范華宇， 龔 瑜， 于 倩， 史玉玲

(同濟(jì)大學(xué)附屬第十人民醫(yī)院皮膚科，上海 200072)

銀屑病(psoriasis)是免疫介導(dǎo)的多基因遺傳性皮膚病，環(huán)境因素在誘導(dǎo)銀屑病發(fā)病中起著重要的作用。CD4+T細(xì)胞在免疫系統(tǒng)中起主要的作用，在銀屑病的發(fā)病機(jī)制中也是關(guān)鍵因素，細(xì)胞因子和免疫細(xì)胞相互用導(dǎo)致角質(zhì)形成細(xì)胞增生，表皮增厚，是銀屑病的主要發(fā)病機(jī)制[1]。IL-21是一種四螺旋束細(xì)胞因子，屬于IL-2細(xì)胞因子家族，主要由激活的CD4+T細(xì)胞、Th17細(xì)胞和NKT細(xì)胞分泌[2-3]。白細(xì)胞介素-21受體(interleukin-21 receptor, IL-21R)在很多免疫細(xì)胞和非免疫細(xì)胞表面均有表達(dá),IL-21通過IL-21R和常見的細(xì)胞因子受體γc鏈發(fā)揮信號作用[4]。研究結(jié)果表明，IL-21及IL-21R和銀屑病發(fā)病密切相關(guān)，本研究旨在研究IL-21及IL-21R在銀屑病發(fā)病中的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 血液標(biāo)本 58例尋常型銀屑病患者外周血標(biāo)本取自同濟(jì)大學(xué)附屬第十人民醫(yī)院皮膚科門診和病房，所有病例均符合銀屑病的診斷標(biāo)準(zhǔn)。納入標(biāo)準(zhǔn)： 銀屑病面積和嚴(yán)重程度指數(shù)(psoriasis area and serverity index, PASI)≥10以及皮損面積>10%中、重度銀屑病的患者；所有患者入組前1個(gè)月內(nèi)未接受過系統(tǒng)治療，2周內(nèi)未外用銀屑病治療藥物。排除標(biāo)準(zhǔn)： 有嚴(yán)重感染和免疫抑制的患者；合并有肝、腎及其他嚴(yán)重疾病的患者；妊娠及哺乳期婦女。健康對照組20例，均為健康成人獻(xiàn)血員。所有患者和健康對照者均簽署知情同意書。血液標(biāo)本用來提取PBMCs細(xì)胞進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)。

1.1.2 組織標(biāo)本 選取其中25例銀屑病患者進(jìn)行皮膚組織病理檢查，15例正常對照組的皮膚來自整形外科手術(shù)腰背部正常皮膚。組織標(biāo)本用來抽提RNA和蛋白進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 主要試劑

流式相關(guān)抗體均來自eBioscience公司；總RNA提取液RNAisoTMPlus、反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTMRT reagent Kit、SYBR Green熒光定量PCR試劑盒SYBR Premix Ex Taq均購自寶生物工程(大連)有限公司；IL-21 ELISA試劑盒購自美國RD公司；淋巴細(xì)胞分離液、RPMI 1640培養(yǎng)液、胎牛血清均來自奧地利PAA Laboratories GmbH公司；PMA和伊屋諾霉素購自美國Sigma-Aldrich公司；兔多克隆IL-21抗體購自美國Novus Biologicals公司；兔多克隆IL-21受體抗體購自英國Abcam公司。

1.3 方法

1.3.1 PBMC的分離 用EDTA抗凝管采集研究對象5mL血液，用Ficoll-Hypaque密度梯度離心法獲得PBMC。將PBMC平均分裝2個(gè)1.5mL的EP管，一部分用于抽提RNA，另一部分用于IL-21R和細(xì)胞培養(yǎng)刺激5h后IL-21等細(xì)胞因子的檢測。

