陳恒君，田超群，楊鈺興，袁睿（重慶市渝北區(qū)人民醫(yī)院：.皮膚科；.泌尿外科400）

惡性黑素瘤是由皮膚、黏膜、眼等色素沉著部位的黑素細(xì)胞產(chǎn)生的一種高度惡性腫瘤，其特點為生長隱匿、轉(zhuǎn)移早且迅速，患者預(yù)后差及病死率高，致死率達79.0%[1?3]。目前，已確定小眼畸形相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子（MITF）在黑素細(xì)胞和黑素瘤細(xì)胞核中高表達[4?5]，是核蛋白最重要的轉(zhuǎn)錄因子，具有較強的診斷靈敏度和特異性[6?7]，但相關(guān)機制研究較少。本研究采用RNA干擾技術(shù)，研究了MITF對惡性黑素瘤的生長及黑素生成能力的影響，試圖為惡性黑素瘤的治療提供新的思路和策略，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 pLKO.1?短發(fā)夾RNA（shRNA）載體。

1.1.2 細(xì)胞系 B16F10黑素瘤細(xì)胞系購自KeyGen公司。細(xì)胞生長基質(zhì)（培養(yǎng)液 1）為 RPMI?1640、10% 胎牛血清。細(xì)胞培養(yǎng)箱條件為37℃及5%二氧化碳。

1.1.3 主要試劑 RPMI?1640、10%胎牛血清均購自HyClone公司；mRNA提取試劑盒Trizol Reagent、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒 PrimeScript?RT reagent Kit、擴增試劑盒SYBR Green RT?PCR Kit均購自 TaKaRa公司；蛋白抽提試劑盒、蛋白質(zhì)印跡跑膠試劑盒、聚偏氟乙烯（PVDF）膜、蛋白質(zhì)印跡顯影ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒、Tri?ton?X100、MTT細(xì)胞活性檢測試劑盒均購自Beyotime公司；蛋白定量試劑盒采用Pierce?BCA Protein Assay Kit，購自Thermo Scientific公司；免疫組織化學(xué)試劑盒購自博士德公司；MITF、β?actin蛋白抗體均購自Santa公司；DNA Marker、RNA Marker、LipofectamineTM2000均購自Invitrogen公司；嘌呤霉素購自Sigma公司；MITF?shRNA質(zhì)粒由KeyGen公司構(gòu)建，并根據(jù)片段不同分別標(biāo)注為 B16F10?NC（空白質(zhì)粒對照）、B16F10?1、B16F10?2、B16F10?3，另建立未用任何質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的陰性對照（B16F10組）。

1.2 方法

1.2.1 構(gòu)建穩(wěn)定干擾MITF表達的B16F10細(xì)胞系 將對數(shù)生長期B16F10細(xì)胞系傳代并過夜（約24 h）培養(yǎng)，按標(biāo)準(zhǔn)流程，使用LipofectamineTM2000將擴增的shR?NA質(zhì)粒中MITF沉默片段轉(zhuǎn)染該細(xì)胞系。48 h后，使用添加嘌呤霉素（4μg/mL）的細(xì)胞培養(yǎng)液（培養(yǎng)液2）繼續(xù)培養(yǎng)轉(zhuǎn)染細(xì)胞系2周（每2～3天更換1次培養(yǎng)液2），將存活細(xì)胞單克隆移至96孔板中并使用培養(yǎng)液2繼續(xù)培養(yǎng)，直至轉(zhuǎn)染細(xì)胞系呈對數(shù)期生長并達90%以上的匯合率時將孔中細(xì)胞轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中使用培養(yǎng)液3（嘌呤霉素降至2μg/mL）繼續(xù)培養(yǎng)并大規(guī)模傳代以收集細(xì)胞系進行研究。每傳代5～7次時再次使用培養(yǎng)液2進行篩選。

