高穎娜 陳世彩 王偉 陳東輝 李孟 鄭宏良

面神經(jīng)及其相關(guān)的肌肉組織共同調(diào)節(jié)面部表情和基本的面部功能，其損傷后會(huì)引起面癱。盡管目前面神經(jīng)損傷修復(fù)的顯微外科手術(shù)使神經(jīng)再生的精確度有了一定的提高，但90%面癱患者面神經(jīng)功能仍難以完全恢復(fù)[1]。因此，深入研究神經(jīng)再生的機(jī)制以促進(jìn)神經(jīng)有效再生和功能恢復(fù)至關(guān)重要。

周?chē)窠?jīng)損傷后影響其功能恢復(fù)的主要決定因素在于軸突準(zhǔn)確再生至原來(lái)的靶器官，重新形成運(yùn)動(dòng)終板，使其獲得充分的神經(jīng)再支配，雪旺氏細(xì)胞在此過(guò)程中起關(guān)鍵作用。在神經(jīng)再生過(guò)程中，軸突釋放的嘌呤及其代謝產(chǎn)物作為信號(hào)分子和神經(jīng)遞質(zhì)，與膠質(zhì)細(xì)胞上的嘌呤能P1和P2受體結(jié)合，參與調(diào)控周?chē)窠?jīng)損傷后的再生及髓鞘的形成[2]；其中激活P2Y受體可促發(fā)Ca2+的內(nèi)流，同時(shí)激活ERK/MAPK、p38MAPK、RhoA/Rock等多條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，而這正是調(diào)控雪旺氏細(xì)胞增殖、活化、遷移和髓鞘形成及維持所必需的[3,4]。P2Y受體拮抗劑蘇拉明(suramin)可阻斷再生軸突的嘌呤能遞質(zhì)ATP與雪旺氏細(xì)胞上P2Y2、P2Y11等受體的結(jié)合，使再生的大鼠坐骨神經(jīng)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元軸突數(shù)量明顯減少，從而影響其功能恢復(fù)[5]。

前期研究結(jié)果提示，P2Y4 受體激活可能調(diào)控雪旺氏細(xì)胞的遷移和軸突的延伸[6]，但能否促進(jìn)神經(jīng)再生和功能恢復(fù)及其可能的機(jī)制尚不清楚，故本研究擬通過(guò)構(gòu)建大鼠面神經(jīng)損傷再生模型并對(duì)P2Y4受體進(jìn)行藥物干預(yù)，觀察P2Y4受體在面神經(jīng)損傷后神經(jīng)再生及面肌功能恢復(fù)過(guò)程中的作用。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 30只健康成年雄性SD大鼠(清潔級(jí)，上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司)，體重200～250 g，隨機(jī)分為3組：0.9%生理鹽水對(duì)照組(對(duì)照組)、P2Y4受體激動(dòng)劑組(激動(dòng)劑組)和P2Y4受體拮抗劑組(拮抗劑組)，每組10只。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均已通過(guò)海軍軍醫(yī)大學(xué)附屬長(zhǎng)海醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2P2Y4受體激動(dòng)劑及拮抗劑的選擇 本實(shí)驗(yàn)選用MRS4062作為大鼠P2Y4受體的選擇性激動(dòng)劑，適宜濃度50 μM，活性藍(lán)2(Reactive Blue2)作為大鼠P2Y4受體的拮抗劑，適宜濃度100 μM[7～9]。

1.3Nuerolac可吸收共聚高分子外周神經(jīng)套接管的準(zhǔn)備 在植入動(dòng)物體內(nèi)前，首先將內(nèi)徑1.5 mm的Nuerolac在無(wú)菌條件下分割成長(zhǎng)度約4 mm的小段用于行神經(jīng)斷端橋接，然后置入37 ℃恒溫水中浸泡3分鐘，使套接管更加柔韌，利于縫合時(shí)針頭穿過(guò)管壁。