1.3.2 PBMC中IL-21、IL-21R的流式檢測 用含10%胎牛血清的1640細(xì)胞培養(yǎng)液將PBMC重懸，計(jì)數(shù)，將PBMC的濃度調(diào)整到2×106/mL，總體積為500μL。用96孔U型培養(yǎng)板作細(xì)胞培養(yǎng)，將500μL細(xì)胞懸液加入2孔中，每孔PBMC為1×106，其中一孔加入50ng/mL PMA，500ng/mL伊屋諾霉素和2.5μL Brefeldin，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，5h后進(jìn)行免疫熒光抗體的標(biāo)記；室溫避光表面染色CD4-FITC 15min；1mL PBS洗滌1次，每管加入100μL固定液室溫避光30min；1mL穿膜液洗滌2次，每管加入100μL穿膜液和IL-21-Alexa Fluor?647，同型對照管加入Isotype Control-Alexa Fluor?647，震蕩混勻，避光室溫20min；1mL穿膜液洗滌細(xì)胞后用300μL流式染色緩沖液重懸細(xì)胞，上流式細(xì)胞儀檢測，使用CELLQuest軟件收獲細(xì)胞并檢測。

1.3.3 PBMC中IL-21R的流式檢測 將每管PBMC調(diào)整到1×106PBMC，分別加入CD4-FITC、IL-21R-PE，室溫避光表面染色15min；1mL PBS洗滌細(xì)胞后用300μL流式染色Buffer重懸細(xì)胞，上流式細(xì)胞儀檢測。首先圈出CD4+的淋巴細(xì)胞，然后再從CD4+淋巴細(xì)胞中圈出CD4+IL-21R+的細(xì)胞。

1.3.4 細(xì)胞培養(yǎng) 用含10%胎牛血清的1640細(xì)胞培養(yǎng)液將PBMC重懸，用96孔U型培養(yǎng)板作細(xì)胞培養(yǎng)，將500μL細(xì)胞懸液加入1孔中，PBMC數(shù)量為1×106，加入50ng/mL PMA、500ng/mL Ionomycin，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5h，取上清液檢測IL-21水平。

1.3.5 PBMC RNA的抽提 向106個(gè)PBMC加入1mL RNAisoTMPlus后振蕩混勻，按照RNA抽提試劑盒說明進(jìn)行，RNA沉淀常溫干燥后，加20μL DEPC水溶解。皮膚組織稱重量，TRIzol組織勻漿，按RNA抽提試劑盒進(jìn)行抽提。取1.5μL在紫外分光光度計(jì)上測量RNA濃度，根據(jù)D260/D280的比值來估算核酸純度，正常值范圍為1.8～2.0。

1.3.6 反轉(zhuǎn)錄 參照TaKaRa公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行，按10μL的反應(yīng)體系配制RT反應(yīng)液(反應(yīng)液的配制在冰上進(jìn)行)： 總RNA為500ng，PrimeScript緩沖液2μL，PrimeScript RT酶混合I 0.5μL,Oligo dT Primer 0.5μL,Random 6 mers 0.5μL,余下的量用RNase Free dH2O補(bǔ)齊。

1.3.7 RT-PCR 本實(shí)驗(yàn)所用的引物，均由Invitrogen公司合成。實(shí)驗(yàn)步驟參照TaKaRa公司SYBR green熒光定量PCR試劑盒說明書，具體步驟如下： 進(jìn)行兩步法PCR擴(kuò)增反應(yīng)。預(yù)變性： 95℃ 30s，1個(gè)循環(huán)；PCR反應(yīng)： 95℃ 5s，60℃ 20s，40個(gè)循環(huán)；解鏈： 95℃ 15s，60℃ 30s，95℃ 15s，1個(gè)循環(huán)。得到每個(gè)標(biāo)本不同指標(biāo)的Ct值，根據(jù)公式2-⊿⊿Ct計(jì)算出所測指標(biāo)的相對表達(dá)量。

1.3.8 Western印跡法檢測IL-21和IL-21R在皮膚組織中的表達(dá) (1) 蛋白質(zhì)樣品制備： 利用液氮、研缽粉碎組織塊，加入裂解液，利用組織勻漿機(jī)進(jìn)一步勻漿，移入離心管，4℃ 12000r/min，離心10min，取上清液，BCA法測定蛋白濃度并校準(zhǔn)不同樣品的蛋白濃度。(2) 常規(guī)蛋白電泳： SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳后，將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，室溫避光封閉2h，相應(yīng)一抗4℃孵育過夜，膜漂洗3次后，二抗室溫孵育2h，應(yīng)用ECL顯色試劑盒顯色。

1.3.9 IL-21、IL-21R的ELISA測定 采集靜脈血5mL,以3000r/min，離心15min后取上清液。PBMC培養(yǎng)5h后取上清液，均于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩０凑誆LISA試劑盒說明書建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，樣品加樣，酶標(biāo)儀測定450nm處D450值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線讀取樣品濃度。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 CD4+IL-21+細(xì)胞和CD4+IL-21R+細(xì)胞在銀屑病患者PBMC中的表達(dá)

