張旭南， 王培軍

(同濟大學附屬同濟醫(yī)院影像科,上海 200065)

肺癌是一種嚴重威脅人類健康的惡性腫瘤，居我國腫瘤發(fā)病率和死亡率的首位[1-2]。早期肺癌起病隱匿，常規(guī)臨床檢查難以發(fā)現(xiàn)微小癌灶，當出現(xiàn)相應(yīng)的肺癌癥狀時，預(yù)示著肺癌進展到中晚期或存在遠處轉(zhuǎn)移，喪失根治可能。因此對肺癌早期診斷及治療的研究具有重要的臨床意義和價值。臨床常用檢查手段是采用CT探查肺癌病灶，但對小病灶缺乏較高的特異性。近年來隨著分子影像學的發(fā)展，由納米化藥物作為載體裝載成像劑并修飾腫瘤特異性標記物而制成的分子影像探針，在細胞層面通過探針與癌細胞特異性高表達的蛋白發(fā)生反應(yīng)，實現(xiàn)腫瘤早期敏感的特異性成像。RGD-Gd@BSA-Ce6是以牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA)作為載體[3]，裝載釓劑及光敏劑Ce6，使具有磁共振/熒光雙模態(tài)成像功能同時發(fā)揮光敏劑光動力治療作用。文獻報道，整合素αvβ3受體在肺癌中明顯高表達[4]。αvβ3被證實參與了肺癌組織發(fā)生、生長、侵襲和轉(zhuǎn)移過程中的新生血管形成。不僅如此，αvβ3受體在肺癌中的高表達又可以增強癌細胞的惡性程度及耐化療藥的能力[5]。而小分子多肽精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸序列(Arg-Gly-Asp, RGD)[6]可特異性識別并結(jié)合整合素αvβ3受體，因此可作為與肺癌細胞特異性結(jié)合的靶向劑。本研究通過體外測定RGD-Gd@BSA-Ce6的弛豫率和其磁共振T1加權(quán)圖像，評估該納米探針的MR成像性能；采用激光共聚焦成像和細胞光照毒性實驗評估探針與肺癌細胞的靶向親和力和光動力治療效果，MTT實驗評價納米探針的生物安全性。

1 材料與方法

1.1 細胞與試劑

環(huán)狀RDG小分子多肽、納米探針Gd@BSA-Ce6由同濟大學生物醫(yī)學工程與納米材料研究院李永勇教授實驗課題組提供。非小細胞肺癌細胞系A(chǔ)549由同濟大學附屬肺科醫(yī)院提供；DMEM高糖型培養(yǎng)液和PBS(磷酸鹽緩沖液)購自美國HyClone公司；胎牛血清購自美國Gibco公司。

1.2 細胞培養(yǎng)與傳代

以下各項操作均在同濟大學生物醫(yī)學工程與納米材料研究院無菌細胞培養(yǎng)室的超凈臺中進行。人肺腺癌細胞A549在DMEM培養(yǎng)液(含10%胎牛血清)中維持，置于37℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細胞為單層貼壁生長，待貼壁細胞融合達80%～90%時以胰酶(含0.02%EDTA)消化傳代。

1.3 納米探針磁共振T1弛豫率及T1加權(quán)信號采集

將RGD-Gd@BSA-Ce6和商品化Gd-DTPA(商品名： 釓噴酸葡胺注射液)用PBS稀釋獲得不同濃度(以Gd3+的濃度計0.022、0.043、0.087、0.173、0.347、0.693mmol/L)，每一種濃度取200μL置于核磁管中，采用體外磁場發(fā)生儀(EIS AB MFG-1000 In Vitro Magnetic Field Generator)進行T1弛豫時間數(shù)據(jù)的采集，并計算RGD-Gd@BSA-Ce6和Gd-DTPA各自T1的弛豫率。弛豫時間測量完成后，對r1值進行擬合計算。

將所用樣品放置于磁共振線圈中(頭頸部線圈)，采用西門子公司3.0T磁共振(Siemens Verio 3.0T MRI)進行橫斷位掃描，掃描參數(shù)為： 重復時間(repeat time,TR)=600ms，回波時間(echo time,TE)=10ms,層厚(slice thickness)=2.0mm,FOV read=150mm。將掃描圖像傳輸至工作站。

