楊署光 張世鑫 吳紹華 陳月異 李言 史敏晶 田維敏

中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院橡膠研究所/農(nóng)業(yè)部橡膠樹生物學(xué)與遺傳資源利用重點(diǎn)實驗室/省部共建國家重點(diǎn)實驗室培育基地-海南省熱帶作物栽培生理學(xué)重點(diǎn)實驗室，海南儋州 571737

摘 要 GSK3蛋白與進(jìn)化過程中的激素信號網(wǎng)絡(luò)和生物、非生物脅迫響應(yīng)密切關(guān)聯(lián)。GSK3是否在橡膠樹JA和ET信號途徑起作用尚不清楚。qPCR分析結(jié)果表明，機(jī)械傷害、MeJA和ET處理上調(diào)膠乳中HbGSK1基因的表達(dá)，并且“機(jī)械傷害+MeJA”處理的表達(dá)水平顯著高于機(jī)械傷害處理，推測機(jī)械傷害通過上調(diào)膠乳內(nèi)源JA含量上調(diào)HbGSK1基因的表達(dá)；機(jī)械傷害上調(diào)膠乳中HbGSK1基因的表達(dá)，表明HbGSK1蛋白可能參與橡膠樹非生物脅迫響應(yīng)；MeJA和ET處理上調(diào)膠乳中HbGSK1基因的表達(dá)，表明HbGSK1蛋白可能參與橡膠樹JA和ET植物激素信號途徑的調(diào)節(jié)。MeJA和ET處理均上調(diào)膠乳中HbGSK1基因的表達(dá)，表明JA和ET對HbGSK1基因的表達(dá)的調(diào)節(jié)具有協(xié)同作用。

關(guān)鍵詞 茉莉酸甲酯；乙烯；巴西橡膠樹；HbGSK1；表達(dá)分析

中圖分類號 S794.1 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A

Effects of Exogenous Jasmonates and Ethylene on the Expression of HbGSK1 in the Latex of Hevea brasiliensis Müll. Arg.

YANG Shuguang， ZHANG Shixin， WU Shaohua， CHEN Yueyi， LI Yan， SHI Minjing， TIAN Weimin*

Rubber Research Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences/Key Laboratory of Rubber Biology， Minstry of Agriculture /State Key Laboratory Incubation Base for Cultivation & Physiology of Tropical Crops， Danzhou， Hainan 571737， China

Abstract Recent studies have revealed that plant GSK3 proteins are actively implicated in hormonal signalling networks during development as well as in biotic and abiotic stress responses. Whether GSK in rubber trees functions in jasmonates and ethylene signaling is unknown. In this study， a real-time PCR analysis showed that the expression of HbGSK1 was upregulated by mcchanical wounding， methy jasmonates and ethylene. Moreover， the influence on HbGSK1 expression of “wounging+methy jasmonates” was greater than that of wounding， suggesting that wounding upregulates the expression of HbGSK1 by facilitates the biosynthesis of endogenesis jasmonates. The change of HbGSK1 transcript levels in latex indicated that HbGSK1 protein was involved in abiotic stress responses as well as in jasmonates and ethylene signaling of rubber trees. In addition， JA and ET operate synergistically in regulating HbGSK1 expression.

Key words methy jasmonates； ethylene； Hevea brasiliensis Müll. Arg.； HbGSK1； expression analysis

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2018.06.012

植物GSK3（糖原合成酶激酶3）蛋白與進(jìn)化過程中的激素信號網(wǎng)絡(luò)和生物、非生物脅迫響應(yīng)密切關(guān)聯(lián)。在擬南芥中，AtSK12[1-2]、AtSK21[3-10]、AtSK22[5， 11]、AtSK23[5， 11]、AtSK32[12]調(diào)節(jié)BR信號傳導(dǎo)，AtSK21[13-14]調(diào)節(jié)ABA信號傳導(dǎo)，AtSK21[15-16]、AtSK31[17]調(diào)節(jié)生長素信號傳導(dǎo)，AtSK21介導(dǎo)BR-ABA[14， 18]、BR-Auxin[15]、BR-GA[10]信號途徑的交叉?zhèn)鲗?dǎo)；在水稻中，OsSK21[19-20]、OsSK24[20]、OsSK22[21]調(diào)節(jié)BR信號傳導(dǎo)。