銀屑病患者外周血PBMC中CD4+IL-21+細(xì)胞百分率較健康對照組有顯著升高[銀屑病組(4.14±1.23)%，健康對照組(1.82±0.64)%，P<0.01)，CD4+IL-21R+細(xì)胞較健康對照組亦有顯著升高[銀屑病組(2.37±0.79)%，健康對照組(1.57±0.54)%，P<0.01]，見圖1。

圖1 CD4+IL-21+細(xì)胞和CD4+IL-21R+細(xì)胞在銀屑病外周血PBMC中的比例Fig.1 The ratio of CD4+IL-21+ cells and CD4+IL-21R+ cells in peripheral blood of psoriasis patientsA： 銀屑病患者和健康對照組PBMC中IL-21+細(xì)胞和IL-21R+細(xì)胞流式細(xì)胞儀散點(diǎn)圖；B： 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，與對照組相比，*P<0.01

2.2 IL-21、IL-21R mRNA在銀屑病患者PBMC中的表達(dá)

58例銀屑病患者及20例健康對照人群的PBMC中IL-21 mRNA的相對表達(dá)量分別為5.14±2.49和2.54±1.01；IL-21R mRNA的相對表達(dá)量分別為3.55±2.04和2.59±0.79。銀屑病患者外周血PBMC中IL-21、IL-21R表達(dá)水平均明顯高于正常對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，P<0.05)。

2.3 IL-21、IL-21R mRNA在銀屑病患者組織中的表達(dá)

RT-PCR檢測25例銀屑病患者皮損組織和15例正常對照者皮膚組織中IL-21 mRNA、IL-21R mRNA的表達(dá)。銀屑病患者和正常對照皮膚組織中IL-21 mRNA的相對表達(dá)量分別為12.4±4.56和3.59±1.29；IL-21R mRNA的相對表達(dá)量分別為5.35±2.28和2.59±0.85。銀屑病患者皮膚組織中IL-21、IL-21R表達(dá)水平均明顯高于正常對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

圖2 健康對照組和銀屑病患者皮膚組織中IL-21和IL-21R mRNA的表達(dá)水平Fig.2 The mRNA expression of IL-21 and IL-21R in skin tissues of psoriasis patients and healthy controls與對照組比較，*P<0.01

2.4 銀屑病患者皮膚組織中IL-21、IL-21R的蛋白表達(dá)水平

Western印跡法檢測25例銀屑病患者皮損組織和15例正常對照者皮膚組織中IL-21、IL-21R蛋白的表達(dá)。Western印跡法結(jié)果顯示，銀屑病患者和正常對照皮膚組織相比IL-21、IL-21R蛋白表達(dá)水平明顯升高，見圖3。

圖3 Western印跡法檢測銀屑病患者和正常對照皮膚組織中IL-21、IL-21R蛋白表達(dá)差異Fig.3 The protein expression of IL-21 and IL-21R in skin tissues of psoriasis patients and healthy controls detected by Western blotting

2.5 銀屑病患者PBMC培養(yǎng)上清中IL-21水平

銀屑病患者PBMC分泌IL-21的水平為(159.35±15.15)ng/L，明顯高于正常對照組的(67.76±12.08)ng/L，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

3 討 論

銀屑病是在多基因遺傳背景下由T細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥性皮膚病，以角質(zhì)形成細(xì)胞過度增殖和異常分化及炎性細(xì)胞浸潤為主要特征[5]。真皮內(nèi)的CD4+T細(xì)胞及其產(chǎn)生的細(xì)胞因子是銀屑病發(fā)病的中心環(huán)節(jié)，表皮角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖只是免疫學(xué)反應(yīng)繼發(fā)結(jié)果之一[6]。因此，探索細(xì)胞因子在銀屑病發(fā)病中的作用對于探討有效的治療方法有著重要的意義。