1.4ALZET植入式膠囊滲透壓泵的準(zhǔn)備 將膠囊滲透壓泵灌注、稱重后置入37 ℃的生理鹽水中孵育60小時(shí)，使膠囊滲透壓泵達(dá)到均衡、穩(wěn)定的泵出速率。

1.5構(gòu)建面神經(jīng)損傷神經(jīng)再生室及P2Y4受體藥物干預(yù)的穩(wěn)定動(dòng)物模型 所有大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)，并觀察24小時(shí)，以排除特發(fā)性面神經(jīng)損傷。選取右側(cè)面神經(jīng)構(gòu)建神經(jīng)損傷再生模型，左側(cè)面神經(jīng)作為正常對(duì)照側(cè)，不做手術(shù)處理。

各組動(dòng)物腹腔注射10%水合氯醛(40 mg/kg)全身麻醉后，取右側(cè)耳后切口，于莖乳孔處開(kāi)始向外耳道軟骨的下方至咬肌后緣順行分離暴露面神經(jīng)顱外段的主干，長(zhǎng)度約5.21±0.48 mm，于中點(diǎn)處切斷面神經(jīng)主干，采用內(nèi)徑1.5 mm、長(zhǎng)度4 mm的Neurolac可吸收共聚高分子外周神經(jīng)套接管，將神經(jīng)近心端和遠(yuǎn)心端分別置入套管內(nèi)各1 mm，并以11-0的無(wú)損傷縫合線將套管與神經(jīng)兩斷端外膜各縫合1～2針固定，完成橋接，形成神經(jīng)再生室。

各組大鼠完成面神經(jīng)損傷后，均采用ALZET植入式膠囊滲透壓泵(型號(hào)2006，劑量200 μl，0.15 μl/h)進(jìn)行藥物干預(yù)。將預(yù)先準(zhǔn)備好的分別灌滿0.9%生理鹽水、50 μM MRS4062、100 μM活性藍(lán)2溶液的膠囊泵分別植入對(duì)照組、激動(dòng)劑組及拮抗劑組大鼠的后背部皮下，將其導(dǎo)管接頭調(diào)整至神經(jīng)再生室周?chē)拷嫔窠?jīng)近心端的位置，5-0的縫線縫合固定，以確保泵內(nèi)的藥液定點(diǎn)、均勻、持續(xù)地緩釋到神經(jīng)再生室周?chē)?；逐層縫合創(chuàng)面，完成P2Y4受體藥物干預(yù)的穩(wěn)定動(dòng)物模型。術(shù)后連續(xù)注射青霉素40萬(wàn)單位3天。

1.6大鼠面肌功能的觀察及分級(jí) 模型建立后每日觀察各組大鼠雙側(cè)觸須的對(duì)稱性及運(yùn)動(dòng)情況、瞬目反射。正常情況下，觸須向前豎起并伴有節(jié)律性地拂動(dòng)，用針筒吹其一側(cè)眼睛可使雙側(cè)眼瞼活動(dòng)而瞬間閉合。根據(jù)de Farial[10]提出的大鼠面神經(jīng)離斷模型的評(píng)分系統(tǒng)，以正常左側(cè)為對(duì)照，將觸須拂動(dòng)和瞬目反射各分為5個(gè)等級(jí)，制定面肌功能評(píng)分表(表1)。采用雙盲法對(duì)各組大鼠分別評(píng)分后，將二者的評(píng)分相加進(jìn)行評(píng)估分析。

表1 大鼠面肌功能評(píng)分表

1.7大鼠面肌誘發(fā)肌電圖檢測(cè) 術(shù)后6周同法分離暴露雙側(cè)面神經(jīng)后，采用德國(guó)Axion肌電圖儀檢測(cè)并記錄面肌誘發(fā)電位，先左側(cè)，后右側(cè)；將記錄電極平行于大鼠口輪匝肌準(zhǔn)確插入其中，刺激電極放置于面神經(jīng)主干近心端的表面；刺激電流設(shè)定為1 ms脈沖模式，調(diào)整電流刺激強(qiáng)度，分別記錄雙側(cè)面肌誘發(fā)電位的最大振幅和峰潛伏期。