目前，模式植物擬南芥和水稻的GSK3s報道最多，其中，GSK3s調(diào)節(jié)激素信號途徑的研究以BR信號途徑最多，其次是生長素和脫落酸信號途徑，GSK3s調(diào)節(jié)JA（茉莉酸）和ET（乙烯）信號途徑的研究尚未見報道。在大戟科植物中，最近報道了ABA處理上調(diào)小桐子GSK3 JcGSK基因的表達(dá)[22]。

中國橡膠樹植膠區(qū)位于北緯18～24曘的熱帶北緣和南亞熱帶地區(qū)，寒潮、臺風(fēng)和干旱是最為嚴(yán)重的自然災(zāi)害。因此，選育抗逆高產(chǎn)的橡膠樹無性系是中國橡膠樹育種的重要目標(biāo)。在抗逆相關(guān)基因的研究基礎(chǔ)上開發(fā)抗逆相關(guān)分子標(biāo)記來輔助育種，將大幅提高抗逆性鑒定效率，推進(jìn)抗逆品種的選育進(jìn)程。JA和ET是橡膠樹割膠過程中產(chǎn)生的2種重要的植物激素。在前期研究中，筆者們從膠乳中克隆到一個橡膠樹GSK3基因HbGSK1（GenBank：JN835185.1），本研究分析MeJA和ET處理對膠乳中HbGSK1基因表達(dá)的影響，為進(jìn)一步探討橡膠樹抗逆機(jī)理、開發(fā)抗逆分子標(biāo)記、輔助橡膠樹抗逆育種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗材料為巴西橡膠樹（Hevea brasiliensis Müll.Arg.）無性系CATAS7-33-97，種植于中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院試驗場。DNaseⅠ購自天根公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit購自Ferments公司，實時熒光定量PCR試劑SYBR Premix Ex TaqⅡ（Tli RNaseH Plus）購自大連寶生物公司，其它生化試劑均為進(jìn)口或國產(chǎn)分析純試劑。引物合成由Invitrogen公司完成。

1.2 方法

1.2.1 材料處理 選取大小、長勢、物候期基本一致的成齡巴西橡膠樹無性系CATAS7-33-97的未開割樹和1年生橡膠樹穩(wěn)定期萌條開展實驗。

（1）機(jī)械傷害和MeJA處理成齡未開割樹：以成齡未開割樹為材料，用刀片刮傷至皮層（2 cm×2 cm），對照涂上7.14%乙醇溶液：羊毛脂（1：1，V/m）的混合羊毛脂；處理涂上含0.14% MeJA的混合羊毛脂：含0.14% MeJA用7.14%乙醇溶解并混勻，分別在處理后0 h、6 h、1 d、2 d、3 d、7 d、15 d采樣，針刺采膠，每個處理收集5株的混合樣，用于提取膠乳總RNA。

（2）MeJA處理1年生橡膠樹穩(wěn)定期萌條：以1年生橡膠樹穩(wěn)定期萌條為材料，處理頂蓬節(jié)間，對照用7.14%的乙醇溶液處理，處理用含0.07% MeJA的7.14%乙醇溶液處理，分別在處理后2、6 h及1、3、5 d采樣，用刀片切割韌皮部采膠，每個處理收集5株的混合樣，用于提取膠乳總RNA。

（3）ET處理1年生橡膠樹穩(wěn)定期萌條：以1年生橡膠樹穩(wěn)定期萌條為材料，用0.05% ET處理頂蓬節(jié)間，對照不作任何處理，分別在處理后2 h、6 h、1 d、3 d、5 d采樣，用刀片切割韌皮部采膠，每個處理收集5株的混合樣，用于提取膠乳總RNA。

