閉 關 羅 勁 杜仲業(yè) 劉唐娟 陳一強
(廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學科,廣西 南寧,530021)
金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,S.a)是臨床常見的重要致病菌,可引起肺炎、腦膜炎和心內(nèi)膜炎,甚至膿毒血癥、金黃色葡萄球菌燙傷樣綜合征等全身感染[1]。金黃色葡萄球菌慢性感染遷延難愈的重要原因之一是細菌生物膜的形成;生物膜能協(xié)助細菌逃避免疫識別和免疫清除,降低抗生素的滲透能力,從而增強細菌的耐藥性[2]。大環(huán)內(nèi)酯類抗生素能與其他抗生素協(xié)同作用,抑制細菌生物膜形成,增強抗生素殺菌效力[3-4],本研究以克拉霉素作陽性對照,探討黃芩苷與頭孢他啶聯(lián)合作用后,對早期形成的金黃色葡萄球菌生物膜形成是否起抑制作用,以求從傳統(tǒng)中藥寶庫中尋求新的抗感染研究方向。
1.1 實驗材料
1.1.1 菌株:實驗菌株為臨床分離株,經(jīng)耐藥譜及蛋白A基因(spa)分型,編號為17546(t037)。質(zhì)控菌株為ATCC25923;均由我院臨床微生物檢驗中心提供。
1.1.2 載體:規(guī)格為1 cm×1 cm的醫(yī)用聚氯乙烯薄片(上海景年醫(yī)療器械有限公司),高壓蒸汽滅菌30 min后作為BF載體備用。
1.1.3 主要試劑:標準品黃芩苷由中國食品藥品鑒定研究院購入,標準品頭孢他啶和克拉霉素由中國藥品生物制品檢定所購入。M-H肉湯、胰蛋白胨大豆肉湯(中國陸橋技術責任有限公司);LB瓊脂、胰蛋白大豆瓊脂(TSA)(中國陸橋技術責任有限公司)。
1.2 方法
1.2.1 制備金黃色葡萄球菌生物膜體外模型:復壯金黃色葡萄球菌實驗菌株,取單菌落接種于含1%葡萄糖的TSB溶液20 mL中,37 ℃,200 r/min恒溫搖床搖晃培養(yǎng)18~20 h后,換新鮮TSB將細菌懸液稀釋到OD600=0.1,此吸光度下對應細菌數(shù)量約為4.75×108CFU/mL,將細菌懸液加入無菌24孔板中,每孔2 mL,再置入滅菌的BF載體,37 ℃恒溫培養(yǎng),隔天換新鮮TSB培養(yǎng)液,3 d后于載體表面可形成早期生物膜。
1.2.2 結(jié)晶紫染色法半定量細菌生物膜:把載體放入無菌生理鹽水中輕輕漂洗后晾干,以除去浮游菌;將晾干的載體用0.1%結(jié)晶紫進行染色,染色時間約15 min;待充分染色后,再將載體用無菌生理鹽水漂洗至液體清亮,以洗去結(jié)晶紫。晾干載體后,取95%乙醇1 mL將附著于載體上的結(jié)晶紫溶出,作用時間約5 min;最后取200 μL乙醇結(jié)晶紫溶液置于96孔板內(nèi),于分光光度計下測定OD570值。
1.2.3 MIC測定:依據(jù)2015年版CLSI,以試管2倍稀釋法測定上述藥物對實驗菌、質(zhì)控菌的MIC和MBC。
1.2.4 藥物對細菌生物膜的影響:將各組載體分入空白對照組、克拉霉素組、黃芩苷組、頭孢他啶組、黃芩苷+頭孢他啶組、克拉霉素+頭孢他啶組,黃芩苷、克拉霉素和頭孢他啶的最終濃度分別為512 μg/L、32 μg/L和256 μg/L;;各組載體經(jīng)無菌生理鹽水漂洗后,于建模3 d后,置入各組TSB中,每組TSB分別含上述相應濃度藥物,于37 ℃細菌孵育箱內(nèi)孵育,分別在實驗的第4、8、16和24小時后取出載體,將載體置入2 mL無菌生理鹽水內(nèi),經(jīng)超聲震蕩(15 min)與旋渦震蕩儀振蕩(5 min,3000 r/min),將生物膜及生物膜內(nèi)的金黃色葡萄球菌震蕩脫落,形成菌懸液,將菌懸液以連續(xù)稀釋法行活菌計數(shù),各組在各時間點均計數(shù)6份標本,菌落計數(shù)結(jié)果用±s表示。每次測定均重復3次并取平均值。