1.8大鼠面肌及面神經(jīng)的取材與處理 完成肌電圖檢查后，分離并切取右側(cè)上唇輪匝肌，大小約0.3 cm×0.3 cm×0.1 cm；靠近神經(jīng)再生室的下方切取面神經(jīng)遠(yuǎn)心端約0.3 cm。同法切取左側(cè)上唇輪匝肌和左側(cè)面神經(jīng)遠(yuǎn)心端作為正常對(duì)照。標(biāo)本立即置入4%多聚甲醛固定液中固定24 h，流水沖洗24 h，梯度酒精法脫水，二甲苯進(jìn)行透明，石蠟包埋。

1.8.1面神經(jīng)甲苯胺藍(lán)染色 面神經(jīng)以石蠟包埋后行4 μm半薄切片，脫臘至水，蒸餾水浸洗3～5分鐘，0.1%甲苯胺藍(lán)液(Sigma公司)浸染10 min，水洗洗去多余染液，脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封固。40倍光鏡下觀察面神經(jīng)干內(nèi)有髓神經(jīng)纖維，每個(gè)樣本隨機(jī)選取3個(gè)視野，并采用NIKON數(shù)字圖像系統(tǒng)ACT-1采集圖像、拍照記錄，圖像分析軟件計(jì)數(shù)每個(gè)視野的有髓神經(jīng)纖維數(shù)，計(jì)算后獲得單位面積內(nèi)的有髓神經(jīng)纖維數(shù)目。

1.8.2面肌Masson染色 面肌標(biāo)本石蠟包埋后行8 μm薄層切片，脫臘至水，蘇木素染5～10 min，流水稍洗；1%鹽酸酒精分化，流水沖洗數(shù)分鐘，麗春紅酸性品紅液中染5～10 min，流水稍沖洗，1%磷鉬酸溶液中染1～3 min，不用水洗直接入苯胺藍(lán)染液復(fù)染5 min，1%冰醋酸處理1 min，95%酒精脫水?dāng)?shù)次，無(wú)水酒精脫水、二甲苯透明、中性樹(shù)膠封固。20倍光鏡下觀察染色結(jié)果，顯示骨骼肌纖維呈紅色，結(jié)締組織膠原纖維呈藍(lán)色，隨機(jī)選取3個(gè)視野，同法獲得每個(gè)視野內(nèi)肌纖維數(shù)目和平均肌纖維直徑。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 剔除每組死亡動(dòng)物，剩余動(dòng)物模型中所取得的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以Exel表格建庫(kù)，所有數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS l9.0統(tǒng)計(jì)軟件先進(jìn)行各組方差齊性檢驗(yàn)，符合條件方差齊性，各組間均數(shù)比較采用單因素方差分析(ANOVA)和t檢驗(yàn)；不符合條件方差齊性，采用非參數(shù)檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

實(shí)驗(yàn)過(guò)程中生理鹽水對(duì)照組、P2Y4受體激動(dòng)劑組和P2Y4受體拮抗劑組分別有2、3、2只大鼠死亡，6周時(shí)三組動(dòng)物模型分別存活8、7、8只。

