMARTTM RACE cDNA amplification kit購自Clontech公司，2×Es Taq MasterMix聚合酶購自北京康為世紀公司。大腸桿菌DH5α為本室保存。引物合成和測序由上海生工生物工程技術服務有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 橡膠樹RNA和DNA的提取 按照RNA提取試劑盒說明書步驟提取橡膠樹各組織和各處理RNA。根據反轉錄試劑盒說明書步驟去除基因組DNA后進行cDNA第1鏈的合成。橡膠樹葉片基因組DNA提取參照安澤偉等[18]的方法進行。

1.2.2 巴西橡膠樹HbADF6基因序列克隆與分析 根據橡膠樹樹皮轉錄組測序獲得的序列Unigene22074（GenBank登錄號：JR366254）設計特異引物HbADF6F： 5'-TGAAGCTGCTTCTCTTCATTC-3'和HbADF6R： 5'-GGATTTGTCTCCCCTGAGG-3'，以橡膠樹熱研7-33-97膠乳cDNA為模板擴增ORF序列。根據Unigene22074序列設計3'RACE引物HbADF6-3R-GSP：5'-CAACATCTCGAATCCGAGCCA-3'和HbADF6-3R-NSP：5'-CTCTACAGAGATGGATCTTGAAG-3'，以熱研7-33-97膠乳RNA為模板，按照試劑盒說明書擴增3'非翻譯區(qū)。用Unigene22074序列在NCBI網站進行blastn比對，結果比對到橡膠樹熱研7-33-97基因組序列scaffold0706（GenBank登錄號：LVXX01000706），利用引物HbADF6F與HbADF6R搭配，以橡膠樹熱研7-33-97基因組DNA為模板進行基因組序列擴增。PCR產物回收純化后與pMD18-T載體進行連接，連接產物轉化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，鑒定為陽性的克隆送公司測序。

1.2.3 HbADF6基因序列生物信息學分析 利用NCBI的ORF finder查找HbADF6基因的開放閱讀框；利用在線軟件ProtParam （http：//web.expasy.org/protparam/）對HbADF6基因編碼蛋白的理化性質進行預測；利用ScanProsite工具（http：//prosite.expasy.org/scanprosite/）分析HbADF6基因編碼蛋白序列保守結構域；利用SignalP 4.1 Server （http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）和TMHMM Server V. 2.0 （http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）對HbADF6基因編碼蛋白序列進行信號肽和跨膜域預測；通過在線工具PSORT （http：//psort.hgc.jp/form.html）預測HbADF6基因編碼蛋白的亞細胞定位；在NCBI網站選用blastx比對同源序列，采用ClustalX 2.1進行多序列比對，采用MEGA5鄰接法構建系統(tǒng)進化樹；利用NCBI中Splign在線工具對HbADF6基因的OFR序列和基因組序列進行比對，確定HbADF6基因內含子和外顯子的位置。

1.2.4 HbADF6基因表達分析 采用實時熒光定量PCR對HbADF6基因表達模式進行分析。根據HbADF6基因的cDNA序列設計特異引物HbADF6-qF： 5'-GACAGGTTCAGAAGGGAGCT-3'，并與HbADF6R引物搭配，以各處理和各組織cDNA為模板進行擴增。選用橡膠樹18S rRNA基因（GenBank登錄號：AB268099）為內參，設計特異引物Hb18S-qF：5'-GCTCGAAGACGATCAGATACC-3'和Hb18S-qR：5'-TTCAGCCTTGCGACCATAC-3'對相應模板進行擴增。擴增條件：95 ℃預變性30 s；95 ℃ 變性5 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸s，共40個循環(huán)。相對表達量用2-ΔΔCt法計算。

