倪曉田， 黃小杰， 王 凱， 周 健

(1. 同濟(jì)大學(xué)附屬第一婦嬰保健院產(chǎn)科，上海 201204; 2. 同濟(jì)大學(xué)附屬第一婦嬰保健院轉(zhuǎn)化中心實驗室，上海 201204)

妊娠期糖尿病(gestational diabetes mellitus, GDM)是全球范圍內(nèi)高發(fā)的妊娠期特有的代謝性疾病，國外報道其發(fā)病率在5.8%～9.5%，而且近年有持續(xù)升高的趨勢[1-3]。GDM對母兒健康均有影響，近期影響包括增加巨大兒、肩難產(chǎn)的發(fā)生率、剖宮產(chǎn)率[4]以及胎兒肺部成熟延遲[5]，遠(yuǎn)期影響有增加母親未來發(fā)生Ⅱ型糖尿病[6-8]和心血管疾病[7-8]的機(jī)會,增加后代發(fā)生心血管疾病[9]、呼吸窘迫綜合征[5]和神經(jīng)心理疾病[10]的風(fēng)險。

胎盤是孕期連接母體和胎兒的主要器官，是研究妊娠相關(guān)疾病的一個重要窗口。GDM對胎盤的發(fā)育和功能都有不良影響。研究表明GDM可以使胎盤重量增加[11]，胰島素信號通路缺陷[12]，使胎盤血管內(nèi)皮生長因子A和血管內(nèi)皮生長因子受體2表達(dá)下降，使終末絨毛血管生成發(fā)生退行性變化[13]。已有研究報道GDM改變部分胎盤基因表達(dá)[14-16]，但所報道的差異表達(dá)基因(DEGs)不同。本研究選擇單純飲食和運動治療的GDM病例，檢測單純飲食和運動治療的GDM胎盤基因表達(dá)及功能變化，有助于進(jìn)一步理解妊娠期糖尿病胎盤的基因表達(dá)及功能變化。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2016年3月至2016年4月在同濟(jì)大學(xué)附屬第一婦嬰保健院建卡產(chǎn)檢并在38～40周接受選擇性剖宮產(chǎn)分娩的孕婦共6例，其中正常組孕婦3例，GDM組3例。GDM診斷采用IADPSGC診斷標(biāo)準(zhǔn)，即75g口服葡萄糖實驗空腹血糖≥5.1mmol/L或1h血糖≥10.0mmol/L或2h血糖≥8.5mmol/L診斷為GDM，選擇經(jīng)飲食和運動治療血糖控制理想者。研究對象既往健康，排除妊娠合并其他疾病如哮喘、高血壓、子癇前期及妊娠前患糖尿病等。本研究符合赫爾辛基宣言所規(guī)定的以人類為研究對象的研究標(biāo)準(zhǔn)，通過了同濟(jì)大學(xué)附屬第一婦嬰保健院倫理委員會的審批。受試者獲得知情同意并簽署了知情同意書。6例受試者的臨床參數(shù)詳見表1。

表1 用于芯片分析的標(biāo)本臨床參數(shù)

與對照組相比，*P<0.05

1.2 實驗試劑

TRIzol試劑購自美國Life Technologies公司；RNeasy mini試劑盒及RNase-Free DNase Set購自德國QIAGEN公司；單色低輸入快速放大標(biāo)記試劑盒、基因表達(dá)雜交試劑盒、雜交爐、基因表達(dá)洗滌液試劑盒、芯片掃描儀及Feature Extraction 10.7軟件購自美國安捷倫科技有限公司；芯片著色盤購自美國Thermo Shandon公司；Moloney鼠白血病病毒反轉(zhuǎn)錄酶購自美國Promega公司；SYBR?Green反應(yīng)混合物購自日本ToYoBo公司。

1.3 方法

1.3.1 RNA提取 采用TRIzol方法提取胎盤組織總RNA，分別采用分光光度法(Nanodrop)和凝膠電泳法檢測RNA純度和完整性。分離的RNA貯存于-80℃?zhèn)溆?。總RNA用RNeasy mini試劑盒和RNase-Free DNase Set進(jìn)行純化后用作芯片分析。

