張冰，紀(jì)洪，張兆存，陳守臻，史本康(濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，山東濱州56600；山東大學(xué)齊魯醫(yī)院)

糖尿病是嚴(yán)重威脅著人類健康的常見疾病，糖尿病神經(jīng)源性膀胱尿道功能障礙(NVUDD)是糖尿病引起的泌尿系統(tǒng)并發(fā)癥，40%～85%的糖尿病患者可并發(fā)此癥[1]。除了因糖尿病引發(fā)的膀胱逼尿肌收縮無力之外，可能存在糖尿病引發(fā)的尿道舒張機(jī)制的異常，從而加劇了NVUDD病變進(jìn)程。神經(jīng)生長因子(NGF)是一種多肽物質(zhì)，是維持周圍神經(jīng)正常功能的重要的細(xì)胞因子，在因各種疾病導(dǎo)致的神經(jīng)系統(tǒng)變性與修復(fù)過程中起重要作用[2]。研究發(fā)現(xiàn)，NGF在糖尿病膀胱病變中起重要作用[3]。p75神經(jīng)營養(yǎng)素受體(p75NTR)是NGF受體，能介導(dǎo)施旺細(xì)胞對(duì)神經(jīng)生長因子的功能性反應(yīng)，在人類及大鼠膀胱中存在陽性表達(dá)[4,5]。研究發(fā)現(xiàn)，p75NTR在糖尿病感覺神經(jīng)病變乃至尿道病變的發(fā)病機(jī)理中起重要作用[6]。2014年7～12月，我們觀察了糖尿病模型大鼠的尿道舒張功能障礙情況，探討NGF及其受體p75NTR在糖尿病尿道舒張功能病變中的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 健康成年雌性SPF級(jí)Wistar大鼠24只(體質(zhì)量250～300 g)，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供，均飼養(yǎng)于山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF實(shí)驗(yàn)室。大鼠隨機(jī)分為2組，對(duì)照組、糖尿病組各12只。

1.2 糖尿病大鼠模型制備 糖尿病組大鼠按65 mg/kg(溶解在0.1 mol/L枸櫞酸緩沖液中，pH 4.5)單劑量腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ)制備糖尿病模型，對(duì)照組大鼠腹腔注射等量枸櫞酸緩沖液。48～72 h后尾靜脈采血，用血糖儀測定全血血糖。以血糖≥300 mg/dL為糖尿病模型建立。

1.3 尿道壓(UPP)、等容膀胱壓檢測 造模8周后，經(jīng)頸靜脈插管注射烏拉坦麻醉;腹部正中切口，清理降結(jié)腸內(nèi)污物，于降結(jié)腸近心端行松解結(jié)扎術(shù);切斷雙側(cè)輸尿管，使輸尿管遠(yuǎn)端表面化。于膀胱頂部插入膀胱導(dǎo)尿管和雙腔尿道導(dǎo)管(后者包括尿道內(nèi)的PE-50管子用于UPP測定，PE-160管子用于注入生理鹽水)，用于導(dǎo)管尖端的錐形塞子被置于膀胱頸。逐層關(guān)閉腹腔。使用生理鹽水通過尿道導(dǎo)管的外腔，以0.075 mL/min的速度注入尿道，通過尿道導(dǎo)管的內(nèi)腔記錄UPP。逐漸注入生理鹽水，直至誘導(dǎo)出等容膀胱節(jié)律收縮并記錄。于恥骨聯(lián)合高度放置壓力傳感器，使用POWERLAB進(jìn)行數(shù)據(jù)采集。在穩(wěn)定的膀胱基礎(chǔ)活性的條件下(≥30 min)，對(duì)UPP基線值、UPP最低值及誘發(fā)尿道舒張的膀胱壓閾值進(jìn)行檢測。