1.3 數據分析

試驗所得數據采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計分析。

2 結果與分析

2.1 HbADF6基因的cDNA序列獲得及分析

通過分析橡膠樹的樹皮轉錄組數據，結果發(fā)現Unigene22074序列比對到植物ADF基因。為驗證膠乳中該基因序列的正確性，通過RT-PCR和RACE技術獲得橡膠樹膠乳中該基因的cDNA序列。序列分析顯示該cDNA長999 bp，含有一個441 bp的開放閱讀框，編碼146個氨基酸，5'端非翻譯區(qū)為177 bp，3'端非翻譯區(qū)為381 bp，含有典型的真核生物加尾信號AATAAA和poly （A）尾，3'非翻譯區(qū)與Unigene22074序列有4 bp差異。blastx比對結果顯示，該基因翻譯的氨基酸序列與木薯、麻風樹、蓖麻、可可和木豆等植物ADF蛋白具有較高同源性（圖1）。與毛果楊和擬南芥ADF6的一致性分別為92%和84%，因此將該基因命名為HbADF6。預測HbADF6基因編碼蛋白分子量為16.88 ku，理論等電點為7.75。序列分析結果表明，HbADF6基因編碼蛋白不具有信號肽和跨膜結構域，主要定位于細胞核，其中14～146位氨基酸序列為ADF-H結構域。

蛋白序列GenBank登錄號分別為：木薯（OAY32632）、麻風樹（NP_001294893）、蓖麻（XP_002524620）、擬南芥（NP_565719）、毛果楊（XP_002300779）、葡萄（XP_002285175）、可可（XP_007050307）、亞洲棉（XP_017623211）、木豆（XP_020212020）、小豆（XP_017442970）、桃（XP_007201857）、梅花（XP_008235687）。2.2 HbADF6基因組序列的獲得及分析

以DNA為模板擴增得到1 680 bp的HbADF6基因組序列，與HbADF6 ORF比對后發(fā)現該序列包含3個外顯子和2個內含子。3個外顯子大小分別為24、266、151 bp，依次位于DNA序列（以起始密碼子ATG為第1位）的1～24、588～853、1530～1 680位。2個內含子大小分別為563、676 bp（圖2）。內/外顯子剪接位點均符合GT/AG模式。

2.3 HbADF6蛋白系統(tǒng)進化分析

選取與HbADF6蛋白同源的15個ADF蛋白進行系統(tǒng)進化分析。結果表明，單子葉植物水稻（Q7XSN9）和谷子（KQK98402）的ADF蛋白聚為一組，雙子葉植物橡膠樹、木薯、毛果楊、擬南芥和葡萄等的ADF蛋白聚為一組（圖3）。HbADF6蛋白屬于雙子葉植物亞類，與同屬大戟科的木薯、蓖麻和麻風樹親緣關系最近。

2.4 HbADF6基因表達模式分析

實時熒光定量分析結果表明，HbADF6基因在所有檢測組織中均表達，表達豐度由高到低分別為樹皮、雌花、雄花、膠乳和葉片（圖4-A）。與健康樹相比，死皮橡膠樹膠乳中HbADF6基因下調表達，其中5級死皮樹膠乳中HbADF6基因的表達量最低（圖4-B）。KI處理后膠乳中HbADF6基因的表達量逐漸升高，24 h達到最高，約為0 h表達量的4.64倍，隨后降低（圖4-C）。ET處理后膠乳中HbADF6基因表達模式與KI處理類似，同樣為先升高后降低趨勢。最高表達量出現在處理后48 h，約為0 h表達量的4.96倍（圖4-D）。隨著排膠時間的延長，對照膠乳中HbADF6基因的表達量逐漸下調，T3時段采集的膠乳中HbADF6基因的表達量最低。在整個排膠進程中，ET處理后的膠乳中HbADF6基因的表達量均高于對照，其中T2時段收集的膠乳中HbADF6基因的表達量最高，隨后下調（圖4-E）。

3 討論

植物ADF基因的內含子數量和位置相對保守。擬南芥中的11個ADF基因均含有2個內含子和3個外顯子。Nan等[19]將之分為4個亞類，其中第I和II亞類中的8個擬南芥ADF基因的第1個內含子緊鄰ATG，第III和IV亞類的AtADF5、AtADF6和AtADF9基因的第1個外顯子更長。值得注意的是，擬南芥第1個內含子含有假定的增強子基序，能影響基因轉錄表

