張 瑜， 奚雪滔， 趙 雪

(上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬同仁醫(yī)院泌尿外科，上海 200336)

前列腺癌(prostate cancer)是男性十大致死性腫瘤之一，發(fā)病率逐步上升[1]。前列腺癌根治術(shù)和內(nèi)分泌治療能改善患者生存期，中、高危局限性前列腺癌的10年復(fù)發(fā)率分別為54%和71%[2]，中國前列腺癌患者近10年死亡率緩慢上升[1]。在內(nèi)分泌治療18～24個月后，大部分患者會進展為激素非依賴性前列腺癌[3]；雖然仍然可以選擇行放化療，但預(yù)后差，進展迅速。因此，亟待尋找新的治療方法，而基因靶向治療也是近年一直探索的方向。ZIC5(Zic family member 5)是ZIC家族中一員。ZIC蛋白家族參與調(diào)控許多發(fā)育過程，ZIC1、ZIC2、ZIC3參與調(diào)控轉(zhuǎn)錄活動，可以抑制I-mfa。但關(guān)于ZIC5的研究甚少，有研究報道ZIC5具有促癌作用。Satow等報道了ZIC5受PDGFD調(diào)控，增強黑色素瘤的侵襲性。本研究旨在探討ZIC5在前列腺癌中的表達水平及其對前列腺癌生物學(xué)特性的影響。

1 材料與方法

1.1 細胞培養(yǎng)

人前列腺癌細胞株P(guān)C3和LNCaP購自上海中國科學(xué)院細胞庫。LNCaP為雄素依賴性前列腺癌細胞。PC3細胞源于骨轉(zhuǎn)移的前列腺癌，具有雄激素非依賴性。兩種細胞均培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液(Gibco，上海立菲生物科技有限公司)中，置于37℃、5%CO2的孵箱中培養(yǎng)。人前列腺正常上皮細胞RWPE-l購自上海中科院細胞庫，使用KSMF培養(yǎng)液(Gibco，上海立菲生物科技有限公司)培養(yǎng)。293細胞使用DMEM(10%胎牛血清和1%抗生素)培養(yǎng)液培養(yǎng)。抽提PC3、LNCaP和RWPE-1細胞的RNA和蛋白。選取2013年1月至2016年12月于上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬同仁醫(yī)院收集的前列腺癌根治術(shù)標本以及配對的癌旁正常組織標本38例，平均年齡(70.8±7.6)歲。

1.2 細胞轉(zhuǎn)染

人前列腺癌細胞LNCaP和PC3接種于6孔培養(yǎng)板并貼壁后，使用陽離子脂質(zhì)載體LipofectamineTM2000將ZIC5 siRNA轉(zhuǎn)染入LNCaP和PC3細胞，轉(zhuǎn)染前細胞密度為70%～85%，轉(zhuǎn)染空白載體組(negative control, NC)組作為陰性對照組，siRNA和NC組轉(zhuǎn)染終濃度為50nmol/L，轉(zhuǎn)染48h后抽提總RNA，72h后抽提總蛋白。ZIC5 siRNA序列由上海吉瑪制藥有限公司設(shè)計，并合成為siRNA Oligo用于瞬時轉(zhuǎn)染。其中ZIC5 siRNA-3序列如下。上游引物： 5′-CGUAGCAAAGGAACAGCA-TT-3′，下游引物： 5′-UGCUGUUCCUUUGCUAC-GGTT-3′。NC序列： 上游引物5′-UUCUCCGAAC-GUGUCACGUTT-3′；下游引物5′-ACGUGACACG-UUCGGAGAATT-3′。