1.2.2 總RNA的提取與cDNA的合成 膠乳總RNA提取參照曾日中等[23]的方法。cDNA第一鏈的合成參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit的說明書進(jìn)行。

1.2.3 生物信息學(xué)分析 利用DNAMAN軟件對HbGSK1蛋白序列進(jìn)行比對分析；從NCBI數(shù)據(jù)庫下載擬南芥和水稻的GSK3s蛋白序列，首先用ClustalW進(jìn)行序列多重比對，再利用MEGA4.0軟件，選擇neighbour -joining（NJ）模型，并進(jìn)行1 000次bootstrap統(tǒng)計學(xué)檢驗，構(gòu)建包括HbGSK1蛋白序列在內(nèi)的植物GSK3蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹；利用Prosite在線數(shù)據(jù)庫分析蛋白的功能位點(diǎn)；利用NetPhos2.0 Server在線軟件分析蛋白的磷酸化位點(diǎn)。

1.2.4 熒光定量PCR分析 根據(jù)獲得的HbGSK1 cDNA全長序列設(shè)計qPCR引物（F：GAGTAGTATTCCAGGCTAAGTG，R：TAGTTTGCAGCTCACGGTTCTT），以Hb18S（F：GCTCGAAGACGATCAGATACC，R：TTCAGCCTTGCGACCATAC）作為內(nèi)參基因，分析HbGSK1的基因表達(dá)。取1 μg膠乳總RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈，稀釋10倍后作為熒光定量PCR分析的模板。qPCR反應(yīng)體系為20 μL，其中2x SYBR Premix 10 μL、上游引物0.4 μL、下游引物0.4 μL（引物濃度為10 μmol/L，反應(yīng)體系中每條引物終濃度均為0.2 μmol/L）、cDNA模板1 μL、ddH2O 8.2 μL。qPCR反應(yīng)在Bio-Rad公司的CFX實時熒光定量PCR儀中進(jìn)行，實驗操作按儀器使用說明書進(jìn)行，qPCR反應(yīng)程序為：95 ℃ 30 s；95 ℃ 10 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，共40個循環(huán)；40個循環(huán)后進(jìn)行溶解曲線分析。利用CFXmanager 3.0軟件自動進(jìn)行基線和Cq值分析。

1.3 數(shù)據(jù)處理

用Excel 2003作圖，用SPSS軟件的R-E-G-WQ（Q）檢驗進(jìn)行多重比較分析：標(biāo)有不同大寫字母者表示組間差異極顯著（p<0.01），標(biāo)有不同小寫字母者表示組間差異顯著（p<0.05），而標(biāo)有相同小寫字母者表示組間差異不顯著（p>0.05）。用Excel TTEST（Array 1，Array 2，Tails 1，Type 1）進(jìn)行成對比較分析：p<0.01表示組間差異極顯著，p<0.05表示組間差異顯著。根據(jù)Q=2△Cq=2min Cq-Sample Cq計算基因的表達(dá)值。