1.3.2 芯片雜交和數(shù)據(jù)分析 總RNA標(biāo)本提取方法如上，用單色低輸入快速放大標(biāo)記試劑盒擴(kuò)增mRNA并進(jìn)行標(biāo)記。用RNeasy mini試劑盒將cRNA進(jìn)行純化。cRNA上樣量為1.65μg，使用基因表達(dá)雜交試劑盒，將芯片置于65℃雜交爐10r/min，持續(xù)17h。然后將芯片放入著色盤中，用基因表達(dá)洗滌液試劑盒進(jìn)行洗滌。雜交的芯片用Agilent芯片掃描儀進(jìn)行掃描，用Feature Extraction 10.7軟件進(jìn)行定量分析，并采用Quantile方法將數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。

1.3.3 反轉(zhuǎn)錄定量PCR(RT-qPCR) 采用TRIzol方法提取胎盤組織總RNA。測定RNA濃度后，用Moloney鼠白血病病毒反轉(zhuǎn)錄酶及長度為12～18 nt的寡核苷酸(Oligo dT)將mRNA反轉(zhuǎn)為cDNA，用RT-qPCR方法及SYBR?Green反應(yīng)混合物對SLC16A1、ATP2C2、KCNJ2、ABCA6、IGFL2、BDKRB2、FGF12、SGK2基因進(jìn)行定量分析。熔解溫度設(shè)為61℃。每個標(biāo)本中mRNA絕對數(shù)量都根據(jù)循環(huán)數(shù)對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線計算。為了控制取樣誤差，每個樣本都檢測保守基因β-actin，用目的基因比β-actin得到的值代表目的基因的表達(dá)量。用熔解曲線及PCR產(chǎn)物凝膠電泳檢測引物的特異性。擴(kuò)增以上基因所用的引物序列詳見表2。

表2 用于RT-qPCR的引物序列

1.3.4 DEGs的GO、KEGG分析 DEGs分析所使用的數(shù)據(jù)來自于FunNet 1.00-12軟件。FunNet是一種基于芯片表達(dá)數(shù)據(jù)庫用于分析基因相互關(guān)系的可靠的系統(tǒng)工具[17-18]。本實驗使用的FunNet 1.00-12軟件更新時間是2011年5月20日。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 GDM胎盤DEGs的分層聚類研究

該研究使用的基因芯片包括41000種基因，其中1773種(4.3%)基因兩組間的表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義。627種基因上調(diào)表達(dá)，1146種基因下調(diào)表達(dá)，熱圖詳見圖1。去除非特指的基因，本研究列出20個上調(diào)表達(dá)且倍數(shù)(fold change, FC)≥2的基因(表3)和26個下調(diào)表達(dá)且FC≤0.5的基因(表4)。

圖1 正常和GDM胎盤基因芯片熱圖Fig.1 Heatmap of normal and GDM placental gene chipsA1、A2、A3為GDM胎盤組織，B1、B2、B3為正常胎盤組織，將6例胎盤組織分別用6張芯片(Agilent GeneChips, 4×44K transcripts)進(jìn)行檢測。熱圖顯示與正常胎盤相比，GDM胎盤中627個基因表達(dá)顯著上升(P<0.05，紅色)，1146個基因表達(dá)顯著下降(P<0.05，綠色)

2.2 RT-qPCR方法驗證基因芯片的部分結(jié)果

采用RT-qPCR方法對基因芯片結(jié)果進(jìn)行驗證，驗證的8個基因包括： 溶質(zhì)載體家族16成員1(SLC16A1)、ATP酶分泌途徑Ca2+轉(zhuǎn)運2(ATP2C2)、鉀離子通道亞家族成員2(KCNJ2)、ATP結(jié)合盒亞家族成員6(ABCA6)、胰島素樣生長因子家族成員2(IGFL2)，緩激肽B2受體(BDKRB2)、成纖維細(xì)胞生長因子12(FGF12)、絲氨酸/蘇氨酸激酶2(SGK2)。以上8個基因用芯片和RT-qPCR這2種方法檢測，GDM組和正常組的比值見圖2。