1.3 熒光定量RT-PCR

TRIzol(Invitrogen，美國)法提取各實驗組LNCaP和PC3細胞以及液氮中凍存的前列腺癌組織標本總RNA，反轉(zhuǎn)錄獲取cDNA后進行PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)條件如下： 94℃變性；94℃變性20s，57℃退火40s，72℃延伸40s，32個循環(huán)；72℃孵育10min。qRT-PCR引物如下。ZIC5上游引物： 5′-GTCTATGGGCCTGATTGTGTAGT-3′；下游引物： 5′-GCCAAATCCGCTAATCTCA-GC-3′；GAPDH上游引物： 5′-GGAGCGAGATC-CCTCCAAAAT-3′；下游引物： 5′-GGCTGTTGT-CATACTTCTCATGG-3′。miR-449熒光定量則使用TaqMan microRNA檢測試劑盒和TaqMan探針。2-ΔΔCt法分析相對表達量。

1.4 Western印跡法分析

轉(zhuǎn)染siRNA ZIC5 72h，使用RIPA細胞裂解液(江蘇碧云天公司，P1003B)提取蛋白，二辛可酸(bicinchonininc acid, BCA)試劑盒(江蘇碧云天公司)測定蛋白濃度，并調(diào)整待測樣本的蛋白質(zhì)含量。每孔加30μg的蛋白樣品，電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，按1∶1000稀釋一抗孵育，置4℃孵育過夜。PBST中洗膜3次，每次10min，分別按1∶1000稀釋二抗孵育1h，PBST中洗膜3次，每次10min。通過Odyssey雙色紅外熒光成像系統(tǒng)(美國LICOR公司)讀取目的電泳條帶的光密度值。ZIC5(貨號： ab115566)、E-cadherin(貨號： ab15148)、Vimentin(貨號： ab92547)購于Abcam公司。

1.5 Transwell遷移實驗

siRNA組和NC對照組細胞從6孔板中消化下來，將細胞密度調(diào)整為3×105/mL，取0.2mL接種到Transwell小室，將Transwell小室置于24孔板內(nèi)，上室內(nèi)為含1%血清的培養(yǎng)液，下室添加含10%血清的培養(yǎng)液0.5mL。培養(yǎng)18h后用棉簽頭擦掉小室內(nèi)細胞，甲醇固定，0.1%結(jié)晶紫染色，洗凈風(fēng)干后于Leica熒光倒置顯微鏡200倍視野下拍照，隨機選取4個視野拍照，計數(shù)細胞。

1.6 細胞侵襲實驗

將Matrigel在4℃冰箱中融化成液體，1∶8稀釋后，在上室加入稀釋后的Matrigel(BD公司)60～80μL，37℃ 30min使Matrigel聚合成凝膠。siRNA組和NC對照組細胞從6孔板中消化下來，調(diào)整細胞密度為4×105/ml，取0.2mL接種到Transwell小室，并將Transwell小室置于24孔板內(nèi)，上室內(nèi)為含1%血清的培養(yǎng)液，下室為含10%滅活血清的培養(yǎng)液。培養(yǎng)20h后用棉簽頭擦掉小室內(nèi)細胞，甲醇固定，0.1%結(jié)晶紫染色，洗凈風(fēng)干后于Leica熒光倒置顯微鏡200倍視野下拍照，隨機選取4個視野拍照，計數(shù)細胞。

1.7 miRNA預(yù)測及雙熒光素酶報告實驗

使用Target Scan和miRanda生物信息平臺分析，在ZIC5 3’UTR區(qū)320～326位點上可能是miR-449家族的結(jié)合位點，體外合成該位點的DNA片段(wild type, WT)及該位點缺失的突變體的DNA片段(Mutant，MUT)，并將這兩個片段克隆至含雙熒光素酶報告基因的載體psiCHECK-2中。WT和MUT質(zhì)粒與miR-449家族mimics(hsa-miR-449a： UGGC-AGUGUAUUGUUAGCUGGU；hsa-miR-449b： AGG-CAGUGUAUUGUUAGCUGGC)[5]分別轉(zhuǎn)染至293細胞中，48h后熒光素酶檢測試劑盒測熒光素酶活性。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 ZIC5在前列腺癌中表達水平上升

