康 婕

（陜西省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗研究院，陜西西安 710048）

0 引言

檢測方法是一項檢測技術(shù)程序，是實驗室管理體系中技術(shù)要求的一個重要要素，是實驗室管理體系中過程要求的一項核心要素。實驗室可以選擇的檢測方法有標(biāo)準(zhǔn)方法和非標(biāo)方法。標(biāo)準(zhǔn)方法需要進(jìn)行驗證工作，而非標(biāo)方法則需要開展確認(rèn)工作。然而，許多實驗室的檢測人員不能完全理解方法確認(rèn)和方法驗證的概念，所以對方法驗證和方法確認(rèn)進(jìn)行系統(tǒng)性論述，旨在為檢測實驗室進(jìn)行驗證和確認(rèn)提供參考。

1 方法驗證和方法確認(rèn)的區(qū)別

1.1 概念

ISO/IEC 99—2007指南，2.44中規(guī)定“方法驗證是實驗室通過核查，提供客觀有效證據(jù)證明滿足檢測方法規(guī)定的要求”；ISO/IEC 99—2007指南，2.45中規(guī)定“實驗室通過試驗，提供客觀有效證據(jù)證明特定檢測方法滿足預(yù)期的用途”[1]。準(zhǔn)確地講，方法驗證著重于檢測方法會不會用，方法確認(rèn)則著重于該檢測方法能不能用。

1.2 目的

由概念可以看出，方法驗證旨在實驗室是否有能力按標(biāo)準(zhǔn)方法開展實驗室活動（包括檢測、校準(zhǔn)和抽樣），主要著重于能否出具充分的客觀依據(jù)。方法確認(rèn)則主要看該非標(biāo)方法是否能合理、合法使用。

1.3 范圍

方法驗證是實驗室內(nèi)方法驗證。方法確認(rèn)包括實驗室內(nèi)方法確認(rèn)和實驗室間方法確認(rèn)。方法確認(rèn)的研究領(lǐng)域要比方法驗證廣得多。

1.4 時機(jī)

方法驗證是在實驗室引入檢測與校準(zhǔn)之前證實運用標(biāo)準(zhǔn)方法的正確性，方法確認(rèn)應(yīng)在首次使用非標(biāo)方法（書、期刊、一起） 之前確認(rèn)，方法實施（新的基質(zhì)、檢測儀器變化、樣品前處理變化等）或者工作環(huán)境發(fā)生了改變，或長期停用后的再確認(rèn)，當(dāng)方法偏倚時也應(yīng)當(dāng)進(jìn)行確認(rèn)。

1.5 對象

方法驗證適用于標(biāo)準(zhǔn)方法，標(biāo)準(zhǔn)方法是由公認(rèn)機(jī)構(gòu)通過評價確認(rèn)之后向社會公開頒布的技術(shù)規(guī)范文件，包括：①國內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)（國家標(biāo)準(zhǔn)、行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)和地方標(biāo)準(zhǔn)）；②國際標(biāo)準(zhǔn)（如ISO，IEC，ITU等頒布的標(biāo)準(zhǔn)）；③區(qū)域標(biāo)準(zhǔn)（如歐洲標(biāo)準(zhǔn)化委員會（CEN）等頒布的標(biāo)準(zhǔn)）；④國外標(biāo)準(zhǔn)（如ANSI，DIN，BSI等頒布的標(biāo)準(zhǔn)）。

方法確認(rèn)適用于：①非標(biāo)方法；②實驗室設(shè)計（制定）的方法；③超出其預(yù)定范圍使用的標(biāo)準(zhǔn)方法（例如，當(dāng)檢測標(biāo)準(zhǔn)要求測定物含量需小于1%，而實際待測物為8%～12%，實驗室采用該標(biāo)準(zhǔn)對待測物進(jìn)行了檢測，這就是超出標(biāo)準(zhǔn)要求范圍進(jìn)行的檢測，所獲得的結(jié)果依然是準(zhǔn)確且有效的）；④擴(kuò)充和修改過的標(biāo)準(zhǔn)方法[2]（例如，一則標(biāo)準(zhǔn)是應(yīng)用于飲料中某項指標(biāo)的檢測，細(xì)微修改后用來當(dāng)作白酒中某項指標(biāo)的檢測，對檢測結(jié)果進(jìn)行有效性評估后發(fā)現(xiàn)測試數(shù)據(jù)準(zhǔn)確有效，則此修改過的標(biāo)準(zhǔn)方法可靠有效）。方法確認(rèn)應(yīng)盡可能全面，以滿足預(yù)定用途或應(yīng)用領(lǐng)域的需要。但是以下幾種情況不需要再進(jìn)行確認(rèn)：①知名技術(shù)組織公布的、國際上普遍采用、行業(yè)廣泛認(rèn)可的某些公司或者行業(yè)協(xié)會的標(biāo)準(zhǔn)，通?？梢圆贿M(jìn)行確認(rèn)而直接使用；②對于獲得政府、行業(yè)組織承認(rèn)的非標(biāo)準(zhǔn)方法可直接證實使用，不需進(jìn)行確認(rèn)；③對科學(xué)書籍和期刊公布的方法，若是國際普遍采用或行業(yè)廣泛認(rèn)可的，可以直接證實使用；④對于儀器供應(yīng)商提供的方法，若檢測與校準(zhǔn)對象跟其描述的類型、范圍相同，且該方法為行業(yè)內(nèi)公認(rèn)，則可直接證實使用。