1.2.2 RNA提取及實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）檢測MITF基因表達 按說明書使用Trizol Reagent提取總RNA，用分光光度儀（A260/280）測定總RNA，并按說明書使用PrimeScript?RT reagent Kit制備cDNA。MITF上游引物：5′?CGGGTCTCTGCTCTCCAGA?3′，下游引物：5′?CCGGCTGCTTGTTTTGGAA?3′。按下述方法配置 25μL 反應(yīng)液：（1）SYBR?Premix Ex TaqTM Ⅱ（2×）12.5 μL；（2）PCR 上游引物（10 μmol/L）1 μL；（3）PCR下游引物（10 μmol/L）1 μL；（4）DNA 模板 2 μL（＜100 ng，且液體量不超過反應(yīng)液總體積的10%）；（5）dH2O 8.5μL。擴增反應(yīng)條件：（1）預(yù)變性為 95℃、30 s，1次；（2）PCR 反應(yīng)為 95 ℃、5 s，60 ℃、30 s，40 次；（3）溶解。1.2.3 蛋白提取及蛋白質(zhì)印跡檢測MITF蛋白表達 收集對數(shù)生長期細(xì)胞，在4℃條件下使用蛋白抽提試劑盒裂解細(xì)胞并收集蛋白；使用Pierce?BCA Protein Assay Kit按標(biāo)準(zhǔn)流程測定收集的總蛋白。根據(jù)測定結(jié)果按40μg的總蛋白量加樣、檢測、跑膠、轉(zhuǎn)膜及顯影。圖像采集使用化學(xué)成像系統(tǒng)（ChemiDoc XRS+，Bio?Rad，USA）。圖像分析采用Quantity One4.6軟件。內(nèi)參使用β?actin蛋白。

1.2.4 黑素含量測定 （1）細(xì)胞外分泌黑素含量測定：使用不含酚紅的培養(yǎng)基在常規(guī)條件下培養(yǎng)細(xì)胞24 h并收集培養(yǎng)基（溶液1）；（2）細(xì)胞內(nèi)分泌黑素含量測定：收集上述去除培養(yǎng)基的細(xì)胞，使用蛋白抽提試劑盒提取蛋白，離心500 r/min，上清液（溶液3）進行總蛋白測定，收集下層黑色固體物質(zhì)與1 mol/L的NaOH溶液在60℃條件下孵育2 h并充分溶解（溶液2）。使用分光光度計在405 nm處測定黑素溶液1及溶液2中黑素含量。按每種細(xì)胞蛋白濃度標(biāo)準(zhǔn)化每種細(xì)胞內(nèi)外黑素含量[8]。

1.2.5 酪氨酸酶（TYR）活性及 TYR/TYR?1/TYR?2蛋白檢測 按下述方法配置溶液：（1）溶液A，配制含2%N，N?二甲基甲酰胺的磷酸鈉（100 mmol/L，pH 7.1）；（2）溶液 B，配制含 5 mmol/LL?左旋多巴的磷酸鈉（100 mmol/L，pH 7.1）；（3）溶液 C，配制含 20 mmol/L 的酚試劑去離子水。在細(xì)胞中加入0.5%Triton?X100（含1%脫氧膽酸鈉）并孵育2 h裂解細(xì)胞，再按2∶1∶1比例加入溶液A、B、C，在37℃條件下反應(yīng)10 min，然后在分光光度計下測定505 nm處吸光度。與1.2.4項相同，按每種細(xì)胞蛋白濃度標(biāo)準(zhǔn)化每種細(xì)胞的蛋白含量。

1.2.6 細(xì)胞增殖活性檢測（克隆形成實驗、MTT實驗） 取對數(shù)生長期細(xì)胞并計數(shù)，按每孔500個細(xì)胞接種于96孔板中（每種細(xì)胞重復(fù)5個孔），加入培養(yǎng)基并在細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，加入MTT溶液（5 mg/mL）10μL，繼續(xù)在細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育4 h，再加入甲臜溶解液100μL后繼續(xù)在細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育，直至結(jié)晶全部溶解，最后使用分光光度計測定570 nm處吸光度。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS18.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，組間和組內(nèi)比較采用單因素方差分析（One?Way ANOVA）。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組MITF基因及蛋白表達水平比較 與B16F10組比較，B16F10?1組MITF基因干擾效率最大（達82.7%），B16F10?2、B16F10?3 組 MITF 基因干擾效率分別為 62.3%、21.5%；B16F10?1、B16F10?2、B16F10?3 組基因表達水平與B16F10組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見圖1。與 B16F10 組比較，B16F10?1 組MITF蛋白表達水平最低，干擾效率最高（50.0%），B16F10?2、B16F10?3 組蛋白表達干擾率分別為 22.1%、11.6%；B16F10?1 、B16F10?2、B16F10?3 組基因表達水平與B16F10組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），與MITF基因表達水平基本一致。見圖2。表明B16F10?1為首選目標(biāo)細(xì)胞系，其次為B16F10?2。

圖1 各組MITF基因表達水平比較

2.2 各組增殖活性比較 與B16F10組比較，B16F10?NC組細(xì)胞增殖活性無明顯改變，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；B16F10?1組細(xì)胞增殖活性降低最明顯（達49.5%），B16F10?2組細(xì)胞增殖活性也有所降低（達23.8%）；B16F10?1、B16F10?2 組細(xì)胞增殖活性與 B16F10 組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖3。