1.4 激光共聚焦成像

取懸浮在高糖DMEM培養(yǎng)液中的A549細胞進行細胞計數(shù)，配制成2ml細胞懸液接種在6孔板中(3.0×105/孔)。隨后置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h,待細胞貼壁。然后滴加Ce6、Gd@BSA-Ce6和RGD-Gd@BSA-Ce6(Ce6的最終濃度為0.6μmol/L)，在37℃下共培養(yǎng)2h，然后將細胞用PBS漂洗2次，每孔滴加4%多聚甲醛1ml固定10min，去除多聚甲醛后用0.5ml的DAPI染色10min。用PBS漂洗3次后，滴加抗熒光淬滅封片劑，錫箔紙封裝避光保存。最后采用共聚焦激光掃描顯微鏡成像。

1.5 A549細胞光動力治療

將A549細胞懸液100μL/孔(細胞數(shù)目約為8×103)分別加入96孔板中，每一種濃度設(shè)置4個復孔，隨后置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h,待細胞貼壁。將事先配置好的含藥培養(yǎng)基Gd@BSA-Ce6、RGD-Gd@BSA-Ce6和游離Ce6溶液(以Ce6濃度計： 0.3、0.6、1.2、2.4、4.8μmol/L)加入96孔板中(100μL/孔)共孵育24h。同時設(shè)立兩組對照組，一組加入不含任何細胞和納米材料的培養(yǎng)基，另一組只加入含細胞的培養(yǎng)基。取1個96孔板做光照組，給予650nm波長光激發(fā)，強度為5mW/cm2，每孔光照持續(xù)3min。光激發(fā)結(jié)束將光照組96孔板置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育4h，隨后每個孔加入CCK8檢測試劑20μL,再次孵育1h后使用酶標儀于450nm處測定每孔吸光度(D450)并計算細胞存活率。

1.6 細胞水平生物安全性

為了了解細胞水平上RGD-Gd@BSA-Ce6探針的生物安全性，將293T細胞懸液100μL/孔(細胞數(shù)目約為8×103個)加入到96孔板中，同樣每一種濃度設(shè)置4個復孔，隨后置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h。待80%細胞融合貼壁，將事先配置好的含藥培養(yǎng)基Gd@BSA-Ce6、RGD-Gd@BSA-Ce6和游離Ce6溶液(以Ce6濃度計，具體濃度同實驗1.5)加入96孔板中(100μL/孔)共孵育24h。每個孔加入MTT細胞毒性檢測試劑10μL,37℃孵育4h后使用酶標儀于490nm處測定每孔吸光度(D490)并計算細胞存活率。

1.7 統(tǒng)計學處理

2 結(jié) 果

2.1 RGD-Gd@BSA-Ce6弛豫率測定結(jié)果

Gd3+造影劑是一種順磁性造影劑，其T1信號強度隨著Gd3+濃度的升高而增加，因此RGD-Gd@BSA-Ce6的成像效果可以通過T1弛豫率來評估。結(jié)果顯示，RGD-Gd@BSA-Ce6的弛豫系數(shù)為18.615，Gd-DTPA的弛豫系數(shù)為3.404，RGD-Gd@BSA-Ce6是Gd-DTPA的5.5倍，見圖1。T1加權(quán)圖像表現(xiàn)出隨著Gd3+濃度升高，二者的T1信號明顯增加，且同一濃度下RGD-Gd@BSA-Ce6的信號顯著高于Gd-DTPA，見圖2。

圖1 RGD-Gd@BSA-Ce6及 Gd-DTPA弛豫系數(shù)擬合圖Fig.1 The linear fitting chart about relaxation coefficient of RGD-Gd@BSA-Ce6 and Gd-DTPA

2.2 A549肺腺癌細胞對納米探針的攝取情況

共聚焦激光掃描顯微鏡結(jié)果顯示，與游離Ce6組相比，Gd@BSA-Ce6組的融合熒光強度明顯增強；而與Gd@BSA-Ce6組相比，RGD-Gd@BSA-Ce6組的融合熒光強度明顯增強，見圖3。

圖2 RGD-Gd@BSA-Ce6、Gd-DTPA和PBS磁共振T1加權(quán)圖Fig.2 MRI T1-weighted image of RGD-Gd@BSA-Ce6,Gd-DTPA and PBS

圖3 A549肺腺癌細胞分別與游離Ce6、Gd@BSA-Ce6、RGD-Gd@BSA-Ce6共孵育2h后的激光共聚焦圖像Fig.3 The laser confocal imaging of lung adenocarcinoma A549 cells incubated with free Ce6, Gd@BSA-Ce6 and RGD-Gd@BSA-Ce6 for 2hA1～3游離Ce6; B1～3： Gd@BSA-Ce6;C1～3： RGD-Gd@BSA-Ce6

