陽江華 龍翔宇 秦云霞 唐朝榮

摘 要 葉綠體內(nèi)的淀粉是植物光合作用產(chǎn)物的重要臨時儲存形式，這些淀粉的降解需要β-淀粉酶（BAM）。β-淀粉酶基因是一個多基因家族，分別在不同組織中起著不同的作用，葉綠體β-淀粉酶在葉綠體淀粉降解過程中起著關鍵作用。利用橡膠樹的轉(zhuǎn)錄組和基因組數(shù)據(jù)庫，通過RT-PCR的方法獲得一個橡膠樹BAM基因，命名為HbBAM1。利用實時熒光定量PCR分析其在葉片中的表達模式，通過原核表達獲得其重組蛋白，并分析其酶活性特點。同源性分析和亞細胞預測分析結(jié)果表明，HbBAM1定位于葉綠體中；HbBAM1原核表達產(chǎn)物的最適酶活性溫度是35 ℃，其酶活性受到氧化型谷胱甘肽和雙氧水等氧化劑的抑制。HbBAM1基因主要在橡膠樹的花和葉片中表達；HbBAM1基因隨著葉片的發(fā)育進程表達量逐漸增加，在淡綠期和穩(wěn)定期葉片中表達量最大；HbBAM1基因在成熟葉片中的表達呈現(xiàn)明顯的晝夜差異，在光合作用最強的上午10：00和下午16：00的表達量最大，晚上的表達量最低。上述結(jié)果表明，HbBAM1可能參與橡膠樹葉片葉綠體內(nèi)淀粉的降解，控制葉片氣孔的開放與關閉，從而調(diào)控橡膠樹葉片的光合作用。

關鍵詞 巴西橡膠樹；β-淀粉酶；HbBAM1；葉綠體

中圖分類號 S794.1 文獻標識碼 A

Abstract In chloroplast，starch is an important temporary storage form of photosynthetic products， and the degradation of the starch requires β-amylase（BAM）activity. β-amylase is a multi-gene family， which has different functions in different tissues. Plastic β-amylase plays a key role in starch degradation in chloroplast. Based on the transcriptome and genome data，an β-amylase gene， HbBAM1 was cloned by RT-PCR from Hevea brasiliensis. Real time RT-PCR（qRT-PCR）was used to characterize the expression pattern of HbBAM1 in the leaves. The recombinant protein of HbBAM1 was obtained by prokaryotic expression， and the characteristics of the enzyme activity was analyzed. HbBAM1 located in the chloroplast based on homology analysis and subcellular prediction. The optimum enzyme temperature of HbBAM1 was 35 ℃， the enzyme was suppressed by oxidant，oxidized glutathione and hydrogen peroxide. HbBAM1 was mainly expressed in the flowers and leaves. The expression of HbBAM1 was gradually increased in the leaf development process，peaked at the light green and stable stages. HbBAM1 displayed obvious circadian variations in the stable leaves，which had the highest expression level during the strongest photosynthesis time-10 oclock and 16 oclock， the lowest at night. It was presumed that HbBAM1 maight participate in the starch degradation in the chloroplast of H. brasiliensis，control the open and close of the stomas，regulates the photosynthesis of H. brasiliensis.

Key words Hevea brasiliensis； β-amylase； HbBAM1； chloroplast

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2018.04.015

植物葉肉細胞的葉綠體、種子和塊莖等淀粉貯藏器官中均含有豐富的淀粉。β-淀粉酶（β-amylase，BAM）通過水解α-1，4-葡聚糖鏈，從淀粉的非還原性末端逐次以麥芽糖為單位切斷，產(chǎn)生麥芽糖[1]。早期對β-淀粉酶的研究主要集中在長期存儲淀粉的農(nóng)作物種子或者塊莖的農(nóng)作物，如大麥、甘薯和大豆[2-4]。近年來，研究重點才轉(zhuǎn)向研究β-淀粉酶在植物葉片淀粉代謝中的作用及β-淀粉酶在植物面臨各種環(huán)境脅迫時的作用[5-6]。