2 方法驗證和方法確認(rèn)的內(nèi)容

2.1 方法驗證

通常而言，實驗室在新檢測標(biāo)準(zhǔn)投入使用前或者已經(jīng)確認(rèn)過的方法出現(xiàn)微小改動時（如改變稀釋了濃度指標(biāo)，選用不同廠家的柱子等） 需要進(jìn)行方法驗證，進(jìn)行驗證時需要從人力資源、設(shè)備、環(huán)境條件、試劑等幾個方面去驗證是否有能力開展實驗室活動（包括檢測、校準(zhǔn)和抽樣），當(dāng)綜合考量上述條件均滿足檢測的要求后，還需進(jìn)一步驗證實驗室是否有能力滿足標(biāo)準(zhǔn)方法的要求。如何進(jìn)行實驗室驗證依賴于檢測目標(biāo)物的種類和實驗室手段的性質(zhì)。關(guān)注基礎(chǔ)參數(shù)（如回收率、線性、精密度、不確定度等）是否能達(dá)到實驗室標(biāo)準(zhǔn)要求。

2.2 方法確認(rèn)

方法確認(rèn)工作不是一項偶然行動，是經(jīng)過計劃和準(zhǔn)備的。方法確認(rèn)的內(nèi)容應(yīng)該廣泛且全面，以滿足預(yù)定用途或應(yīng)用領(lǐng)域的需要。標(biāo)準(zhǔn)方法的確認(rèn)準(zhǔn)則是：所用的人員、設(shè)備、試劑、環(huán)境等以證明實驗室能夠正確使用該新標(biāo)準(zhǔn)實施檢測過程，確定技術(shù)路線和相關(guān)參數(shù)。非標(biāo)方法的確認(rèn)通常從以下5個方面確認(rèn)。

（1）使用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行比較或者評定偏差和精度。應(yīng)選擇合適的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)應(yīng)該滿足其準(zhǔn)確度，應(yīng)該優(yōu)于擬確認(rèn)方法的準(zhǔn)確度；標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的種類、濃度范圍應(yīng)該與擬確認(rèn)方法相符合），采用不確定度檢驗法和t檢驗法和回收率檢驗法進(jìn)行方法確認(rèn)。在用回收率試驗進(jìn)行評價時應(yīng)該注意：加標(biāo)量應(yīng)該小于待測物含量的3倍；測定含量在mg/kg級時，回收率含量應(yīng)該在90%以上，測定含量在μg/kg級時，回收率含量應(yīng)該在80%以上，如果檢測方法復(fù)雜可以低至70%。

（2）與其他方法所得的結(jié)果進(jìn)行比較?？梢圆捎胻檢驗（應(yīng)用t檢驗時，要求被檢驗的2組數(shù)據(jù)具有相同或者相近的方差）或F檢驗法進(jìn)行檢驗和判斷方法的顯著性問題。但是應(yīng)該注意進(jìn)行t檢驗之前必須先進(jìn)行F檢驗。

（3）實驗室間比對。利用實驗室間比對進(jìn)行方法確認(rèn)，即在同樣條件下利用相同方法進(jìn)行重復(fù)性檢測和改變測試條件時利用不同方法進(jìn)行復(fù)現(xiàn)性檢測，得出重復(fù)性限r(nóng)和復(fù)現(xiàn)性限R。