2.3 納米探針對A549肺腺癌細胞暗毒性和光毒性影響

CCK8實驗結(jié)果顯示，非光照組中不同濃度下三種藥物的細胞存活率都在60%以上，其組內(nèi)與組間對比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，且與不加藥物的對照組對比無明顯變化(P>0.05)。而光照組中，在特定波長光激發(fā)下隨著濃度增加，各個處理組中相對細胞存活率呈減小趨勢，同時RGD-Gd@BSA-Ce6(Ce6濃度： 1.2～4.8μmol/L)處理組較相同Ce6濃度的游離Ce6組和Gd@BSA-Ce6組表現(xiàn)出明顯的細胞毒性作用(P<0.05)，見圖4。

圖4 不同濃度游離Ce6、Gd@BSA-Ce6和RGD-Gd@BSA-Ce6作用于A549肺腺癌細胞24h后細胞相對活力圖Fig.4 The relative cell viability of lung adenocarcinoma A549 cells after incubation with different concentrations of free Ce6, Gd@BSA-Ce6 and RGD-Gd@BSA-Ce6 respectively A： 光照；B： 未光照

2.4 納米探針對293T細胞的生物安全性效應(yīng)

MTT實驗結(jié)果顯示，在與不同濃度三種藥物共培養(yǎng)下，細胞存活率都在60%以上，各組內(nèi)與組間對比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)且與不加藥物的對照組對比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見圖5。

圖5 不同濃度游離Ce6、Gd@BSA-Ce6和RGD-Gd@BSA-Ce6作用于293T細胞24h后細胞相對活力圖Fig.5 The relative cell viability of 293T cell after incubation with different concentrations of free Ce6, Gd@BSA-Ce6 and RGD-Gd@BSA-Ce6 respectively

3 討 論

在我國及世界范圍內(nèi)，肺癌的發(fā)病率及死亡率在多種腫瘤中居于首位，死亡率皆在40%～54%左右，而且早期難以發(fā)現(xiàn)，確診患者中有75%已是肺癌晚期。作為一種高發(fā)病率、高死亡率的惡性腫瘤，肺癌已經(jīng)嚴重威脅了人類身體健康并造成巨大的家庭和社會負擔。肺癌的早期診斷和治療顯得尤為重要，而傳統(tǒng)的影像學診斷存在一定滯后性和低敏感性，分子影像技術(shù)可為實現(xiàn)早期診斷和治療提供有力支持。

整合素是一類廣泛表達在細胞膜表面的受體蛋白，主要參與細胞間和細胞與細胞外基質(zhì)間的黏附作用。整合素家族中，αvβ3受體已被證實在腫瘤細胞及腫瘤新生血管內(nèi)皮細胞表面廣泛高表達，且參與腫瘤早期發(fā)生、生長、浸潤和轉(zhuǎn)移[7]，是一種針對肺癌等實體腫瘤的理想靶向標記物。RGD作為一種靶向整合素αvβ3受體的小分子多肽,未來有望成為構(gòu)建靶向結(jié)合腫瘤組織的有效生物標記物之一。

熒光成像由于其靈敏性高、重復性好、光穩(wěn)定性高、提供信息量多等優(yōu)點[8]，在生命科學領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用價值。在腫瘤成像方面，多種腫瘤靶向的標記物可快速廣泛進行熒光標記，從而在細胞及分子水平獲取腫瘤發(fā)生、發(fā)展與周圍組織的關(guān)系等多種行為學信息。二氫卟吩e6(Ce6)提取于植物葉綠素，來源豐富，在腫瘤組織中選擇率高且正常組織代謝效率高。不僅如此，Ce6可在一定范圍內(nèi)波長的激光照射下產(chǎn)生較多的單線態(tài)氧，發(fā)揮光動力治療優(yōu)勢。由于Ce6容易在腫瘤組織內(nèi)富集，這使得產(chǎn)生的光動力治療效果對腫瘤組織的選擇性高而減少對正常組織的損傷少。近幾年來研究表明，Ce6已在黑色素瘤[8]、肺癌[10]、膀胱癌[11]、皮膚癌[12]等多種腫瘤中表現(xiàn)出較好的治療功效。本研究表明，對比非光照條件下的靶向納米探針，光照條件下靶向納米探針具備對肺癌細胞的高效殺傷作用。