2 結(jié)果與分析

2.1 HbGSK1蛋白功能位點(diǎn)分析

NetPhos 2.0 Server磷酸化位分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HbGSK1蛋白共有56個可能的磷酸化位點(diǎn)[17個絲氨酸（Serine）位點(diǎn)、24個蘇氨酸（Threonine）位點(diǎn)和15個酪氨酸（Tyrosine）位點(diǎn)]，其中13個磷酸化位點(diǎn)的預(yù)測得分大于0.500，包括5個絲氨酸位點(diǎn)（Ser：10、135、232、278、364，Score分別為0.845、0.901、0.861、0.843、0.819），4個蘇氨酸位點(diǎn)（Thr：43、117、137、347，Score分別為0.799、0.831、0.949、0.705），4個酪氨酸位點(diǎn)（Tyr：110、143、233、305，Score分別為0.520、0.957、0.710、0.835）（見表1）。Prosite分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HbGSK1蛋白序列含有5類功能位點(diǎn)：包括1個酪氨酸激酶磷酸化位點(diǎn)（tyrosine kinase phosphorylation site）：Tyr110，7個酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點(diǎn)（casein kinase II phosphorylation site）：Ser135/278、Thr43/137/253/294/347，5個蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)（Protein kinase C phosphorylationsite）：Ser128/220/364、Thr117/137，4個豆蔻酰化位點(diǎn)（N-myristoylation site）和3個N-糖基化位點(diǎn)（N-glycosylation site）（表1）。

2.2 氨基酸序列比對及進(jìn)化樹構(gòu)建

由表2可知，擬南芥和水稻的GSK3s蛋白分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ四種類型，推導(dǎo)的HbGSK1氨基酸序列與擬南芥和水稻的GSK3s蛋白序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示，橡膠樹HbGSK1與擬南芥（AtSK11、AtSK12、AtSK13）和水稻（OsSK11、OsSK12、OsSK13）的亞組Ⅰ聚為一類，親緣關(guān)系最近（圖1）。

人類hGSK3β分別與擬南芥GSK3代表AtSK21/BIN2和橡膠樹GSK3 HbGSK1的比對結(jié)果顯示，HbGSK1蛋白序列與hGSK3β和AtSK21/BIN2蛋白的序列相似性分別為56.26%、72.59%，并且STKc激酶結(jié)構(gòu)域和關(guān)鍵的活性調(diào)節(jié)位點(diǎn)高度保守，說明該基因在物種進(jìn)化過程中高度保守。如圖2所示，黑下劃線（_）表示STKc激酶結(jié)構(gòu)域（hGSK3β：56-344；HbGSK1：73-357，AtSK21/BIN2：40-328）；虛下劃線（﹍）表示植物中保守的TREE結(jié)構(gòu)域（HbGSK1：294-297；AtSK21/BIN2：261-264），點(diǎn)突變處理擬南芥時TREE結(jié)構(gòu)域第一、三、四位殘基引起AtSK21/BIN2功能獲得性點(diǎn)突變等位基因[bin2-1和dwf12-2D（E263K）；bin2-2（T261I）；ucu1-1，ucu1-2和dwf12-1D（E264K）][24-26]；保守的酪氨酸殘基（hGSK3β：Y216；AtSK21/BIN2：Y200；HbGSK1：Y233）用白箭頭（▽）表示，其磷酸化對激酶活性是必需的；保守的磷酸鹽結(jié)合殘基（hGSK3β：Arg96、Arg180、Lys205；AtSK21/BIN2：Arg80、Arg164、Lys189；HbGSK1：Arg113、Arg197、Lys222）用星號（*）表示，它與初始磷酸化底物結(jié)合；擬南芥弱等位基因ucu1-3（P284S）用加號（⊕）表示；其他功能散失突變[11]用分界符表（§）示（G49D，C183Y，R312K；所有殘基在hGSK3β中都是保守的）；死激酶突變bin2（K69R）用磅字符（﹟）表示，該突變抑制功能獲得性突變；hGSK3β特異的Ser9（hGSK3β：Ser9；HbGSK1：Ser10）用黑色箭頭（▼）表示，該殘基對hGSK3β的抑制調(diào)節(jié)是必需的。