2.1各組大鼠面肌運(yùn)動(dòng)恢復(fù)情況觀察 大鼠左側(cè)面肌功能正常，右側(cè)術(shù)后即發(fā)生面癱，可見(jiàn)觸須倒向尾部，均無(wú)節(jié)律性拂動(dòng)，瞬目反射均消失，眼瞼均無(wú)法閉合。術(shù)后4周時(shí)，P2Y4受體激動(dòng)劑組均能觀察到輕微的觸須拂動(dòng)，并逐日增強(qiáng)，刺激眼瞼可有肌肉顫動(dòng)，但無(wú)閉合；對(duì)照組和P2Y4受體拮抗劑組分別只有4只和1只大鼠出現(xiàn)輕微的觸須顫動(dòng)，無(wú)瞬目反射。術(shù)后6周時(shí)激動(dòng)劑組觸須擺動(dòng)明顯但仍不對(duì)稱，瞼裂閉合3/4；對(duì)照組均可見(jiàn)中度觸須擺動(dòng)，其中4只瞼裂閉合3/4，4只閉合1/2；P2Y4受體拮抗劑組可見(jiàn)輕度至中度觸須擺動(dòng)，瞼裂閉合1/2。各組大鼠術(shù)后4、6周面肌功能評(píng)分見(jiàn)表2，可見(jiàn)術(shù)后4、6周時(shí)P2Y4受體激動(dòng)劑組面肌功能評(píng)分優(yōu)于對(duì)照組，P2Y4受體拮抗劑組差于對(duì)照組和P2Y4受體激動(dòng)劑組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)。提示激活P2Y4受體能更好的促進(jìn)面神經(jīng)再生、面肌功能恢復(fù)。

表2 各組大鼠術(shù)后4、6周面肌功能評(píng)分(分，±s)

2.2各組大鼠面肌誘發(fā)肌電圖檢查結(jié)果 大鼠左側(cè)面肌在0.4～0.6 mA電流時(shí)即可記錄到面肌誘發(fā)電位最大振幅和峰潛伏期，分別為5.63±2.16 mV、2.04±0.56 ms。術(shù)后6周時(shí)對(duì)照組、P2Y4受體激動(dòng)劑組、P2Y4受體拮抗劑組右側(cè)面肌的最大振幅分別為左側(cè)的70.6%、84.2%、54.1%，潛伏期分別為左側(cè)的134.5%、116.7%、151.2%，與左側(cè)相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)；且P2Y4受體激動(dòng)劑組最大振幅明顯高于生理鹽水對(duì)照組，潛伏期明顯短于生理鹽水對(duì)照組；P2Y4受體拮抗劑組最大振幅則明顯低于生理鹽水對(duì)照組和激動(dòng)劑組，潛伏期明顯長(zhǎng)于生理鹽水對(duì)照組和激動(dòng)劑組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表3、圖1)。

表3 術(shù)后6周各組大鼠右側(cè)面肌誘發(fā)電位最大振幅、峰潛伏期及單位面積內(nèi)有髓神經(jīng)纖維數(shù)目、肌纖維數(shù)目和肌纖維平均直徑±s)

2.3各組面神經(jīng)遠(yuǎn)心端主干有髓神經(jīng)纖維組織數(shù)量及組織形態(tài)學(xué)變化 光鏡下見(jiàn)正常面神經(jīng)形態(tài)良好，外膜光滑完整，滋養(yǎng)血管清晰可見(jiàn)，神經(jīng)纖維數(shù)量、直徑均正常，染色均一，無(wú)脫髓鞘改變，單位面積內(nèi)有髓神經(jīng)纖維數(shù)目為1 351±104根。術(shù)后6周時(shí)，P2Y4受體激動(dòng)劑組面神經(jīng)形態(tài)相對(duì)較接近正常，可見(jiàn)大量的有髓軸突再生，神經(jīng)外膜結(jié)構(gòu)基本完整，較清晰，神經(jīng)纖維排列較均勻；拮抗劑組面神經(jīng)形態(tài)結(jié)構(gòu)恢復(fù)相對(duì)較差，再生的軸突數(shù)目較少，外膜欠清晰，排列欠均勻、較稀疏；對(duì)照組神經(jīng)纖維組織形態(tài)恢復(fù)情況介于二者之間。對(duì)照組、P2Y4受體激動(dòng)劑組和P2Y4受體拮抗劑組單位面積內(nèi)有髓纖維數(shù)目分別為正常側(cè)的72.9%、83.6%和56.9%，各組均較正常側(cè)減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)。但P2Y4受體激動(dòng)劑組單位面積內(nèi)有髓纖維數(shù)目明顯多于對(duì)照組，而P2Y4受體拮抗劑組明顯少于對(duì)照組和激動(dòng)劑組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)(表3、圖2)。