1.3 統(tǒng)計學方法:OD570值及懸浮液活菌計數(shù)值用SPSS20.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析(ANOVA分析)。
2.1 黃芩苷、頭孢他啶、克拉霉素對金黃色葡萄球菌的MIC及MBC測定結(jié)果:黃芩苷、頭孢他啶、克拉霉素對實驗菌株(S.a-17546)的MIC分別為2048 μg/L、64 μg/L、128 μg/L,頭孢他啶對實驗菌株的MBC為256 μg/L。
2.2 不同藥物組中細菌生物膜內(nèi)活菌計數(shù)結(jié)果:24 h內(nèi)空白對照組的BF內(nèi)活菌數(shù)無明顯變化(P>0.05),且單藥組(黃芩苷組ā克拉霉素組和頭孢他啶組)細菌生物膜內(nèi)活菌數(shù)與空白對照組比較,差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。聯(lián)用組(黃芩苷聯(lián)合頭孢他啶組、克拉霉素聯(lián)合頭孢他啶組)與空白對照組相比,第8、16、24小時生物膜內(nèi)活菌計數(shù)均明顯降低(P<0.01),且黃芩苷聯(lián)合頭孢他啶組于第24小時活菌數(shù)低于克拉霉素聯(lián)合頭孢他啶組(P<0.05),見表1。
表1 空白對照組、單藥組和聯(lián)用組中細菌生物膜內(nèi)活菌計數(shù)結(jié)果(±s,lgCFU/mL)
表1 空白對照組、單藥組和聯(lián)用組中細菌生物膜內(nèi)活菌計數(shù)結(jié)果(±s,lgCFU/mL)
注a:與空白對照組相比,P<0.01;b:黃芩苷聯(lián)合頭孢他啶組與克拉霉素聯(lián)合頭孢他啶組相比,P<0.05
空白對照組 7.871±0.201 7.598±0.391 7.844±0.288 7.860±0.335黃芩苷組 7.892±0.174 7.750±0.307 7.715±0.371 7.705±0.432克拉霉素組 7.902±0.240 7.739±0.397 7.723±0.357 7.812±0.349頭孢他啶組 7.858±0.140 7.436±0.554 7.514±0.381 7.557±0.531黃芩苷+頭孢他啶組 7.913±0.131 6.901±0.180a 6.303±0.507a 5.882±0.321a,b克拉霉素+頭孢他啶組 7.897±0.177 6.749±0.245a 6.437±0.419a 6.305±0.471a,b
表2 空白對照組、單藥組和聯(lián)用組細菌生物膜結(jié)晶紫半定量測定結(jié)果(±s)
表2 空白對照組、單藥組和聯(lián)用組細菌生物膜結(jié)晶紫半定量測定結(jié)果(±s)
注a:與空白對照組相比,P<0.01
空白對照組 2.505±0.186 2.190±0.626 2.432±0.173 2.554±0.199黃芩苷組 2.503±0.213 2.351±0.118 2.498±0.240 1.824±0.113a克拉霉素組 2.479±0.188 1.935±0.261 2.428±0.194 1.784±0.116a頭孢他啶組 2.527±0.230 2.010±0.149 2.352±0.191 2.174±0.196黃芩苷+頭孢他啶組 2.482±0.210 1.992±0.207a 1.195±0.498a 0.672±0.246a克拉霉素+頭孢他啶組 2.540±0.236 1.909±0.301a 1.329±0.458a 0.875±0.335a