在植物葉片淀粉的分解過程中，α-淀粉酶起著次要作用[7]，而植物β-淀粉酶起著關鍵作用[8-10]。β-淀粉酶是多基因家族，在擬南芥中有9個BAM基因，分為4個亞類，BAM1和BAM3是主要的負責淀粉降解的β-淀粉酶基因。在未開花的擬南芥幼嫩葉片中，BAM1主要在保衛(wèi)細胞中表達，在白天通過降解淀粉，開啟氣孔[11]。BAM1的突變體bam1，其保衛(wèi)細胞中含有更多的淀粉，減少氣孔的打開，提高了bam1對滲透脅迫和干旱脅迫的耐受能力[11-12]。BAM3主要在晚上起作用，通過降解淀粉生成麥芽糖，為晚上植物的生長提供碳源。寒冷脅迫會上調(diào)擬南芥AtBAM3基因的表達[10]。在國內(nèi)，Peng等[13]研究了枳樹中擬南芥AtBAM3的同源基因PtrBAM1，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PtrBAM1基因的表達受到CBF轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控，通過提高可溶性糖的含量，提高了枳樹的耐寒能力。擬南芥的BAM4雖然沒有β-淀粉酶活性，但其缺失突變體bam4的葉片淀粉降解受到抑制，其淀粉含量比野生型更高，BAM4可能以獨立于BAM1和BAM3的途徑，促進或者調(diào)控擬南芥的淀粉降解[14]。

本研究利用橡膠樹轉(zhuǎn)錄組和基因組數(shù)據(jù)庫，從橡膠樹中獲得一個擬南芥AtBAM1的同源基因HbBAM1，分析HbBAM1基因在同一天內(nèi)不同時間點的表達變化，確定HbBAM1原核表達產(chǎn)物的最適酶活性溫度，以及不同氧化劑對其酶活性的抑制作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 巴西橡膠樹，定植于中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院試驗場3隊，品系為熱研7-33-97。

1.1.2 試劑和菌種 PCR產(chǎn)物克隆用的T載體為大連寶生物公司的pMD18-T，Taq DNA聚合酶和熒光定量試劑TransStart Tip Green qPCR SuperMix為北京全式金生物技術有限公司產(chǎn)品，蛋白預染marker、限制性核酸內(nèi)切酶、反轉(zhuǎn)錄試劑盒為美國Thermo Scientific公司產(chǎn)品。DNA凝膠回收試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒為美國Omega公司產(chǎn)品。通用植物總RNA提取試劑盒為北京百泰克生物技術有限公司產(chǎn)品。原核表達載體pGEX-4T-1和pET43.1a，大腸桿菌菌種Top10和BL21（DE3），為本實驗室保存。引物由上海英俊生物技術公司合成，DNA測序在上海生工生物工程有限公司完成?？扇苄缘矸蹫镾igma公司產(chǎn)品，其它生化試劑為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 材料預處理 7個不同組織的實驗材料采自10年生、開割3 a的未進行乙烯利刺激割膠的橡膠樹。不同時間點的葉片取自定植4 a的橡膠樹的成熟期葉片的葉肉部分，以3株橡膠樹的葉片混合為1個實驗重復，共3個實驗重復。

1.2.2 總RNA的提取及cDNA第一鏈的合成 巴西橡膠樹不同組織的總RNA的提取，使用百泰克公司的通用植物總RNA提取試劑盒，方法參照說明書。cDNA第一鏈的合成使用Thermo Scientific公司的RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit，操作步驟依照產(chǎn)品說明書進行。

1.2.3 HbBAM1基因的克隆 通過搜索巴西橡膠樹的轉(zhuǎn)錄組和基因組數(shù)據(jù)庫，獲得了AtBAM1基因在橡膠樹中的同源基因HbBAM1的cDNA序列。設計了1對基因特異性引物HbBAM1-F和HbBAM1-R，以雄花和雌花的cDNA為模板，進行RT-PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳顯示，PCR產(chǎn)物為單一的條帶。該條帶經(jīng)回收后，連接到pMD-18T載體中，轉(zhuǎn)化Top10感受態(tài)細胞，37 ℃培養(yǎng)過夜，挑選5個經(jīng)菌落PCR鑒定為陽性的克隆，送上海英俊生物技術公司進行測序驗證。引物序列見表1。