2.4各組大鼠面肌纖維數(shù)目、平均直徑以及組織形態(tài)學(xué)變化 正常側(cè)面肌纖維排列整齊緊密，直徑粗大，肌纖維間結(jié)締組織極少(圖3a)。術(shù)后6周時(shí)，生理鹽水對(duì)照組的面肌恢復(fù)尚可(圖3b)，肌纖維密度和直徑中等，單位面積內(nèi)肌纖維數(shù)目和平均直徑分別為正常側(cè)的72.7%和69.5%，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；P2Y4受體激動(dòng)劑組的面肌從形態(tài)上比其它兩組更接近正常側(cè)(圖3c)，密度較大，排列較為緊密，直徑較粗大，其單位面積內(nèi)肌纖維數(shù)目和平均直徑分別為正常對(duì)照側(cè)的85.7%和86.0%，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而P2Y4受體拮抗劑組的面肌恢復(fù)則較差(圖3d)，肌纖維數(shù)量較少，分布稀疏，直徑細(xì)小，其單位面積內(nèi)肌纖維數(shù)目和平均直徑分別為正常對(duì)照側(cè)的54.7%和53.3%，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；但P2Y4受體激動(dòng)劑組單位面積內(nèi)肌纖維數(shù)目和平均直徑明顯大于對(duì)照組，而P2Y4受體拮抗劑組均小于對(duì)照組和激動(dòng)劑組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表3、圖3)。

3 討論

周?chē)窠?jīng)損傷后，雪旺氏細(xì)胞的定向遷移對(duì)指引再生和芽生的軸突回到去神經(jīng)支配的終板起著重要作用，這個(gè)過(guò)程包括復(fù)雜的細(xì)胞和分子事件以及精細(xì)的調(diào)控機(jī)制[5,11]。研究表明，細(xì)胞外的核苷酸類(lèi)與一些嘌呤能P2Y受體結(jié)合后會(huì)引起細(xì)胞內(nèi)的Ca2+瞬間升高，從而通過(guò)一系列的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制參與周?chē)窠?jīng)軸突再生和髓鞘重塑等過(guò)程[12]；但是上述作用具體由P2Y家族的哪個(gè)亞型調(diào)控尚不清楚。近些年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)P2Y4受體參與了神經(jīng)元的分化[13]，其在大鼠坐骨神經(jīng)損傷后吻合口遠(yuǎn)端有強(qiáng)表達(dá)，提示其可能參與了周?chē)窠?jīng)損傷后的病理生理改變和神經(jīng)再生修復(fù)過(guò)程[14]。本課題組前期研究結(jié)果也提示雪旺氏細(xì)胞上的P2Y4受體表達(dá)的時(shí)空改變可能通過(guò)調(diào)控雪旺氏細(xì)胞的功能而在兔喉返神經(jīng)再生過(guò)程中起著潛在的重要作用[6]。然而，到目前為止，尚沒(méi)有直接描述雪旺氏細(xì)胞上P2Y4受體激活后影響靶器官功能恢復(fù)的報(bào)道。

