王 芳，尚雪莉，崔英英，張婷婷，熊 琳，2△（.湖北醫(yī)藥學(xué)院藥護(hù)學(xué)院，湖北 十堰442000；2.湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬東風(fēng)醫(yī)院藥學(xué)部，湖北十堰442008）

丹參為唇形科植物丹參（salvia miltiorrhiza Bge.）的根和根莖采摘后干燥而得。丹參在我國(guó)作為中藥使用由來已久，為傳統(tǒng)中藥中的一種，在臨床實(shí)踐治療中常用于治療心腦血管疾病、慢性肝病、癌癥和骨質(zhì)疏松[1?4]。植物中的初生代謝產(chǎn)物之一——蛋白質(zhì)，在植物的生長(zhǎng)過程中起著重要作用，與糖類、脂質(zhì)及核酸等共同維持著植物細(xì)胞生命活動(dòng)。近年來，有研究表明，中藥的寒熱藥性與該藥材中蛋白含量的高低具有一定相關(guān)性[5?6]。因此，通過蛋白質(zhì)表達(dá)差異可研究不同生長(zhǎng)環(huán)境對(duì)中藥品質(zhì)的影響[7]。本實(shí)驗(yàn)采用正交試驗(yàn)法優(yōu)選武當(dāng)?shù)⒌鞍踪|(zhì)提取工藝，以蛋白質(zhì)含量為檢測(cè)指標(biāo)，對(duì)提取液（自制純化水）pH值、提取溫度、提取料液比（武當(dāng)?shù)⑴c自制純化水的比例）、提取時(shí)間進(jìn)行了考察，以期探尋武當(dāng)?shù)⒅械鞍踪|(zhì)提取的最佳工藝，為武當(dāng)?shù)⒌鞍踪|(zhì)含量和該藥材的藥性和藥材品質(zhì)提供相關(guān)的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 FA1004B型電子分析天平（可精密稱定至0.000 1 g，蘇州江東精密儀器有限公司）、DBCS?2400 型超聲波清洗器（濟(jì)南德邦機(jī)電設(shè)備有限公司，2 400 W，28 kHz）、H?2400R型高速冷凍離心機(jī)（上海江東儀器有限公司）、UV754PC紫外?可見分光光度計(jì)（上海佑科儀器儀表有限公司）。實(shí)驗(yàn)中所用丹參來源于武當(dāng)山地區(qū)種植丹參（批號(hào)：20170514、20170623、20160703），購(gòu)于湖北武當(dāng)生物醫(yī)藥有限公司，鑒定人為李鵬主任藥師（國(guó)藥東風(fēng)總醫(yī)院）。其他材料為牛血清蛋白（BSA，批號(hào)：F2016806，Ruibio公司），實(shí)驗(yàn)用水為實(shí)驗(yàn)室自制純化水。

1.2 方法

1.2.1 蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 準(zhǔn)確稱取BSA 10.0 mg，用純化水溶解并定容至100 mL，即得質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL的BSA標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.2.2 考馬斯亮藍(lán)染色溶液的配制 取考馬斯亮藍(lán)G?250 100 mg，加入95%乙醇50 mL攪拌溶解，加入85%磷酸100 mL，用自制純化水定容至1 000 mL，過濾，備用。

1.2.3 精密度試驗(yàn) 取BSA標(biāo)準(zhǔn)溶液800μL，補(bǔ)加純化水至2mL，加入10mL考馬斯亮藍(lán)染色溶液顯色5min，在595 nm處測(cè)定溶液的吸光度。重復(fù)操作6次，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。

1.2.4 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線 參照考馬斯亮藍(lán)法。取7支干凈試管，分別加入 BSA標(biāo)準(zhǔn)溶液 0、200、400、600、1 200、1 600、2 000 μL，補(bǔ)加純化水至 2 mL ，制備成不同質(zhì)量濃度的BSA溶液。向試管中加入10 mL考馬斯亮藍(lán)染色溶液染色5 min。以未加BSA標(biāo)準(zhǔn)溶液的試管為空白對(duì)照，595 nm比色測(cè)定其余6支試管中溶液的吸光度。以蛋白的質(zhì)量濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.5 蛋白質(zhì)超聲提取單因素考察

1.2.5.1 pH值對(duì)丹參蛋白提取率的影響 稱量武當(dāng)?shù)⑺幉姆勰?份，各1.000 0 g，分別加入50 mL pH值為 2、4、6、8、10、12 的雙蒸水，40 ℃超聲 30 min，取出冷卻至室溫。8 500 r/min離心5 min，取上清液1.0 mL，定容至10 mL作為待測(cè)液。吸取一定量的待測(cè)液，測(cè)定溶液的吸光度。根據(jù)制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線觀察吸光度與蛋白質(zhì)量濃度的線性關(guān)系。

1.2.5.2 料液比對(duì)丹參蛋白提取率的影響 稱量武當(dāng)?shù)⑺幉姆勰?份，各1.000 0 g，分別加入20、25、30、40、50 mL自制純化水，40℃超聲30 min，取出冷卻至室溫。8 500 r/min離心5 min，吸取1 mL上清液定容至10 mL作為待測(cè)液。吸取一定量的待測(cè)液，測(cè)定溶液的吸光度。

1.2.5.3 提取溫度對(duì)丹參蛋白提取率的影響 稱量武當(dāng)?shù)⑺幉姆勰?份，各1.000 0 g，加入50 mL自制純化水，分別在 20、30、40、50、60、70 ℃時(shí)超聲 30 min，取出冷卻至室溫。8 500 r/min離心5 min，取上清液，定容至10 mL作為待測(cè)液。吸取一定量的待測(cè)液，測(cè)定溶液的吸光度。根據(jù)制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算蛋白質(zhì)含量。