人類IL-21基因位于染色體4q26-q27上[2]，IL-21通過IL-21R及γc鏈發(fā)揮信號轉(zhuǎn)導(dǎo)作用。γc鏈?zhǔn)荌L-21R復(fù)合體的組成部分，IL-21通過IL-21R/γc鏈激活JAK1、JAK3、STAT1、STAT3通路[7]。在γc鏈缺失的情況下IL-21可以和IL-21R結(jié)合，但是細(xì)胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)只有在γc鏈存在的情況下才能進(jìn)行[2]。IL-21R產(chǎn)生的信號誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性B細(xì)胞(B10細(xì)胞)擴(kuò)增和IL-10分泌，因此人和鼠B10細(xì)胞能通過IL-21的交互認(rèn)知調(diào)控T細(xì)胞自身免疫[8]。IL-21有促進(jìn)淋巴細(xì)胞增生的功能，增加CD8+T細(xì)胞和NK細(xì)胞的毒性，并直接抑制樹突狀細(xì)胞的抗原提呈作用[9]。有研究在Ⅰ型糖尿病的模型中發(fā)現(xiàn)，在體內(nèi)和體外T-bet缺乏均導(dǎo)致IL-21依賴的CD8+T細(xì)胞細(xì)胞毒性的缺陷，因此，IL-21通過轉(zhuǎn)錄因子T-bet的作用驅(qū)動CD8+CTL的分化[10]。IL-21對NK細(xì)胞的生長和功能有多重效果，能通過上調(diào)IFN-γ和顆粒酶B，濃度依賴性的增強(qiáng)NK細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，IL-21促進(jìn)NK細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞產(chǎn)生更多的穿孔素和顆粒酶B，增強(qiáng)細(xì)胞毒性作用[11]。IL-21能促進(jìn)IL-23R的表達(dá)，增加IL-23的細(xì)胞應(yīng)答。IL-21雖然可以在體外促進(jìn)Th17細(xì)胞的分化，但在過敏性腦炎模型中，Th17細(xì)胞的發(fā)展在WT和IL-21r敲除的小鼠中并沒有差別[12]。也有研究報(bào)道IL-21可以增加γδT細(xì)胞產(chǎn)生的IL-17[13]。IL-21可抑制Treg細(xì)胞的功能，并且在Treg細(xì)胞缺失的情況下，IL-21促進(jìn)炎癥性疾病的發(fā)生[14]。Tfh細(xì)胞分泌IL-21，IL-21促進(jìn)Tfh的分化[15]，但I(xiàn)L-21對于Tfh細(xì)胞和Th17細(xì)胞的發(fā)展不是必需的[7]。

研究發(fā)現(xiàn)，IL-21參與了多種自身免疫性疾病的發(fā)生，如系統(tǒng)性硬化、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)、銀屑病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、糖尿病等。在系統(tǒng)性硬化的皮膚組織和RA患者的關(guān)節(jié)滑膜組織內(nèi)，IL-21R mRNA的表達(dá)顯著升高，RA患者IL-21R陽性細(xì)胞高表達(dá)在滑膜侵入關(guān)節(jié)軟骨和骨的部位，尤其在滑膜組織內(nèi)的巨噬細(xì)胞和成纖維細(xì)胞[16]。研究發(fā)現(xiàn)銀屑病患者的皮損中IL-21蛋白和mRNA均明顯高于同一患者的非皮損和正常人。銀屑病患者血清中IL-21的水平較正常對照組血清中IL-21的水平升高，并和PASI評分呈正相關(guān)。關(guān)于Ustekinumab治療銀屑病的可能靶點(diǎn)研究顯示，對該單抗治療反應(yīng)不敏感的患者和敏感患者相比較，反應(yīng)敏感患者皮損部位的IL-20，IL-21，P40的mRNA水平顯著下調(diào)[18]。在嚴(yán)重免疫缺陷小鼠(SCID小鼠)的真皮內(nèi)注射重組IL-21以及Th1、Th17炎性細(xì)胞可以誘導(dǎo)出銀屑病樣皮損，在SCID小鼠的移植皮損中注射IL-21的抗體，移植皮損有所好轉(zhuǎn)?？梢姡琁L-21在銀屑病的發(fā)病中發(fā)揮了重要的作用。綜上所述，IL-21能促使多種免疫細(xì)胞分泌炎癥因子，增強(qiáng)細(xì)胞毒性細(xì)胞的殺傷作用，在免疫機(jī)制中發(fā)揮著多種作用。

本研究證實(shí)在銀屑病患者外周血和皮損中存在IL-21和IL-21R，其水平明顯高于正常對照組，可見IL-21和IL-21R在銀屑病的發(fā)病中發(fā)揮了重要的作用，為探索IL-21在銀屑病中發(fā)病中的作用提供了理論依據(jù)，將來IL-21有望成為治療性細(xì)胞因子用于銀屑病治療。

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