本研究結(jié)果顯示，各組大鼠面神經(jīng)損傷修復(fù)后面肌功能均有不同程度的恢復(fù)，雖仍無(wú)法完全恢復(fù)正常，但使用P2Y4受體選擇性激動(dòng)劑MRS4062可明顯促進(jìn)面神經(jīng)的軸突再生，術(shù)后6周其有髓神經(jīng)纖維和面肌纖維的數(shù)量及肌纖維的直徑均較對(duì)照組增加；而使用活性藍(lán)2阻斷P2Y4受體則使大鼠面神經(jīng)軸突再生明顯減少；可見(jiàn)，激活P2Y4受體明顯促進(jìn)了大鼠面肌運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)，進(jìn)一步表明P2Y4受體在面神經(jīng)損傷再生過(guò)程中的重要作用。

離斷的神經(jīng)修復(fù)后其失神經(jīng)支配肌肉的功能恢復(fù)程度取決于神經(jīng)再支配的運(yùn)動(dòng)單位數(shù)量。通常再生神經(jīng)纖維無(wú)法全部通過(guò)斷端, 只有一部分神經(jīng)纖維可以重新支配肌肉。再生神經(jīng)至少恢復(fù)30%的正常運(yùn)動(dòng)單位才能支配所有失神經(jīng)肌肉，否則肌肉將萎縮，變得更小更弱，肌纖維比正常更少[15]，因此，及時(shí)有效地使失神經(jīng)的肌肉獲得充分的神經(jīng)再支配是決定靶器官功能恢復(fù)程度的關(guān)鍵。前期研究結(jié)果顯示，正常大鼠喉返神經(jīng)雪旺氏細(xì)胞上的P2Y4 受體表達(dá)極弱，幾乎無(wú)法被檢測(cè)到；而在神經(jīng)損傷后的早期，其表達(dá)量顯著增高，在損傷后期再生完成時(shí)又迅速下調(diào)至正常水平[6]，其在時(shí)間上的表達(dá)變化規(guī)律與文獻(xiàn)報(bào)道的神經(jīng)再生過(guò)程中的一些細(xì)胞粘附分子(如神經(jīng)細(xì)胞粘附因子NCAM)、細(xì)胞骨架蛋白(如vimentin)的表達(dá)規(guī)律基本一致，均在周?chē)窠?jīng)損傷后表達(dá)增高，而這些分子正是雪旺氏細(xì)胞遷移、軸突誘向生長(zhǎng)以及髓鞘重塑過(guò)程中所必需的[16,17]，這也進(jìn)一步表明P2Y4受體可能通過(guò)調(diào)控多條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路激活下游的細(xì)胞粘附分子和細(xì)胞骨架蛋白的表達(dá)，導(dǎo)致雪旺氏細(xì)胞的遷移、軸突的延伸和髓鞘的形成，從而促進(jìn)周?chē)窠?jīng)的再生。因此，通過(guò)藥物激活P2Y4受體，可以使再生的軸突更準(zhǔn)、更快地向神經(jīng)遠(yuǎn)心端生長(zhǎng)，使失神經(jīng)靶器官更早、更好地獲得神經(jīng)再支配，從而減少肌肉萎縮、纖維化的發(fā)生；而阻斷P2Y4受體后雪旺氏細(xì)胞遷移活動(dòng)減弱，再生的神經(jīng)纖維數(shù)量明顯較少，肌肉無(wú)法獲得有效的神經(jīng)再支配而引起大量纖維結(jié)締組織增生，使其功能明顯減退；這也與本研究中的各組大鼠面肌肌電圖研究結(jié)果相一致，進(jìn)一步證實(shí)激活P2Y4受體面神經(jīng)功能可得到更好的恢復(fù)，而拮抗劑組則效果不佳。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示激活P2Y4 受體可以明顯促進(jìn)受損面神經(jīng)髓鞘形成和軸突再生，從而促進(jìn)面肌功能的恢復(fù)；而抑制P2Y4受體則使面神經(jīng)再生受阻，面肌功能恢復(fù)較差。這也進(jìn)一步明確了P2Y4受體對(duì)面神經(jīng)再生的促進(jìn)作用，但其確切的分子機(jī)制和可能的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制有待進(jìn)一步的研究加以闡明。

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