定量PCR顯示，在前列腺癌細胞株P(guān)C3(PC3vsRWPE-1，t=7.625，P=0.002)和LNCaP(LNCaPvsRWPE-1，t=3.519，P=0.025)中表達水平顯著高于正常前列腺上皮細胞RWPE-1。38例前列腺癌中，28(75.7%)例前列腺癌患者標本ZIC5表達水平較癌旁正常組織高(t=4.201，P<0.001)。高表達的ZIC5與前列腺癌Gleason評分具有相關(guān)性。根據(jù)Gleason評分將入組患者分為≥7分(23例)組和<7分組(15例)，以及根據(jù)ZIC5表達水平的中位數(shù)分為ZIC5高表達組(28例)和低表達組(10例)，結(jié)果顯示在Gleason評分≥7分組中，ZIC5高表達患者比例顯著升高(20/23)，F(xiàn)isher精確概率相關(guān)性分析顯示差異有統(tǒng)計學(xué)意義，表明ZIC5表達水平與Gleason評分具有相關(guān)性(P<0.05)。

2.2 siRNA成功干擾ZIC表達水平

使用LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染ZIC5 siRNA。q-RT-PCR顯示，轉(zhuǎn)染siRNA后，成功干擾ZIC5 RNA在前列腺癌PC3和LNCaP中的表達水平，蛋白質(zhì)免疫印跡雜交顯示，ZIC5蛋白水平較對照組也顯著下降，見圖1。

圖1 si-ZIC5成功干擾ZIC5 mRNA和蛋白在前列腺癌細胞株中表達Fig.1 ZIC5 mRNA and protein were successfully knocked down by using siRNA ZIC 5A： siRNA ZIC5成功干擾；B： ZIC5蛋白在前列腺癌細胞株中的表達；與NC組相比，*P<0.001

2.3 ZIC5 siRNA抑制前列腺癌細胞增殖

成功干擾ZIC5在前列腺癌細胞株中的表達水平后，CCK-8增殖能力檢測顯示，PC3和LNCaP細胞的在24h后增殖能力出現(xiàn)下降，與對照組比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見圖2。

2.4 ZIC5 siRNA抑制前列腺癌細胞遷移和侵襲

成功干擾ZIC5在前列腺癌細胞株中的表達水平后，Transwell遷移能力檢測顯示，PC3(NCvssi-ZIC5：t=18.73，P<0.001)和LNCaP(NCvssi-ZIC5：t=16.2，P<0.001)細胞的遷移能力出現(xiàn)下降，同對照組比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。在Transwell上室鋪Matrigel基質(zhì)膠，檢測干擾ZIC5后前列腺癌細胞侵襲能力變化。結(jié)果顯示，siRNA組PC3(NCvssi-ZIC5：t=7.82，P<0.01)和LNCaP前列腺癌細胞侵襲能力同NC對照組相比顯著下降(NCvssi-ZIC5：t=4.62，P<0.01)，見圖3。

圖2 干擾ZIC5表達后顯著抑制前列腺癌細胞增殖Fig.2 Proliferation of prostate cancer cells was suppressed after downregulation of ZIC5A： PC3；B： LNCaP；與NC組相比，*P<0.01

圖3 干擾ZIC5抑制前列腺癌細胞遷移能力和侵襲能力Fig.3 Knock-down of ZIC 5 inhibited cell migration and cell invasion of prostate cancer cellsA： 前列腺細胞遷移能力；B： 前列腺癌細胞侵襲能力；與NC組相比，*P<0.05

2.5 ZIC5與miR-449表達呈負相關(guān)

通過miRanda和Target Scan生物信息平臺，篩選到miR-449家族可能是ZIC5上游調(diào)控miRNA。熒光定量PCR結(jié)果顯示，miR-449a(24/38)和miR-449b(25/38)在前列腺癌組織中表達水平顯著低于癌旁正常組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，見圖4。線性回歸分析發(fā)現(xiàn)，ZIC5 mRNA與miR-449a(r=-0.64，P<0.05)、miR-449b(r=-0.52，P<0.05)在前列腺癌組織中的表達水平呈負相關(guān)，見圖5。構(gòu)建ZIC5 3’UTR野生型載體(WT)以及miR-449a和miR-449b結(jié)合位點突變型載體(MUT)，突變ZIC5 3’UTR上miR-449a和miR-449b結(jié)合位點后，轉(zhuǎn)入miR-449a和miR-449b，相對熒光值未見明顯變化，而野生型中則顯著降低，見圖5，表明miR-449a和miR-449b，結(jié)合ZIC5 3’UTR，干擾其表達。