達[20-21]。本研究獲得的HbADF6與AtADF6基因序列一致性高達84%，同樣具有2個內含子和3個外顯子，兩者的第1個外顯子均為24 bp。根據ADF第1內含子的保守功能，推測HbADF6基因的第1內含子可能影響基因轉錄表達。與之前本項目組獲得的HbADF基因序列[16]進行比較分析，結果發(fā)現HbADF6與HbADF基因的ORF序列及其推導的氨基酸序列一致性分別為64.17%和65.07%。HbADF基因也具有2個內含子和3個外顯子，但第1個內含子位置與第I和II亞類中擬南芥ADF的第1個內含子位置一樣緊鄰ATG[17]。說明HbADF6與HbADF基因可能分屬橡膠樹ADF基因家族的不同亞類。Nan等[19]研究發(fā)現ADF可分為D-型活性（解聚F-肌動蛋白）和B-型活性（結合F-肌動蛋白），擬南芥AtADF6屬于D-型活性。根據ADF功能的保守性，推測橡膠樹HbADF6可能也屬于D-型活性ADF，在橡膠樹中主要執(zhí)行解聚F-肌動蛋白功能。

死皮樹割面乳管部分或全部堵塞，排膠量下降或完全停止排膠。實時熒光定量結果顯示，與健康樹相比，死皮樹膠乳中HbADF6基因下調，其中5級死皮樹中表達量最低。死皮樹中HbADF6基因下調可能引起F-肌動蛋白解聚減少，促進“蛋白質網”形成，加快乳管堵塞，縮短排膠時間，防止膠乳過度流失。肌動蛋白微絲解聚劑KI調控膠乳中HbADF6基因表達，說明HbADF6基因可能參與KI解聚微絲的過程。5% KI引起橡膠樹死皮[13]，進一步說明HbADF6基因可能通過參與微絲解聚在橡膠樹死皮過程中發(fā)揮作用。值得注意的是，膠乳中HbADF6與HbADF基因在不同死皮等級和KI處理條件下表達模式類似，說明HbADF6與HbADF基因可能通過解聚微絲在橡膠樹死皮中發(fā)揮冗余功能。但HbADF6基因在2級死皮樹膠乳中的表達量高于4級死皮樹，而HbADF基因在2級死皮樹膠乳中的表達量低于4級死皮樹[17]。

ET作為生產中常用的增產刺激劑，能明顯延長排膠時間[22]。ET處理后膠乳中HbADF6基因逐漸上調，直至處理72 h開始下調。這可能是ET誘導HbADF6基因上調表達，導致F-肌動蛋白解聚增加，延緩乳管傷口末端“蛋白質網”形成，從而延長排膠時間。鄧順楠[14]研究發(fā)現未處理對照和ET處理的橡膠樹膠乳中肌動蛋白含量隨著排膠進程均呈逐漸減少的趨勢，但ET處理的橡膠樹膠乳中肌動蛋白排出總量高于對照，整個排膠進程中ET處理的橡膠樹乳管傷口處蛋白質聚集量明顯低于對照。高政權等[13]通過羅丹明-鬼筆環(huán)肽染色法、鄧順楠[14]通過肌動蛋白免疫熒光定位法均發(fā)現割膠后肌動蛋白在乳管傷口末端逐漸聚集，推測膠乳中肌動蛋白可能在排膠過程中被逐漸截留在乳管傷口處。本研究結果發(fā)現在整個排膠進程中，ET處理的橡膠樹膠乳中HbADF6基因表達量均高于對照，說明在排膠過程中ET可能通過誘導HbADF6基因來增加膠乳中F-肌動蛋白解聚活性，從而推遲“蛋白質網”形成，使得ET處理橡膠膠樹排膠時間延長，導致膠乳中肌動蛋白排出量高于對照。值得注意的是，雖然ET處理誘導T2時段收集的膠乳中HbADF6基因上調表達，但T3時段HbADF6基因表達量下調。說明在整個排膠進程中ET并未一直誘導HbADF6基因上調表達，這可能是橡膠樹為阻止乳管細胞成分過度流失和保障正常的膠乳再生能力，通過降低F-肌動蛋白解聚活性，促進“蛋白質網”形成以封閉乳管傷口，從而保護自身正常生長。

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