1.2.4 HbBAM1基因的表達分析 HbBAM1基因的熒光定量PCR引物qBAM1-F和qBAM1-R，經(jīng)測序確定引物正確。使用伯樂公司的CFX96 TOUCH實時熒光定量PCR儀，分析HbBAM1基因在不同組織、葉片不同時期和一天不同時間點葉片的表達變化。不同組織和葉片不同時期的內(nèi)參基因為RH2b，一天不同時間點葉片的內(nèi)參基因為UBC2a。內(nèi)參基因的引物參照Li等[15]的論文。

1.2.5 HbBAM1原核表達載體的構建與表達 由于HbBAM1定位于葉綠體上，其定位于葉綠體的信號肽為疏水結(jié)構，可能會影響HbBAM1在大腸桿菌的表達，原核表達去除了HbBAM1的信號肽序列。以yBAM1-F 和yBAM1-R為引物，從第76個氨基酸開始，擴增HbBAM1基因的編碼區(qū)序列。PCR擴增產(chǎn)物、原核表達載體pGEX-4T-1和pET43.1a都使用Bam HI和Sal I雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠回收、連接轉(zhuǎn)化Top10感受態(tài)。挑選陽性克隆，DNA測序確認正確的克隆，成功構建了HbBAM1的pGEX-4T-1和pET43.1a中的原核表達載體，分別命名為pGEX-HbBAM1和pET43-HbBAM1。構建完成的原核表達載體轉(zhuǎn)化大腸表達菌種BL21（DE3），對HbBAM1進行誘導表達，其誘導條件為：IPTG濃度為0.5 mmol/L，16 ℃誘導20 h。

1.2.6 HbBAM1重組蛋白的酶活性分析 超聲破碎經(jīng)IPTG誘導BL21（DE3）菌，13 000 r/min，10 min高速離心，分離上清和沉淀，沉淀用和上清相同體積的無菌水重懸，10%聚丙烯胺濃度的SDS-PAGE檢測重組蛋白的表達。取約0.5 μg未經(jīng)純化pET43-HbBAM1重組蛋白，用于最適酶活性溫度的測定，以及不同濃度氧化型谷胱甘肽和雙氧水對酶活性的抑制實驗。反應體系為100 μL，含100 mmol/L檸檬酸-檸檬酸鈉（pH5.6），1%的可溶性淀粉，分別置于不同溫度的水浴中，測定pET43-HbBAM1重組蛋白的最適酶活性溫度。抑制劑實驗：分別加入不同濃度的氧化劑，其它反應體系與酶活性溫度測定相同，反應溫度為35 ℃。所有酶反應均在冰上混勻后，置于相應溫度的水浴中反應15 min，然后分別加入900 μL的麥芽糖顯色溶液（1%的3，5-二硝基水楊酸，30%的酒石酸鉀鈉，0.4 N的NaOH）終止反應，最后于100 ℃反應5 min顯色，測定吸光值OD520。

2 結(jié)果與分析

2.1 HbBAM1基因全長cDNA的克隆

經(jīng)DNA測序驗證，獲得了HbBAM1基因全長cDNA序列，全長1 913 bp，其中編碼區(qū)長1 752 bp，共編碼583個氨基酸序列。與擬南芥的HbBAM1的氨基酸序列同源性為75.7%。用Mega7.0[16]對HbBAM1和擬南芥的9個HbBAM進行進化樹分析，HbBAM1和AtBAM1同源性最高，歸于一個亞類。應用在線預測軟件ChloroP and TargetP[17-18]，ProtComp[19]通過分析HbBAM1編碼的氨基酸序列，其N末端有1條葉綠體轉(zhuǎn)運肽，HbBAM1定位于葉綠體中。

2.2 HbBAM1基因在不同組織和葉片不同發(fā)育時期中的表達分析

實時熒光定量PCR分析結(jié)果顯示，HbBAM1基因主要在巴西橡膠樹的雌花、雄花、葉片和種子中表達，在根中幾乎不表達（圖2）。HbBAM1基因在巴西橡膠樹不同發(fā)育時期葉片中的表達分析結(jié)果表明，隨葉片的發(fā)育進程其表達量不斷增加，在淡綠期和穩(wěn)定期葉片中表達量最高（圖3）。在不同時間點葉片中的表達分析結(jié)果表明，HbBAM1基因在光合作用最強的上午10：00和下午16：00的表達量最大，而晚上20：00和22：00的表達量最?。▓D4）。