1.4 大鼠尿道組織NGF、p75NTR mRNA檢測 UPP及等容膀胱壓檢測后，斷頸處死大鼠，完整切取尿道組織，采用實(shí)時(shí)定量RT-PCR法檢測尿道組織NGF、p75NTR mRNA表達(dá)。以常規(guī)TRIzol 法提取尿道總RNA，用紫外分光光度計(jì)在波長260 nm處測量所提取RNA濃度。兩步法試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA，條件為42 ℃ 50 min、85 ℃ 10 min。所用引物由北京奧科生物技術(shù)公司負(fù)責(zé)合成。NGF上游引物5′-AACAGGACTCACAGGAGCAA-3′，下游引物5′-CTTCCTGCTGAGCACACACA-3′；p75NTR上游引物5′-GAGGGCACATACTCAGACGAAGCG-3′，下游引物5′-GTCTATATGTTCAGGCTGGTAACC-3′。

1.5 大鼠尿道組織NGF、p75NTR蛋白檢測 采用Western blotting法。取大鼠尿道組織，常規(guī)提取總蛋白，BCA法檢測蛋白濃度；蛋白變性后SDS-PAGE電泳分離，電轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜；5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，分別加入相應(yīng)的一抗(1∶500)封閉過夜；TBST洗膜3次，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗(1∶4 000羊抗鼠多抗)，室溫孵育2 h；常規(guī)洗膜3次，化學(xué)發(fā)光法顯像；用凝膠圖像處理系統(tǒng)分析免疫印跡條帶進(jìn)行光密度測定，以目的蛋白與Actin光密度比值表示蛋白表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 各組UPP及誘發(fā)尿道舒張的膀胱壓閾值比較 糖尿病組UPP最低值及誘發(fā)尿道舒張的膀胱壓閾值均高于對(duì)照組(P<0.01)。兩組UPP基線值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表1。

表1 兩組UPP及誘發(fā)尿道舒張的膀胱壓閾值比較

注：與對(duì)照組比較，*P<0.01。

2.2 各組尿道組織NGF、p75NTR mRNA及蛋白表達(dá)比較 糖尿病組尿道組織NGF、p75NTR mRNA及蛋白表達(dá)均低于對(duì)照組(P均<0.01)。見表2。

表2 各組尿道組織NGF、p75NTR mRNA及蛋白表達(dá)比較

注：與對(duì)照組比較，*P<0.01。

3 討論

糖尿病是臨床常見的內(nèi)分泌疾病，其對(duì)膀胱、尿道功能的損傷受到越來越多的關(guān)注。目前對(duì)NVUDD的研究主要集中在膀胱本身的病變，對(duì)尿道病變的研究很少。對(duì)于由糖尿病引發(fā)的下尿路功能障礙，單純的糖尿病膀胱病變不能完全或很好地解釋。近年研究發(fā)現(xiàn)，尿道結(jié)構(gòu)和功能異常在NVUDD發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用[7]。Ueda等[8]研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病可誘發(fā)多種神經(jīng)病變，包括影響感覺神經(jīng)和自主神經(jīng)。因此，我們推測糖尿病誘導(dǎo)的多神經(jīng)病變也可能影響尿道的舒張功能。