（4）對影響結(jié)果的因素作系統(tǒng)性評審。利用對結(jié)果的因素做系統(tǒng)性評價——加強(qiáng)性檢驗，對抵御外來影響的穩(wěn)健度或抵御來自樣品（或檢測物）集體干擾的交互靈敏度進(jìn)行方法確認(rèn)。在作系統(tǒng)性評審進(jìn)行方法確認(rèn)時可進(jìn)行配對比較，即固定一因素從而消除其他因素的影響，兩側(cè)測量結(jié)果用配對數(shù)據(jù)差值D來進(jìn)行顯著性檢驗分析。

（5）根據(jù)對方法的理論原理和實踐經(jīng)驗的科學(xué)理解，對所得結(jié)果不確定度進(jìn)行的評定。

3 方法驗證和方法確認(rèn)的參數(shù)

對于化學(xué)實驗室而言，方法驗證的技術(shù)參數(shù)有檢出限、回收率、方法標(biāo)準(zhǔn)曲線和精密度試驗。方法確認(rèn)的技術(shù)參數(shù)除了有檢出限、回收率、方法標(biāo)準(zhǔn)曲線和精密度試驗外，還需要進(jìn)行方法特異性（區(qū)分同分異構(gòu)體）、抗干擾性、耐用性和測量不確定度評估[3]。實驗室可在綜合考慮成本、風(fēng)險技術(shù)可行性基礎(chǔ)上，并根據(jù)預(yù)期的用途進(jìn)行方法確認(rèn)，實驗室進(jìn)行方法確認(rèn)的內(nèi)容應(yīng)盡可能全面且完整，包括但不限于以下方法特性，方法選擇性、方法適用性、回收率、測量范圍或線性范圍、檢出限或定量限，正確度、穩(wěn)健度、靈敏度、精密度（重復(fù)性或復(fù)現(xiàn)性）、測量不確定度等。

3.1 檢出限（LOD）

當(dāng)被檢組分的濃度不是很高，且特性不是很明顯時，基于結(jié)果具有最大不確定度的期望時，通過方法檢測所能達(dá)到的最低含量叫做檢出限（LOD）。檢出限（LOD）包括方法檢出限（MDL） 和儀器檢出限（IDL），這2個概念不能相互混淆，信噪比可用來考查儀器性能但不適用于評估方法檢出限。方法檢出限是某特定分析方法在給定的置信度內(nèi)（如95%，99%或99.7%）能檢出待測樣組分的最低含量（最小濃度或者最小量）。這里說的檢出是指定性檢出，即判定樣品中存有濃度高于空白的待測物質(zhì)，檢出限是一種定性判斷依據(jù)。

（1）基于空白標(biāo)準(zhǔn)偏差評估法。當(dāng)空白樣本的標(biāo)準(zhǔn)偏差不等于0時，獨立測試樣品空白，測定不少于10次，計算檢測結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)偏差（S），空白+3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差（3S） 即為方法檢出限（MDL）。當(dāng)空白樣本的標(biāo)準(zhǔn)偏差等于0時，在空白樣品中添加最低可接受的濃度（添加量不少于10次），檢測待測物的濃度，計算標(biāo)準(zhǔn)偏差（S），3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差（3S）即為方法檢出限（MDL）。

（2）校準(zhǔn)公式適用范圍評估法。利用校準(zhǔn)方程的參數(shù)來確定檢出限，如果空白平均值+3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差（3S），校準(zhǔn)方程的截距a為儀器對于空白的響應(yīng)，儀器響應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)偏差是校準(zhǔn)的標(biāo)準(zhǔn)誤差（Sy/x），利用校準(zhǔn)方程：yLOD=a+3Sy/x=a+bxLOD，則xLOD=3Sy/x/b（校準(zhǔn)曲線的斜率）得到檢出限。

（3） 確定檢出限的方法。在某些分光光度法中，以口出空白后與0.01吸光度對應(yīng)的濃度可為檢出限，氣相色譜分析的最小檢測量是指檢測器剛能產(chǎn)生與噪音相區(qū)別的響應(yīng)信號時進(jìn)入色譜柱的物質(zhì)的最小量，通常認(rèn)為剛能辨別的響應(yīng)信號是噪音的2倍，最小檢測濃度為最小檢測量與進(jìn)樣量體積的比。

3.2 定量限（LQD）

定量限（LQD） 是指某特定分析方法在給定置信度和允許誤差范圍內(nèi)能夠從樣品中定量檢出待測組分的最低濃度或最低量。定量限（LQD） 也成定量檢測下限或者報告限，其結(jié)果能保證一定的正確度和精密度。但是當(dāng)待測物的最低濃度或者最低量在檢出限（LOD） 和定量限（LQD） 之間時，準(zhǔn)確度就沒有保障，此時檢測結(jié)果不一定準(zhǔn)確。美國國家標(biāo)準(zhǔn)局定義10倍空白標(biāo)準(zhǔn)偏差（即10σ空）。