圖4 ZIC5與miR-449a家族在前列腺癌中的表達水平及雙熒光素酶基因驗證Fig.4 Correlation between ZIC5 and miR-449 family in prostate cancer samples and miR-449 family targeting ZIC5 3’UTR was verifiedA：ZIC5 3’UTR 上miR-449a和miR-449b結(jié)合位點預(yù)測；B：miR-449a和miR-449b在前列腺癌和癌旁正常組織中表達水平； C：雙熒光素酶報告基因驗證miR-449a和miR-449b靶向ZIC5 3’UTR；與癌旁正常組織相比，*P<0.05

圖5 miR-449a和miR-449b與ZIC5相關(guān)性分析Fig.5 Correlation analysis between miR-449a, miR-449b and ZIC5

2.6 miR-449和ZIC5逆轉(zhuǎn)前列腺癌EMT狀態(tài)

轉(zhuǎn)染siRNA后，EMT通路中，Vimentin蛋白表達水平顯著下降，E-cadherin水平呈現(xiàn)上升。轉(zhuǎn)染ZIC5上游抑制miRNA miR-449家族mimics后，ZIC5、Vimentin蛋白水平呈現(xiàn)下降，E-cadherin水平上升，見圖6。因此，miR-449家族通過靶向ZIC5，逆轉(zhuǎn)EMT通路，抑制前列腺癌細胞生長。

圖6 ZIC5激活前列腺癌中的上皮間質(zhì)狀態(tài)Fig.6 ZIC5 activates epithelial-mesenchymal transition in prostate cancer

3 討 論

前列腺癌在我國的發(fā)病率正呈逐年上升的趨勢，雖然前列腺癌根治和內(nèi)分泌治療能延長患者生存期，但進展為非激素依賴性前列腺癌時，腫瘤則發(fā)展迅速。基因靶向治療可為非激素依賴性前列腺癌帶來新的治療策略，關(guān)于治療靶點的研究也較多，但尚未出現(xiàn)特異和敏感性高的靶點。Nakata等[6]在非洲蟾蜍中鑒定出ZIC5。目前研究發(fā)現(xiàn)，ZIC基因家族編碼鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子在中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中具有重要作用，Nyholm等[7]報道了ZIC5在中腦蓋發(fā)育過程中促進細胞增殖，組合的ZIC2-ZIC5通過調(diào)節(jié)Wnt信號通路調(diào)節(jié)細胞增殖。但關(guān)于ZIC5在腫瘤中作用的研究則甚少。Sun等[8]報道ZIC5在非小細胞肺癌(non-small-cell lung cancer, NSCLC)中表達水平上升，異常表達水平與NSCLC分級具有相關(guān)性。沉默ZIC5后，NSCLC細胞被抑制在G2期，細胞增殖能力被抑制[9]。本研究發(fā)現(xiàn)ZIC5在前列腺癌中表達水平較癌旁正常組織高，并且在Gleason評分高的組織中表達水平也高于對照組。干擾ZIC5后顯著抑制前列腺癌細胞的增殖和遷移。ZIC5通過調(diào)節(jié)cyclin B1和CDK1磷酸化水平調(diào)節(jié)NSCLC細胞的增殖和侵襲。ZIC5不僅與腫瘤的發(fā)生相關(guān)，在腫瘤耐藥性獲得上也具有一定作用。Satow等[4]研究發(fā)現(xiàn)，ZIC5過表達能顯著增強黑色素瘤細胞在體內(nèi)外的生長和轉(zhuǎn)移以及對化療藥物的耐受，ZIC5可能通過調(diào)節(jié)PDGFD和FAK促進黑色素瘤的發(fā)生、進展。