MRI作為一種臨床上廣泛應(yīng)用的成像技術(shù)具有高空間分辨率、高組織穿透性及無電離輻射等優(yōu)點，同時又具有多參數(shù)、多序列成像以及血管成像、水成像、波譜成像等多種特殊成像功能，這使得其在分子影像研究領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用，也成為實現(xiàn)雙/多模態(tài)成像功能的有效補充。目前臨床上最常用的MRI對比劑是T1對比劑(釓噴酸葡胺)。利用Gd3+這一強順磁性的金屬離子，可顯著縮短T1的馳豫時間，提高T1信號強度。本研究利用生物礦化技術(shù)制備整合素靶向的分子影像探針RGD-Gd@BSA-Ce6，通過弛豫率測定和T1加權(quán)圖像掃描，發(fā)現(xiàn)其表現(xiàn)出比商品化Gd-DTPA更顯著的成像性能。

BSA作為牛血清中的一種白蛋白，具有多種氨基酸殘基和可修飾官能團，可與多種陽離子、陰離子和其他小分子物質(zhì)結(jié)合，具有生物相容性良好、易修飾和合成綠色便捷等理化特性，在納米醫(yī)學和材料學領(lǐng)域被廣泛用作納米探針的載體[3，12]。本研究中通過生物礦化法合成RGD-Gd@BSA-Ce6分子影像探針，融合了熒光成像和MRI的優(yōu)勢且提高了光動力治療效果，在激光共聚焦實驗中,癌細胞對三種藥物存在明顯的結(jié)合能力差異。其可能的原因在于： 游離Ce6作為一種疏水性物質(zhì)，在血清或細胞外液中容易發(fā)生團聚，不易被腫瘤細胞吞噬；而Gd@BSA-Ce6和RGD-Gd@BSA-Ce6有親水性的蛋白衣殼結(jié)構(gòu)包載Ce6,可增加其親水性。同時，由于整合素靶向結(jié)合多肽RGD的存在，使探針更加容易牢固聚集在腫瘤細胞周圍，增加被攝取的概率。

生物大分子BSA包載的光敏劑和釓劑不僅能提高脂溶性的Ce6在血液和組織間液中的溶解性，而且在探針合成過程中聯(lián)合PEG修飾可顯著降低游離釓劑和Ce6對正常組織器官的毒性作用，保證納米探針在體內(nèi)的長時間循環(huán)，改善藥代動力學。本實驗中，不同濃度下三種藥物與人胚胎腎細胞293T共孵育24h后各組細胞存活率均超過60%，這證實RGD-Gd@BSA-Ce6具有良好的生物相容性。然而，本研究也存在一些缺點： (1) 由于肺的構(gòu)造和功能特點，肺癌的早期臨床診斷主要依賴于CT，而MRI由于掃描時間長，無法避免因肺呼吸運動而產(chǎn)生的偽影，因此目前MRI對肺癌診斷缺乏早期診斷優(yōu)勢。(2) 肺癌組織位于機體內(nèi)部，而Ce6的激發(fā)光對機體的穿透深度僅為1～3cm，有限的穿透能力尚不能激發(fā)聚集肺腫瘤組織上的納米探針產(chǎn)生良好成像和光動力治療效應(yīng)。(3) 本實驗并未在活體上進行靶向成像實驗和光動力治療實驗，體內(nèi)外環(huán)境的差異對探針的成像和治療效果的影響仍無法準確評估。

綜上所述，通過生物礦化技術(shù)制備具有整合素αvβ3受體靶向功能的BSA探針載體，包覆釓劑和光敏劑Ce6而制備成的影像探針，具有優(yōu)于商品化Gd-DTPA的T1成像性能和顯著的與A549肺癌細胞結(jié)合能力，可發(fā)揮良好的MRI和熒光雙模態(tài)成像和光動力治療功效。它融合了MRI增強成像的高分辨率、高穿透深度和無輻射特點及熒光成像的敏感性高、光穩(wěn)定性良好、可重復利用、光照激發(fā)產(chǎn)生大量單線態(tài)氧等優(yōu)勢，避免了MRI的低敏感性和熒光成像受組織深度的限制等劣勢。MRI/熒光雙模態(tài)成像并輔助光動力治療的影像探針，未來有望提高肺癌的檢出率和減少對比劑注入次數(shù)，并實現(xiàn)早期診斷、術(shù)中導航、輔助治療、術(shù)后評估等一系列診療措施，展現(xiàn)出新型分子影像探針巨大的診療一體化優(yōu)勢。

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