2.3 HbGSK1基因表達(dá)與分析

以18S基因為內(nèi)參，qRT-PCR分析HbGSK1在巴西橡膠樹膠乳中的基因表達(dá)情況。

2.3.1 機(jī)械傷害和茉莉酸甲酯（MeJA）上調(diào)次生膠乳中HbGSK1基因的表達(dá) 由圖3可知，機(jī)械傷害處理6 h、1 d、2 d、3 d、7 d、15 d的基因表達(dá)水平分別是處理0 h的5.50、11.45、15.95、26.49、2.74、1.85倍，處理3 d表達(dá)水平最高，7 d后恢復(fù)到未處理水平（p>0.05）；MeJA處理6 h、1 d、2 d、3 d、7 d、15 d的基因表達(dá)水平分別是處理0 h的3.46、8.74、16.92、52.68、5.81、3.76倍，處理3 d表達(dá)水平最高，7 d后恢復(fù)到較低水平；處理后2 d以內(nèi)（0 h、6 h、1 d、2 d），機(jī)械傷害和MeJA處理的基因表達(dá)水平差異不顯著，處理超過2 d（3 d、7 d、15 d），MeJA處理的基因表達(dá)水平顯著高于（p<0.01）機(jī)械傷害處理，表明外源MeJA在處理2 d后才進(jìn)入植物體內(nèi)發(fā)揮作用，并且MeJA處理短暫而大幅度上調(diào)次生膠乳中HbGSK1基因的表達(dá)。機(jī)械傷害和MeJA處理上調(diào)膠乳中HbGSK1基因的表達(dá)，并且“機(jī)械傷害+MeJA”處理的表達(dá)水平顯著高于機(jī)械傷害處理，推測機(jī)械傷害通過上調(diào)膠乳內(nèi)源JA含量而上調(diào)HbGSK1基因的表達(dá)，表明HbGSK1可能參與橡膠樹非生物脅迫和JA信號途徑的調(diào)節(jié)。

CK：傷害+羊毛脂；MeJA：傷害+含0.14% MeJA的羊毛脂；不同大寫字母表示組間差異極顯著（p<0.01）。下同。

CK： wounding + lanolin； JA： 0.14% MeJA + lanolin； The different capital letters indicate significance at T<0.01 level. The same as below.

2.3.2 茉莉酸甲酯（MeJA）上調(diào)初生膠乳中HbGSK1基因的表達(dá) 由圖4可知，MeJA處理2 h、6 h、1 d、3 d、5 d的基因表達(dá)水平分別是對照的1.39、0.55、3.13、1.32、1.20倍（圖4-B），處理1 d的表達(dá)水平最高；雖然2 h、6 h、3 d、5 d處理與對照間差異顯著（p<0.01或p<0.05），但處理和對照的基因表達(dá)水平基本在0.5～1.0之間波動（圖4-A），基因表達(dá)變化幅度也只有±0.5倍左右（圖4-B）。TTEST分析結(jié)果表明，對照組（CK：2 h、6 h、3 d、5 d）與處理組（JA：2 h、6 h、3 d、5 d）表達(dá)水平間差異不顯著（p>0.05）。MeJA處理短暫而大幅度上調(diào)初生膠乳中HbGSK1基因的表達(dá)，表明HbGSK1可能參與橡膠樹JA信號途徑的調(diào)節(jié)。

2.3.3 乙烯（ET）上調(diào)初生膠乳中HbGSK1基因的表達(dá) 由圖5可知，ET處理2 h、6 h、1 d、3 d、5 d的基因表達(dá)水平分別是對照的1.36、8.14、7.73、1.80、9.01倍（圖5-B），其中處理5 d表達(dá)水平最高；HbGSK1基因的表達(dá)對ET處理敏感，處理后6 h的基因表達(dá)就大幅度上調(diào)，并一直維持在較高的水平（圖5-A）；異常的是，處理后3 d的樣品，雖然基因表達(dá)依然高于對照，但與前后時間點(diǎn)相比上調(diào)幅度大副減小，推測在大田處理過程中，這個時間點(diǎn)的樣品受到其它環(huán)境因子的干擾，而這些環(huán)境因子恰巧又能影響HbGSK1基因的表達(dá)。ET處理上調(diào)初生膠乳中HbGSK1基因的表達(dá)，表明HbGSK1可能參與橡膠樹ET信號途徑的調(diào)節(jié)。

