宮雪，于柳，劉嘉，劉屹立，王平(中國醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院，沈陽003；中國醫(yī)科大學(xué))

膀胱癌是泌尿生殖系統(tǒng)中最常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率逐年升高[1,2]。約25%的初診患者被診斷為肌層浸潤性膀胱癌，其中約30%的患者存在遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[3]。順鉑是一種細(xì)胞毒性化療藥物，為膀胱癌治療的一線用藥，但總體預(yù)后較差[4]?；熕幬锏闹貜?fù)給藥可能造成腫瘤細(xì)胞的獲得性藥物抵抗，臨床上約有40%的膀胱癌患者在5年內(nèi)由于化療抵抗引起腫瘤的復(fù)發(fā)[5]。因此，增強(qiáng)膀胱癌細(xì)胞對順鉑的敏感性是提高順鉑療效的重要手段。小鳥苷三磷酸(GTP)酶是Rab小分子GTP酶家族成員之一，在囊泡內(nèi)吞再循環(huán)過程中發(fā)揮重要作用[6,7]。近年研究發(fā)現(xiàn)，Rab11參與了惡性腫瘤的多項(xiàng)生物學(xué)進(jìn)程，與結(jié)直腸癌、胃癌、乳腺癌、胰腺癌、皮膚癌等惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[8～13]。Rab11能夠促進(jìn)膀胱癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力，但其在腫瘤細(xì)胞順鉑耐藥中的作用尚不明確。2015年12月～2016年 1月，我們觀察了雙向調(diào)控Rab11對順鉑干預(yù)后膀胱癌細(xì)胞凋亡及對凋亡相關(guān)蛋白B淋巴細(xì)胞瘤-2(Bcl-2)蛋白的影響，探討Rab11在膀胱癌細(xì)胞順鉑化療耐藥性中的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 人膀胱癌細(xì)胞系T24、BIU-87細(xì)胞購于美國模式培養(yǎng)物保藏中心(ATCC，Manassas，USA)；Rab11(Proteintech，USA)；Bcl-2(Cell Signaling，USA)；β-actin(Santa Cruz，USA)；Rab11 ONTARGETplus siRNA、陰性對照NonTargeting siRNA(Dharmacon，USA)；pCMV6-Rab11質(zhì)粒、陰性對照pCMV6質(zhì)粒(Origene，USA)；RPMI-1640培養(yǎng)基(Gibco，USA)；10%胎牛血清(Invitrogen，USA)；DMSO(Sigma，USA)；ECL試劑盒(Pierce，USA)；PVDF膜(Millipore，USA)；DNR 成像系統(tǒng)(Jerusalem，Israel)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)、分組及順鉑干預(yù)方法 將T24、BIU-87細(xì)胞加入含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，37 ℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天換液。 取對數(shù)生長期的T24、BIU-87細(xì)胞懸液，按1×106/孔分別接種于6孔板；將T24細(xì)胞分為觀察1組、對照1組，將BIU-87細(xì)胞分為觀察2組、對照2組，分別加入2 μmol/L順鉑誘導(dǎo)凋亡，24 h后進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

1.3 轉(zhuǎn)染方法 在T24細(xì)胞中轉(zhuǎn)染Rab11特異性siRNA，在BIU-87細(xì)胞中轉(zhuǎn)染Rab11過表達(dá)質(zhì)粒，并設(shè)立陰性對照。轉(zhuǎn)染步驟及劑量參照說明書。采用Western blotting法檢測細(xì)胞Rab11蛋白的相對表達(dá)量，以T24細(xì)胞轉(zhuǎn)染后Rab11表達(dá)量降低、BIU-87細(xì)胞轉(zhuǎn)染后Rab11表達(dá)量升高為轉(zhuǎn)染成功。觀察1組細(xì)胞轉(zhuǎn)染Rab11特異性siRNA，對照1組細(xì)胞轉(zhuǎn)染Control siRNA，觀察2組細(xì)胞轉(zhuǎn)染Rab11過表達(dá)質(zhì)粒，對照2組細(xì)胞轉(zhuǎn)染pCMV6質(zhì)粒。