本研究通過生物信息學(xué)以及靶基因?qū)嶒烌炞C，ZIC5受miR-449家族調(diào)控，miR-449靶向ZIC5的3’-UTR，并且逆轉(zhuǎn)EMT通路。microRNA在前列腺癌的發(fā)生和進展中具有重要作用[10]，miR-449家族在許多腫瘤中是癌基因，促進腫瘤的發(fā)生和進展。Bou等[11]報道m(xù)iR-449在胃癌中表達水平下降，過表達miR-449可以激活抑癌基因P53，抑制胃癌細胞生長和轉(zhuǎn)移。Luo等[12]研究顯示，miR-449在非小細胞肺癌中表達下降，過表達miR-449后抑制癌基因c-Met，抑制非小細胞肺癌的遷移和侵襲。因此，高表達的ZIC5促進腫瘤的發(fā)生和進展，在前列腺癌中充當癌基因作用，ZIC5的異常表達受miR-449家族調(diào)控，其在前列腺癌中表達水平顯著下降。ZIC5可能系潛在的靶向治療的靶基因。

【參考文獻】

[1] CHEN W, ZHENG R, BAADE P D, et al. Cancer statistics in China, 2015[J]. CA Cancer J Clin, 2016,66(2)： 115-132.

[2] D’AMICO A V, MOUL J W, CARROLL P R, et al. Surrogate end point for prostate cancer-specific mortality after radical prostatectomy or radiation therapy[J]. J Natl Cancer Inst, 2003,95(18)： 1376-1383.

[3] WONG Y N, FERRALDESCHI R, ATTARD G, et al. Evolution of androgen receptor targeted therapy for advanced prostate cancer[J]. Nat Rev Clin Oncol, 2014,11(6)： 365-376.

[4] SATOW R, NAKAMURA T, KATO C, et al. ZIC5 drives melanoma aggressiveness by PDGFD-mediated activation of FAK and STAT3[J]. Cancer Res, 2017,77(2)： 366-377.

[5] YANG X, FENG M, JIANG X, et al. miR-449a and miR-449b are direct transcriptional targets of E2F1 and negatively regulate pRb-E2F1 activity through a feedback loop by targeting CDK6 and CDC25A[J]. Genes Dev, 2009,23(20)： 2388-2393.

[6] NAKATA K, KOYABU Y, ARUGA J, et al. A novel member of the Xenopus Zic family, Zic5, mediates neural crest development[J]. Mech Dev, 2000,99(1-2)： 83-91.

[7] NYHOLM M K, WU S F, DORSKY R I, et al. The zebrafish zic2a-zic5 gene pair acts downstream of canonical Wnt signaling to control cell proliferation in the developing tectum[J]. Development, 2007,134(4)： 735-746.

[8] SUN Q, SHI R, WANG X, et al. Overexpression of ZIC5 promotes proliferation in non-small cell lung cancer[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2016,479(3)： 502-509.

[9] MALUMBRES M, BARBACID M. Cell cycle, CDKs and cancer： a changing paradigm[J]. Nat Rev Cancer, 2009,9(3)： 153-166.

[10] 李軍亮,吳登龍,黃盛松,等.miRNA-29a調(diào)控H3K4甲基化在前列腺癌病理機理中的作用[J].同濟大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版),2016,37(6)： 6-11.

[11] BOU-KHEIR T, FUTOMA-KAZMIERCZAK E, JACOBSEN A, et al. miR-449 inhibits cell proliferation and is down-regulated in gastric cancer[J]. Mol Cancer, 2011,10： 29.

[12] LUO W, HUANG B, LI Z, et al. MicroRNA-449a is downregulated in non-small cell lung cancer and inhibits migration and invasion by targeting c-Met[J]. PLoS One, 2013,8(5)： e64759.