表3 GDM胎盤組織水平表達(dá)上調(diào)的基因

表4 GDM胎盤組織水平表達(dá)下調(diào)的基因

圖2 RT-qPCR方法驗證芯片部分結(jié)果Fig.2 RT-qPCR verification for gene chips黑色柱代表芯片篩查結(jié)果，白色柱代表RT-qPCR結(jié)果；橫坐標(biāo)代表GDM胎盤基因表達(dá)與正常胎盤的比值

2.3 GO、KEGG對DEGs的分析

將DEGs經(jīng)GO聚類從生物學(xué)過程、細(xì)胞成分和分子功能三方面進(jìn)行功能分析，結(jié)果顯示： 在生物學(xué)過程方面，差異基因中38.8%與基于DNA的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)有關(guān)，10.5%與蛋白磷酸化有關(guān)，9.5%與基因表達(dá)有關(guān)；在細(xì)胞成分方面，大部分差異基因位于細(xì)胞核(51.1%)和細(xì)胞質(zhì)(44%)。分子功能分析大部分基因涉及蛋白結(jié)合(51.8%)、金屬離子結(jié)合(33.3%)、鋅離子結(jié)合(24.4%)和DNA結(jié)合(23.7%)。DEGs在生物學(xué)過程、分子功能和細(xì)胞成分三方面的功能分布見圖3。差異基因相關(guān)的信號通路，位于前3位的分別是Wnt、Spliceosome和TGF-β信號通路，見圖4。

圖3 GO對DEGs的功能分析結(jié)果Fig.3 Functional analysis of DEGs by GOA： DEGs相關(guān)的生化過程分析；B： DEGs相關(guān)的細(xì)胞成分分析；C： DEGs相關(guān)的分子功能分析

圖4 KEGG對DEGs相關(guān)信號傳導(dǎo)通路的分析結(jié)果Fig.4 Analysis of DEGs related signal transduction pathway by KEGG

3 討 論

GDM雖然是一種妊娠期特有的疾病，但對母親和胎兒均有不良影響。隨著GDM發(fā)病率的上升，研究GDM發(fā)病機(jī)制的必要性越來越迫切。臨床根據(jù)是否需要藥物治療將GDM分為A1型(即飲食控制的GDM)和A2型(即需要藥物治療的GDM)。胎盤作為孕期連接母體和胎兒的重要器官，與GDM的發(fā)生機(jī)制相關(guān)，同時其結(jié)構(gòu)及功能也受該疾病的影響。既往只有少數(shù)研究采用基因芯片方法研究GDM胎盤基因表達(dá)變化。Radaelli等[14]發(fā)現(xiàn)GDM組16.2%的基因表達(dá)發(fā)生顯著性變化，并且發(fā)現(xiàn)炎癥標(biāo)記物和炎癥介質(zhì)的表達(dá)顯著增加。Enquobahrie等[15]卻發(fā)現(xiàn)只有10.9%的基因表達(dá)發(fā)生變化，且只有部分基因的表達(dá)變化與Radaelli等結(jié)果一致。本實驗選擇A1型GDM病例，3例GDM通過飲食控制，空腹血糖均控制在5.3mmol/L以下，餐后2h血糖維持在6.7mmol/L。孕期產(chǎn)檢尿常規(guī)提示+～++，尿酮體均為陰性。新生兒出生后常規(guī)給予口服少量葡萄糖水預(yù)防低血糖，新生兒均無低血糖表現(xiàn)。雖然孕婦通過飲食控制血糖在正常范圍，但通過檢測胎盤41000個基因的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，1773個(4.3%)基因存在差異表達(dá)，進(jìn)一步用RT-qPCR方法驗證8個基因的表達(dá)情況，其中5個基因的表達(dá)與芯片結(jié)果相符合(SGK2、BDKRB2、IGFL2、ABCA6、SLC16A1)，符合率達(dá)60%。考慮基因芯片篩查和RT-qPCR兩種不同的檢查方法具有較高的符合率，因此認(rèn)為基因芯片的篩查結(jié)果具有很好的參考價值。進(jìn)一步分析實驗結(jié)果缺乏重疊性的原因發(fā)現(xiàn)，Radaelli等[14]選取的GDM病例均為A2型，Enquobahrie等[15]選擇的病例包括A1型和A2型，而本實驗選取的病例則均為A1型，從而推測A1型和A2型GDM對胎盤基因表達(dá)影響程度不同。