2.3 細菌生物膜經(jīng)結(jié)晶紫染色半定量法測定結(jié)果:空白對照組在各時間點內(nèi)吸光度值無明顯變化(P>0.05);在單藥組中,頭孢他啶組與空白對照組吸光度值相比,差別無統(tǒng)計學意義(P>0.05);黃芩苷組和克拉霉素組吸光度值于第24小時低于空白對照組(P<0.05)。在聯(lián)用組(黃芩苷+頭孢他啶組ā克拉霉素+頭孢他啶組)中,兩組吸光度均從16 h開始低于空白對照組(P<0.01),見表2。
S.a是臨床常見致病菌,近年來隨著醫(yī)源性植入物及侵入性操作的增多,S.a引起的細菌生物膜相關性感染也日益增多。細菌生物膜是指細菌黏附于植入物或黏膜表面后,與細菌自身分泌的多糖、脂蛋白,以及機體產(chǎn)生的纖維蛋白等相互粘連聚集,最終形成的膜狀物。其形成、發(fā)展與成熟受密度感應系統(tǒng)(QS)調(diào)控,主要的兩種QS系統(tǒng)為agr系統(tǒng)和sar系統(tǒng),agr系統(tǒng)通過影響胞間多糖黏附素(PIA)的生成來調(diào)控細菌間相互黏附能力,進而影響生物膜形成。而sar系統(tǒng)一方面可以調(diào)控agr系統(tǒng)的表達,影響PIA形成,也能獨立發(fā)揮作用[5]。
我國具有豐富中草藥資源,祖國傳統(tǒng)醫(yī)藥在治療感染方面為國內(nèi)外眾多學者開拓了新的思路,希望能從天然藥物中開發(fā)出抗菌效果好、不良反應低的中藥[6],黃芩苷是中藥黃芩的主要有效成分,本課題組前期已經(jīng)證實黃芩活性成分可在體外及體內(nèi)抑制生物膜的形成[7-8],推測其機制可能與黃芩苷抑制細菌QS系統(tǒng)有關。
本研究中,黃芩苷與克拉霉素終濃度均未達其MIC,不表現(xiàn)出抑菌或殺菌作用,故黃芩苷組與克拉霉素組中BF載體,其活菌計數(shù)與空白對照組無明顯差別(P<0.05),而24 h后結(jié)晶紫半定量法測定的吸光度值均小于空白對照組(P<0.01),提示黃芩苷或克拉霉素在該濃度下雖不能直接殺滅細菌,但能影響生物膜的形成。
在黃芩苷或克拉霉素與頭孢他啶聯(lián)合應用后,聯(lián)合應用組的結(jié)晶紫半定量法測定的吸光度值在16 h、24 h均低于空白對照組(P<0.01),而活菌計數(shù)值則在第8 h便低于空白對照組,且延長作用時間,在16 h、24 h時,黃芩苷聯(lián)合頭孢他啶組的活菌計數(shù)值不僅低于空白對照組,也低于頭孢他啶聯(lián)合克拉霉素組。說明黃芩苷和克拉霉素均能在遠低于其MIC的濃度下,早期破壞金黃色葡萄球菌生物膜,為頭孢他啶清除細菌提供了條件。且黃芩苷隨著作用時間延長,其對頭孢他啶的增效作用更加明顯。
本實驗中頭孢他啶組,其濃度等于其MBC,但其活菌計數(shù)值與結(jié)晶紫半定量法所測定的吸光度值,與空白對照組無顯著統(tǒng)計學差異,提示在該濃度下,細菌生物膜的合成未受影響。本結(jié)果與藥敏實驗的差異,推測與細菌生物膜的存在有很大關系,這可能也是臨床工作中,對頭孢他啶藥敏實驗表現(xiàn)為敏感的金黃色葡萄球菌菌株,在臨床應用中效果不佳的緣故。
以上研究結(jié)果表明,黃芩苷可以在低濃度下破壞金黃色葡萄球菌生物膜,與頭孢他啶有協(xié)同增效作用,且增效作用隨著時間延長而增強,可能對未來開發(fā)新的抗菌藥物提供新思路。
參考文獻
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