3 討論

植物激素是脅迫響應(yīng)的監(jiān)視者[27]。除了在個體水平發(fā)揮關(guān)鍵作用，不同植物激素也交叉?zhèn)鲗?dǎo)，以促進(jìn)參與脅迫修復(fù)的任何一組基因或它們的調(diào)節(jié)因子的協(xié)調(diào)[28]。植物GSK3蛋白與進(jìn)化過程中的激素信號網(wǎng)絡(luò)和生物、非生物脅迫響應(yīng)密切關(guān)聯(lián)。在擬南芥中，AtSK12[1，2]、AtSK21[3-10]、AtSK22[5，11]、AtSK23[5，11]、AtSK32[12]調(diào)節(jié)BR信號傳導(dǎo)，AtSK21[13，29]調(diào)節(jié)ABA信號傳導(dǎo)，AtSK21[15，16]、AtSK31[17]調(diào)節(jié)生長素信號傳導(dǎo)，AtSK21介導(dǎo)BR-ABA[14，18]、BR-Auxin[15]、BR-GA[10]信號途徑的交叉?zhèn)鲗?dǎo)；在水稻中，OsSK21[19，20]、OsSK24[20]、OsSK22[21]調(diào)節(jié)BR信號傳導(dǎo)。

已有研究結(jié)果表明，葉片損傷后紫花苜蓿GSK3蛋白WIN（Wound-induced Gene）的激酶活性被瞬時觸發(fā)[30]，傷害后擬南芥AtSKs的基因表達(dá)有一定幅度的變化[31]。機(jī)械損傷處理上調(diào)小桐子幼苗JcGSK基因的表達(dá)[22]。本研究獲得相似的結(jié)果，機(jī)械傷害上調(diào)橡膠樹膠乳中HbGSK1的基因表達(dá)。MeJA減小而BR增加水稻葉片角，MeJA處理降低了BR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及其目的基因的mRNA水平，表明MeJA抑制葉片角可能依賴于BR生物合成和BR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，GSK3類激酶（BR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的一個抑制因子）的LiCL誘導(dǎo)失活部分挽救了MeJA誘導(dǎo)的葉片角減小，暗示GSK3可能參與MeJA信號途徑的調(diào)節(jié)[32]。在本研究中，MeJA上調(diào)橡膠樹膠乳中HbGSK1基因的表達(dá)，表明HbGSK1參與JA信號途徑的調(diào)節(jié)。JA和ET在調(diào)節(jié)防衛(wèi)相關(guān)基因中協(xié)同運(yùn)作[33-35]。本研究結(jié)果表明，MeJA和ET處理均上調(diào)橡膠樹膠乳中HbGSK1基因的表達(dá)，表明HbGSK1參與MeJA和ET信號途徑的調(diào)節(jié)，并且MeJA和ET協(xié)同誘導(dǎo)HbGSK1基因的表達(dá)。

4 結(jié)論

機(jī)械傷害和MeJA處理上調(diào)膠乳中HbGSK1基因的表達(dá)，并且“機(jī)械傷害+MeJA”處理的表達(dá)水平顯著高于機(jī)械傷害處理，推測機(jī)械傷害通過上調(diào)膠乳內(nèi)源JA含量而上調(diào)HbGSK1基因的表達(dá)；機(jī)械傷害上調(diào)膠乳中HbGSK1基因的表達(dá)，表明HbGSK1可能參與橡膠樹非生物脅迫響應(yīng)；MeJA和ET處理上調(diào)膠乳中HbGSK1基因的表達(dá)，表明HbGSK1可能參與橡膠樹JA和ET信號途徑的調(diào)節(jié)。MeJA和ET處理均上調(diào)膠乳中HbGSK1基因的表達(dá)，表明JA和ET對HbGSK1基因的表達(dá)調(diào)節(jié)具有協(xié)同作用。

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