痕量分析準(zhǔn)則見表1。

表1 痕量分析準(zhǔn)則

3.3 線性

對于任何定量的方法，都需要確定被分析物濃度的適用范圍，因此實驗室應(yīng)該確定檢測方法校準(zhǔn)曲線的線性范圍。在線性范圍內(nèi)信號反應(yīng)與被分析物的濃度呈線性相關(guān)，實驗室建立標(biāo)準(zhǔn)曲線應(yīng)覆蓋不同濃度（或數(shù)量級），6個及其以上（包括空白）校準(zhǔn)點，以操作反應(yīng)信號為y軸，以操作濃度為x軸，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，確定各種濃度的最大和最小的線性范圍。對于篩選方法，線性回歸方程的相關(guān)系數(shù)要不低于0.98；對于準(zhǔn)確定量的方法，線性回歸方程的相關(guān)系數(shù)要不低于0.99。相性范圍確定時應(yīng)該盡量滿足以下要求：①校準(zhǔn)用的校準(zhǔn)點應(yīng)該覆蓋目標(biāo)物濃度的50%～150%，如果需要做空白試驗，則應(yīng)該覆蓋目標(biāo)物濃度的50%～150%；②校準(zhǔn)用的校準(zhǔn)點應(yīng)盡可能均勻分布在目標(biāo)物濃度內(nèi)，不同濃度應(yīng)該獨立配制，不能通過稀釋高濃度校準(zhǔn)點配制；③每個校準(zhǔn)點至少重復(fù)測定2次，建議3次或者更多次。

3.4 精密度

精密度是在規(guī)定條件下，獨立檢測結(jié)果間的一致程度。精密度說明檢測人員檢測結(jié)果的穩(wěn)定性。精密度的度量通常以不精密度表達(dá)，量值用檢測結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)差來表示，精密度越低，標(biāo)準(zhǔn)差越大。精密度與真值或者可接受的參考值無關(guān)，僅取決于隨機(jī)誤差的分布。禁用物質(zhì)在進(jìn)行精密度試驗時，應(yīng)在LOD、2倍LOD和10倍LOD 3個水平進(jìn)行，對于已經(jīng)制定最高殘留量（MRL） 的，應(yīng)在LOD，MRL選擇合適的點三水平進(jìn)行，對于沒有制定最高殘留量（MRL） 的，應(yīng)在LOD、常見限量指標(biāo)選擇合適的點三水平進(jìn)行。每個點的重復(fù)測定次數(shù)不得小于6次。測試結(jié)果通過實驗室內(nèi)變異系數(shù)表達(dá)，標(biāo)準(zhǔn)偏差（S） 可用Bessel公式計算得到（CV=標(biāo)準(zhǔn)偏差/平均值）。

3.5 重復(fù)性限或復(fù)現(xiàn)性限

重復(fù)性限（r） 是指重復(fù)性條件下由同一操作者測定2次，2次測試結(jié)果的絕對差值不超過此數(shù)的概率為95%，再現(xiàn)性限（R）是指在不同的實驗室，由不同的操作者使用不同的設(shè)備，按相同的測試方法，對統(tǒng)一被測對象獨立進(jìn)行測試，2次測試結(jié)果的絕對差值不超過此數(shù)的概率為95%。r和R均通過實驗室協(xié)作獲得，一般要求協(xié)作實驗室不少于8家。

4 結(jié)語

為確保檢測數(shù)據(jù)結(jié)果準(zhǔn)確性、可靠性，方法確認(rèn)和驗證是一項不容忽視的工作，結(jié)合實驗室實際情況做好確認(rèn)和驗證工作，以得到準(zhǔn)確的測量結(jié)果[4-5]。

參考文獻(xiàn)：

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[2]全國認(rèn)證認(rèn)可標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會.GB/T 127025檢測和校準(zhǔn)實驗室能力通用要求 [S].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2005.

[3]中國合格評定國家認(rèn)可委員會.JJF1059.1—2012測量不確定度評定與表示 [S].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2007.

[4]胡朝暾，胡興，付明，等.生物化學(xué)實驗室的建設(shè)與管理 [J].農(nóng)產(chǎn)品加工，2017（6）：79-81.

[5]許朝麗，石艷培.“食品分析”開放實驗室教學(xué)模式的探索與實踐 [J].農(nóng)產(chǎn)品加工，2016（6）：87-88.◇