1.4 細(xì)胞存活率測算 采用CCK-8法。轉(zhuǎn)染48 h后收集各組細(xì)胞，將單個(gè)細(xì)胞懸液按1×103/孔接種于96孔培養(yǎng)板，每孔體積200 L。培養(yǎng)24 h后，每孔加入10 μL CCK-8繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸去上清液，加入150 μL DMSO，振蕩10 min，于490 nm波長處測定各孔吸光度值。以不含細(xì)胞的等體積培養(yǎng)基作為對照，繪制細(xì)胞生長曲線，計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.5 細(xì)胞凋亡率測算 采用流式細(xì)胞術(shù)。轉(zhuǎn)染48 h后收集各組細(xì)胞。取5×105～10×105重懸的細(xì)胞，離心5 min，棄上清，加入195 μL Annexin V-FITC結(jié)合液重懸細(xì)胞。加入5 μL Annexin V-FITC混勻，4 ℃避光孵育15 min。加入5 μL碘化丙啶(PI)染色液，輕輕混勻，4 ℃避光孵育5 min。隨即進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測，Annexin V-FITC 為綠色熒光，對應(yīng)BD 流式細(xì)胞儀FL1檢測通道；碘化丙啶(PI)為紅色熒光，對應(yīng)BD 流式細(xì)胞儀FL2檢測通道。計(jì)算細(xì)胞凋亡率。

1.6 細(xì)胞Bcl-2蛋白表達(dá)檢測 采用Western blotting法。轉(zhuǎn)染48 h后收集各組細(xì)胞，加入Pierce裂解緩沖液提取總蛋白，目標(biāo)蛋白定量參照BCA方法，上樣量為20 g，電泳，轉(zhuǎn)膜，孵育一抗Bcl-2(1∶1 000)，4 ℃過夜，二抗37 ℃孵育2 h，ECL發(fā)光。通過凝膠分析系統(tǒng)掃描目的條帶和內(nèi)參的灰度比，作為Bcl-2蛋白的相對表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞存活率比較 觀察1組細(xì)胞存活率低于對照1組，觀察2組細(xì)胞存活率高于對照2組(P均<0.05)。見表1。

2.2 各組細(xì)胞凋亡率比較 觀察1組細(xì)胞凋亡率高于對照1組，觀察2組細(xì)胞凋亡率低于對照2組(P均<0.05)。見表1。

2.3 各組細(xì)胞Bcl-2蛋白表達(dá)比較 觀察1組細(xì)胞Bcl-2蛋白表達(dá)低于對照1組，觀察2組細(xì)胞Bcl-2蛋白表達(dá)高于對照2組(P均<0.05)。見表1。

表1 各組細(xì)胞存活率、凋亡率及Bcl-2蛋白表達(dá)比較

注：與對照組1比較，*P<0.05；與對照組2比較，﹟P<0.05。

3 討論

膀胱尿路上皮癌是膀胱癌最常見的類型，其發(fā)病率逐年升高，是泌尿生殖系統(tǒng)中致死性最強(qiáng)的惡性腫瘤。順鉑是一種細(xì)胞毒性化療藥物，其抗腫瘤機(jī)制主要是引起腫瘤細(xì)胞DNA損傷，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡[14～16]。以順鉑為基礎(chǔ)的化療方案對晚期膀胱癌患者具有十分重要的治療作用，但其總體預(yù)后較差，順鉑耐藥是其中最重要的原因。因此，探討增強(qiáng)膀胱癌細(xì)胞對順鉑的敏感性、逆轉(zhuǎn)耐藥性方法，對晚期膀胱癌的治療具有非常重要的臨床意義。