2.3 各組細(xì)胞內(nèi)外黑素含量比較 B16F10?1組細(xì)胞內(nèi)外黑素含量降低最明顯（分別為49.7%、43.8%），B16F10?2組細(xì)胞內(nèi)外黑素含量降低程度分別為21.4%、16.8%；B16F10?1、B16F10?2 組細(xì)胞內(nèi)外黑素含量與B16F10組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），但B16F10?NC組細(xì)胞內(nèi)外黑素含量均無明顯改變，與B16F10組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），與MITF基因和蛋白表達趨勢一致，見圖4。

圖2 各組MITF蛋白表達水平比較

圖3 各組增殖活性比較

圖4 各組細(xì)胞內(nèi)外黑素含量比較

2.4 各組TYR活性比較 與B16F10組比較，B16F10?1組TYR活性降低最明顯（達48%），B16F10?2組TYR活性降低了 29.0%，B16F10?1、B16F10?2 組 TYR 活性與B16F10組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖5。

圖5 各組TYR活性比較

3 討 論

目前，已確定MITF選擇性表達于黑素細(xì)胞和黑素瘤細(xì)胞核，是黑素細(xì)胞的核蛋白和最重要的轉(zhuǎn)錄因子，在黑素細(xì)胞生成和活性方面具有關(guān)鍵性作用。目前，已證實該基因在黑素細(xì)胞起源細(xì)胞（如黑素母細(xì)胞、黑素細(xì)胞及黑素瘤細(xì)胞）中參與了形態(tài)、分化和生存的調(diào)節(jié)[7，9]；而在黑素瘤患者中該基因處于失調(diào)狀態(tài)[6]，是一種診斷黑素瘤靈敏度和特異性均較強的免疫標(biāo)記物[7]。

MITF在黑素細(xì)胞中特異表達，是調(diào)節(jié)黑素細(xì)胞發(fā)育的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子和總調(diào)控因子，參與了黑素細(xì)胞形態(tài)構(gòu)成、黑素合成、轉(zhuǎn)運和運輸。MITF主要通過調(diào)控黑素細(xì)胞中特異表達基因TYR的轉(zhuǎn)錄活性調(diào)節(jié)黑素分泌，TYR參與并調(diào)控黑素合成，是黑素生成的關(guān)鍵酶[10]。

本研究以MITF為靶基因，利用RNA干擾技術(shù)特異性抑制該基因及蛋白表達，觀察B16F10黑素瘤細(xì)胞增殖活性變化，進而探討MITF對黑素瘤細(xì)胞內(nèi)外黑素分泌水平的影響及與該分泌水平密切相關(guān)的TYR活性的影響，從而驗證MITF高表達在黑素瘤細(xì)胞中的關(guān)鍵作用。結(jié)果顯示，RNA干擾技術(shù)能在B16F10細(xì)胞中顯著抑制MITF基因及蛋白表達，最高干擾率分別達82.7%、50.0%；MTT實驗結(jié)果顯示，干擾MITF表達能顯著抑制B16F10細(xì)胞增殖活性，表明MITF對黑素瘤細(xì)胞增殖活性具有重要作用。與VACHTENHEIM等[11]研究結(jié)果一致。本研究B16F10細(xì)胞內(nèi)外黑素含量測定結(jié)果顯示，干擾MITF表達能顯著抑制黑素瘤細(xì)胞內(nèi)外黑素分泌水平；TYR活性測定結(jié)果顯示，干擾MITF表達也抑制了與黑素分泌水平密切相關(guān)的TYR的活性，表明MITF對黑素瘤細(xì)胞中的TYR活性及黑素生成均具有重要作用，與黑素瘤細(xì)胞中的黑素功能密切相關(guān)。

目前，較一致的看法是MITF在黑素細(xì)胞的黑素生成和活性方面均具有關(guān)鍵性作用。本研究結(jié)果不僅證明了MITF對黑素瘤細(xì)胞的增殖具有重要作用，更進一步證明了MITF在黑素瘤細(xì)胞黑素生成及活性調(diào)節(jié)方面發(fā)揮了關(guān)鍵性作用。為了更深入的研究，包括MITF如何調(diào)節(jié)黑素瘤細(xì)胞的增殖活性及黑素生成的活性，以及上、下游基因和相關(guān)信號通路等研究奠定了重要的實驗基礎(chǔ)，從而為惡性黑素瘤的治療提供了新的思路和策略。

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