尿道肌肉包括尿道平滑肌和尿道橫紋肌。正常儲(chǔ)尿和排尿過程需要膀胱和尿道平滑肌及尿道外括約肌中的橫紋肌之間精確協(xié)調(diào)，儲(chǔ)尿期尿道處于收縮狀態(tài)，抑制尿液排出，而排尿期尿道處于舒張狀態(tài)，促進(jìn)尿液排出。尿道平滑肌是由交感、副交感神經(jīng)支配，而尿道外括約肌由軀體神經(jīng)支配，尿道橫紋肌主要是由軀體神經(jīng)(陰部神經(jīng))支配。膀胱和尿道的神經(jīng)、肌肉相互協(xié)調(diào)配合，完成正常的儲(chǔ)尿和排尿生理。若神經(jīng)支配方面受到損害，勢(shì)必導(dǎo)致尿道收縮或舒張功能受損。在糖尿病的情況下，尿道的結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生病變，進(jìn)而導(dǎo)致NVUDD的發(fā)生和發(fā)展。有研究證實(shí)，糖尿病大鼠尿道的全層厚度、肌層厚度及結(jié)締組織區(qū)域與肌肉區(qū)域的比值均顯著大于正常大鼠[9]，說明糖尿病大鼠尿道可能發(fā)生了肌肉萎縮以及纖維化。雖然其具體機(jī)制尚不明確，但推測糖尿病尿道形態(tài)學(xué)改變與長期的慢性炎癥密切相關(guān)。Yang等[10]通過檢測糖尿病大鼠膀胱等容測壓、尿道灌注壓以及尿道外括約肌肌電圖，發(fā)現(xiàn)糖尿病大鼠膀胱逼尿肌與尿道括約肌協(xié)同障礙，且尿道括約肌舒張減弱、對(duì)NO反應(yīng)減弱、對(duì)α受體激動(dòng)劑反應(yīng)增強(qiáng)，這些改變使尿道阻力增加，從而造成排尿障礙。本研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病組UPP最低點(diǎn)及誘發(fā)尿道舒張的膀胱壓閾值均高于對(duì)照組，提示糖尿病大鼠膀胱收縮時(shí)尿道肌肉舒張功能發(fā)生異常。

NGF是一種多肽物質(zhì)，其作用有以下幾方面：①維持交感神經(jīng)和感覺神經(jīng)的生長發(fā)育及功能；②誘導(dǎo)軸突發(fā)芽、決定軸突的伸長時(shí)間，并可穩(wěn)定神經(jīng)結(jié)構(gòu)、調(diào)節(jié)微絲蛋白的合成；③促進(jìn)細(xì)胞分化及創(chuàng)傷愈合；④對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的凋亡有抑制作用[11]。高血糖狀態(tài)下，NGF的表達(dá)降低，促進(jìn)了糖尿病膀胱尿道病變進(jìn)程[12]。研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病同樣損傷尿道的去神經(jīng)化，直接損傷尿道括約肌及平滑肌[13]，提示在糖尿病尿道病變過程中同樣可能涉及到NGF作用障礙。p75NTR是NGF的低親和力受體，屬腫瘤壞死因子受體(TNFR)超家族成員，其通過不同的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路誘導(dǎo)以神經(jīng)細(xì)胞為主的細(xì)胞增殖、遷移、分化、生存、凋亡、突觸的建立和神經(jīng)的形成，發(fā)揮多重生物學(xué)效應(yīng)。p75NTR在神經(jīng)細(xì)胞的早期發(fā)育過程中與NGF結(jié)合，介導(dǎo)了神經(jīng)細(xì)胞的存活[14]。p75NTR主要在尿道的感覺神經(jīng)纖維中表達(dá)，NGF和p75NTR的結(jié)合可誘導(dǎo)神經(jīng)末梢向神經(jīng)細(xì)胞傳到神經(jīng)營養(yǎng)信號(hào)，對(duì)于神經(jīng)細(xì)胞的存活至關(guān)重要[15]。如果NGF和p75NTR的表達(dá)下調(diào)，這種神經(jīng)營養(yǎng)效應(yīng)就會(huì)顯著的降低，進(jìn)而引起神經(jīng)細(xì)胞的生長抑制和凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病組尿道組織NGF、p75NTR mRNA及蛋白表達(dá)均低于對(duì)照組，提示糖尿病大鼠尿道組織中NGF和p75NTR mRNA及蛋白表達(dá)顯著下降，表明高血糖導(dǎo)致了尿道神經(jīng)細(xì)胞中NGF產(chǎn)生的減少和p75NTR表達(dá)的下降。

綜上所述，糖尿病引起的尿道舒張功能障礙是NVUDD的重要組成部分，在大鼠尿道組織中NGF和p75NTR的mRNA及蛋白表達(dá)顯著下調(diào)，從而導(dǎo)致神經(jīng)營養(yǎng)效應(yīng)的錯(cuò)亂，神經(jīng)細(xì)胞的凋亡。這種尿道去神經(jīng)化是糖尿病尿道功能障礙的重要原因。

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