2.3 HbBAM1在大腸桿菌中的重組表達

原核表達載體pGEX-4T-1的GST標簽和pET43.1a的NusA標簽均能促進HbBAM1的可溶性表達，SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示，2種標簽使得HbBAM1以可溶性表達（圖5）。酶活性分析結(jié)果表明，GST-HbBAM1和NusA-HbBAM1重組蛋白均有較強的β-淀粉酶活性（結(jié)果未顯示），因為NusA-HbBAM1的表達量相對較大，最適酶活性溫度和抑制劑實驗均使用該蛋白用于下一步的實驗。HbBAM1的最適酶活性溫度是35 ℃，在45 ℃只有5.5%的酶活性，在50 ℃時則完全檢測不到酶活性（圖6）。不同濃度的氧化劑-氧化型谷胱甘肽和雙氧水均能抑制HbBAM1的酶活性，其中經(jīng)20 mmol/L的氧化型谷胱甘肽和0.2%的雙氧水處理，HbBAM1只有對照10%左右的酶活性（圖7）。

3 討論

HbBAM1的最適酶活性溫度為35 ℃，而在50 ℃時就完全沒有酶活性，與擬南芥的BAM1[10]和豌豆上胚軸中β-淀粉酶[20]的最適酶活性溫度類似。而與長期淀粉儲存器官中的β-淀粉酶差異很大，它們的最適酶活溫度相對較高，大豆的β-淀粉酶為60 ℃[21]，甘薯的為53 ℃[22]，土豆的為55 ℃[23]。這可能與它們的細胞定位和功能不同有關。HbBAM1位于葉綠體，負責降解葉綠體內(nèi)臨時儲存的淀粉，最適酶活性溫度較低，如25 ℃時還有最大酶活性的71%，有利于在環(huán)境溫度條件下達到較大的酶活性，從而利于淀粉的快速降解，及時參與對環(huán)境變化的應答。而大豆、土豆等長期淀粉儲存器官中的β-淀粉酶最適酶活性溫度相對較高，低溫時的酶活性較低[21]，使得儲存器官中淀粉緩慢降解，有利于種子和塊莖中淀粉的長期保存。

在擬南芥中，AtBAM1基因在幼嫩葉片中只在氣孔的保衛(wèi)細胞中表達，到成熟葉片時，葉肉細胞才也會有AtBAM1基因的表達。橡膠樹中HbBAM1基因也是隨著葉片的發(fā)育，在葉片中的表達量逐漸增大，很可能也是由于成熟葉肉細胞中HbBAM1基因大量表達，使得HbBAM基因在葉片中總體表達量增加。

橡膠樹HbBAM1的酶活性受到氧化型谷胱甘肽和雙氧水的抑制，這與擬南芥的AtBAM1[6，11]類似。擬南芥中光合系統(tǒng)I保持硫氧還蛋白的還原狀態(tài)，從而還原處于氧化狀態(tài)的AtBAM1，使得AtBAM1只能在白天處于激活狀態(tài)[11]。HbBAM1基因在白天的表達量明顯高于晚上，說明HbBAM1主要在白天發(fā)揮其生物學功能。一天當中上午10：00和下午16：00的光照強度適中，橡膠樹光合作用最強，這時HbBAM1基因的表達量也最高（圖4），HbBAM1可能在光照適宜的條件下，調(diào)控氣孔的打開，促進橡膠樹的光合作用。而在光照最強的中午12：00和14：00時，HbBAM1基因的表達量相對較低，減少氣孔的開發(fā)，降低光合作用和減少水分的蒸發(fā)，使得橡膠樹能夠更好的適應熱帶地區(qū)中午的高溫環(huán)境。HbBAM1基因在晚上的表達量最低，其在晚上處于本底表達水平。

本研究從橡膠樹中克隆了1個葉綠體型β-淀粉酶基因HbBAM1，確定了HbBAM1的最適酶活性溫度及不同氧化劑對其抑制作用，并分析了HbBAM1基因在不同組織和在葉片中同一天的表達模式，為進一步研究其在橡膠樹葉片中的生理功能奠定了良好基礎。

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