本研究利用基因GO平臺對差異表達(dá)基因進(jìn)行了生物過程、分子功能和細(xì)胞成分三方面分析。差異基因涉及的生物過程包括： 以DNA為基礎(chǔ)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)過程、蛋白磷酸化、基因表達(dá)、細(xì)胞周期等。最引人矚目的是以DNA為基礎(chǔ)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)過程中涉及到多達(dá)75種鋅指蛋白，而且多表達(dá)于細(xì)胞核，在蛋白金屬離子結(jié)合、鋅離子結(jié)合和DNA結(jié)合等分子功能方面起著重要作用。鋅指蛋白可以結(jié)合DNA、RNA、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和小分子，在多種生理過程中發(fā)揮重要作用[19]。近期有研究開始關(guān)注鋅指蛋白在生殖系統(tǒng)方面發(fā)揮的作用[20-21]，但未發(fā)現(xiàn)有對GDM胎盤鋅指蛋白表達(dá)變化的報道。GDM對鋅指蛋白的影響及對胎盤功能的負(fù)面影響值得進(jìn)一步研究。MICA和MICB在GDM胎盤中的表達(dá)顯著增加，二者參與胎盤多種生物過程，包括熱反應(yīng)、細(xì)胞溶解、抗原加工提呈、gamma-delta T細(xì)胞活化等，其表達(dá)與胎兒-母體免疫識別相關(guān)[22]，二者表達(dá)增加可能對母體對胎盤的免疫耐受不利。芯片結(jié)果提示多種與胎盤能量代謝及離子代謝相關(guān)的基因下調(diào)表達(dá)，如KCNJ2、ATP2C2、SLC16A1等，其中KCNJ2和SLC16A1在胎盤大量表達(dá)，KCNJ2主要參與調(diào)節(jié)鉀離子代謝，SLC16A1主要與單碳化合物如乳酸、丙酮酸代謝相關(guān)，其表達(dá)量的變化可能直接影響胎兒宮內(nèi)營養(yǎng)素的改變。

另外，本研究用基因KEGG數(shù)據(jù)庫分析了變化基因相關(guān)的信號通路。在存在差異的信號通路中Wnt信號通路居于首位。目前所知，本實驗是首次報道Wnt信號通路在妊娠期糖尿病中的變化。Wnt是一種分泌性糖蛋白受體，在調(diào)節(jié)很多生物過程中起重要作用，這些生物過程包括胚胎發(fā)育，細(xì)胞結(jié)局、增殖、遷移，干細(xì)胞維持，腫瘤細(xì)胞抑制，腫瘤生成和組織平衡[23]。研究報道Wnt配體復(fù)合物可能在人類胎盤發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用[24]。Wnt信號通路還在胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞的功能異常[25]、滋養(yǎng)層細(xì)胞種植、蛻膜化和胎盤分化[26]中起關(guān)鍵作用。妊娠期糖尿病中Wnt信號通路的作用和機(jī)制需要進(jìn)一步研究。KEGG分析還提示DEGs參與剪接體、TGF-β信號通路、ErbB信號通路等，但以上結(jié)果限于基因芯片篩查結(jié)果，需進(jìn)一步實驗驗證。

綜上所述，GDM胎盤部分基因表達(dá)及功能發(fā)生變化，這些變化可能導(dǎo)致胎盤功能發(fā)生變化，從而影響胎兒與胎盤之間的對話。GDM胎盤部分基因表達(dá)變化涉及多種生物學(xué)過程、分子功能及信號通路，但具體胎盤基因表達(dá)對功能及信號通路的影響需進(jìn)一步實驗研究。研究GDM胎盤基因表達(dá)及功能變化有助于充分理解GDM疾病并指導(dǎo)臨床診療。

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