1.2.5.4 提取時(shí)間對(duì)丹參蛋白提取率的影響 稱量武當(dāng)?shù)⑺幉姆勰?份，各1.000 0 g，加入50 mL自制純化水，分別于 40 ℃ 超聲 10、20、30、40、50、60 min，取出超聲處理后的丹參藥材粉末混懸液冷卻至室溫。8 500 r/min離心5 min，取出上清液，定容至10 mL作為待測(cè)液。取一定量的待測(cè)液，測(cè)定溶液的吸光度。根據(jù)制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算蛋白質(zhì)含量。

1.2.6 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 選取4個(gè)因素，即pH值（A）、料液比（B）、提取溫度（C）、提取時(shí)間（D）。每個(gè)因素設(shè)3個(gè)水平，選用L9（34）正交表，以蛋白得率為指標(biāo)進(jìn)行試驗(yàn)。見表1。

表1 因素?水平表L9（34）

1.2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取供試蛋白溶液40μL，加純化水補(bǔ)至 2 mL，按 1.2.4 項(xiàng)的操作測(cè)定樣品 5、10、15、20、25、30 min時(shí)的吸光度。

1.2.8 重復(fù)性試驗(yàn) 取6份供試蛋白質(zhì)溶液各40μL，加雙蒸水補(bǔ)至2 mL，按照1.2.4項(xiàng)的操作測(cè)定吸光度。1.2.9 加樣回收率試驗(yàn) 采用標(biāo)準(zhǔn)加入法，按1.2.6項(xiàng)選取的最優(yōu)條件平行處理6份，按1.2.4項(xiàng)的操作測(cè)定溶液的吸光度并計(jì)算回收率。

1.2.10 驗(yàn)證性試驗(yàn) 按1.2.6項(xiàng)選取的最優(yōu)條件，分離3個(gè)批次武當(dāng)?shù)⑺幉模ㄅ?hào)：20170514、20170623、20160703），根據(jù)1.2.4項(xiàng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算藥材中可溶性蛋白含量。

2 結(jié) 果

2.1 精密度RSD為0.21%，表明儀器精密度良好。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線 線性回歸方程Y=0.040 2X+0.180 2，R2=0.998 5，線性范圍為 0～100 μg。

2.3 pH值對(duì)丹參蛋白提取率的影響 pH值為12時(shí)蛋白質(zhì)提取量最大。見圖1。

圖1 pH值對(duì)丹參蛋白提取率的影響

2.4 料液比對(duì)丹參蛋白提取率的影響 料液比為1∶50時(shí)蛋白質(zhì)提取量最大。見圖2。

圖2 料液比對(duì)丹參蛋白提取率的影響

2.5 提取溫度對(duì)丹參蛋白提取率的影響 提取溫度為40℃時(shí)蛋白質(zhì)提取量最大，見圖3。

圖3 提取溫度對(duì)丹參蛋白提取率的影響

2.6 提取時(shí)間對(duì)丹參蛋白提取率的影響 提取時(shí)間為30 min時(shí)，蛋白質(zhì)提取量最大。見圖4。

圖4 提取時(shí)間對(duì)丹參蛋白提取率的影響

2.7 正交試驗(yàn)結(jié)果 料液比為1∶50、pH值為12、提取溫度為40℃、提取時(shí)間設(shè)置為20 min時(shí)提取效果可達(dá)最佳。見表2、3。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果（n=3）

表3 正交試驗(yàn)方差分析

2.8 穩(wěn)定性RSD為1.78%。

2.9 重復(fù)性RSD為2.28%。

2.10 加樣回收率 丹參蛋白平均加樣回收率為97.62%，RSD為2.14%。見表4。

表4 丹參蛋白加樣回收率結(jié)果（n=6）

2.11 驗(yàn)證性試驗(yàn)結(jié)果 平均含丹參蛋白量為10.65%，RSD為3.74%。見表5。

表5 驗(yàn)證性試驗(yàn)結(jié)果（n=3）

3 討 論

本研究采用超聲法提取武當(dāng)?shù)⒅械鞍缀?，操作方法?jiǎn)便、快捷。該法可最大限度地保留武當(dāng)?shù)⒌牡鞍壮煞侄槐黄茐?。通過正交試驗(yàn)優(yōu)選提取工藝，確定了武當(dāng)?shù)⒅械鞍滋崛〉淖罴压に嚍楫?dāng)料液比（武當(dāng)?shù)ⅰ盟?1∶50、pH值為12、提取溫度為 40℃、提取時(shí)間設(shè)置為20 min時(shí)提取效果可達(dá)最佳。根據(jù)該工藝測(cè)定武當(dāng)?shù)⒑扇苄缘鞍琢繛?0.65%，RSD為3.74%。

目前，關(guān)于丹參的研究主要集中在丹參活性成分的分離與檢測(cè)[8?10]和丹參提取分離后純化或混合物活性成分的藥理活性研究[11?13]，與丹參生長(zhǎng)相關(guān)的研究一般為不同生長(zhǎng)時(shí)期丹參莖葉的化學(xué)成分分布與積累動(dòng)態(tài)研究[14?15]。本研究探討武當(dāng)?shù)⒅械鞍缀康奶崛」に?，本課題組下一步將探討不同生長(zhǎng)周期及不同生長(zhǎng)環(huán)境的武當(dāng)?shù)⒌鞍缀康难芯?，以期能為武?dāng)?shù)⒌幕钚猿煞址e累與調(diào)控奠定基礎(chǔ)。

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