Rab蛋白是囊泡內(nèi)吞過程中的一個(gè)重要因素。 Rab11蛋白是小GTP酶，并調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)運(yùn)輸，囊泡運(yùn)輸，參與細(xì)胞遷移和腫瘤形成等生物學(xué)行為，Rab11的高表達(dá)能促進(jìn)多種腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移。Chung等[8]研究發(fā)現(xiàn)，Rab11的高表達(dá)可通過增加E-鈣黏蛋白的表達(dá)量來促進(jìn)集合細(xì)胞的遷移，并與結(jié)直腸癌的不良預(yù)后有關(guān)。Rab11相互作用蛋白2在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)上調(diào)，可調(diào)節(jié)基質(zhì)金屬蛋白酶7的表達(dá)，促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的侵襲和遷移[9]。Rab11相互作用蛋白2的高表達(dá)與胃癌組織中的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)[10]。Rab11相互作用蛋白3與再循環(huán)內(nèi)體有關(guān)，并通過調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架來調(diào)節(jié)乳腺癌細(xì)胞運(yùn)動(dòng)[11]。Rab11相互作用蛋白4的高表達(dá)可以預(yù)測胰腺癌患者的不良預(yù)后，并與腫瘤進(jìn)展有關(guān)[12]。這些研究表明，Rab11可能是人類腫瘤中潛在的癌蛋白，參與腫瘤形成、腫瘤進(jìn)展。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，Rab11在膀胱癌組織中高表達(dá)，其機(jī)制為通過NF-κB信號(hào)通路促進(jìn)膀胱癌細(xì)胞的增殖和侵襲。本研究進(jìn)一步探討Rab11在膀胱癌細(xì)胞順鉑化療耐藥性中的作用和機(jī)制。本研究發(fā)現(xiàn)，觀察1組細(xì)胞存活率低于對照1組，觀察2組細(xì)胞存活率高于對照2組;提示抑制Rab11表達(dá)可以減少膀胱癌細(xì)胞的存活率，而過表達(dá)Rab11可以增加膀胱癌細(xì)胞的存活率；觀察1組細(xì)胞凋亡率高于對照1組。觀察2組細(xì)胞凋亡率低于對照2組；提示抑制Rab11表達(dá)可以增加膀胱癌細(xì)胞的凋亡率，過表達(dá)Rab11可以降低膀胱癌細(xì)胞的凋亡率。本研究結(jié)果表明，Rab11能明顯減少順鉑誘導(dǎo)的膀胱癌細(xì)胞凋亡、增加腫瘤細(xì)胞存活率，增強(qiáng)膀胱癌細(xì)胞對化療藥物順鉑的耐藥性。

Bcl-2基因是重要的凋亡抑制基因，可以抑制內(nèi)膜鈣離子的釋放；具有抗氧化的作用或抑制氧自由基的產(chǎn)生；阻止胞內(nèi)細(xì)胞色素C的釋放；通過抑制白介素-1β轉(zhuǎn)化酶(ICE)的自身催化而抑制凋亡。Bcl-2和NF-κB的表達(dá)有相關(guān)性，Bcl-2大多數(shù)與NF-κB同時(shí)表達(dá)。NF-κB通過上調(diào)Bcl-2基因表達(dá)，抑制腫瘤細(xì)胞凋亡。Tamatani等[17]發(fā)現(xiàn)，在神經(jīng)元低氧/氧再灌注處理中，NF-κB的活化誘導(dǎo)Bcl-2過度表達(dá)，阻止低氧/氧再灌注后凋亡細(xì)胞增多。本研究發(fā)現(xiàn)，觀察1組細(xì)胞Bcl-2蛋白表達(dá)低于對照1組，觀察2組細(xì)胞Bcl-2蛋白表達(dá)高于對照2組，提示抑制Rab11可顯著減少凋亡抑制因子Bcl-2的表達(dá)，而過表達(dá)Rab11可明顯增加Bcl-2蛋白的表達(dá)，表明Rab11能夠通過調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2的表達(dá)來影響膀胱癌細(xì)胞的凋亡。

綜上所述，Rab11過表達(dá)能明顯減少順鉑誘導(dǎo)的膀胱癌細(xì)胞凋亡率、增加細(xì)胞存活率，表明Rab11可增強(qiáng)膀胱癌細(xì)胞對化療藥物順鉑的耐藥性。本研究為膀胱癌的靶向治療提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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