趙晉晉，皮銀珍，歐陽(yáng)俊，楊騰舜，劉羅坤(長(zhǎng)沙市第一醫(yī)院，長(zhǎng)沙410000)

作為糖尿病最重要的微血管并發(fā)癥之一，糖尿病腎病(DN)的發(fā)病率逐年升高，且因其致殘致死率高日益受到重視。但DN的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，目前尚未完全明確，缺乏有效的防治手段，是目前內(nèi)分泌學(xué)領(lǐng)域研究的重點(diǎn)。腎小球系膜細(xì)胞的增殖及細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的產(chǎn)生是糖尿病腎病發(fā)生、發(fā)展的中心環(huán)節(jié)[1]。二肽基肽酶-4(DPP-4)抑制劑西格列汀具有降低血糖、減輕胰島素抵抗、保護(hù)胰島功能的作用，自臨床應(yīng)用以來(lái)，其對(duì)DN患者的腎臟保護(hù)作用備受重視，但機(jī)制尚不明確。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，西格列汀可以減少早期DN患者腎臟組織ECM的產(chǎn)生[2]。2016年1月～2017年1月，我們觀察了西格列汀對(duì)高糖條件下腎小球系膜細(xì)胞增殖及ECM相關(guān)蛋白表達(dá)的影響，探討西格列汀腎臟保護(hù)作用的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與材料 人腎小球系膜細(xì)胞株(HMCs)(湘雅醫(yī)學(xué)院干細(xì)胞研究所饋贈(zèng)，來(lái)源于ADCC細(xì)胞庫(kù))。西格列汀原藥(Sigma公司)；DMEM培養(yǎng)基(GIBCO公司)；ECM相關(guān)蛋白纖維連接蛋白(FN)、Ⅳ型膠原(ColⅣ)多克隆抗體(Santa Cruz公司)；FITC標(biāo)記的熒光二抗(Santa Cruz公司)； MTT細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒(Beytime公司)；二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱(Binder公司)；培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)板(Corning公司)；超凈工作臺(tái)(蘇州凈化集團(tuán)泰安公司)；凝膠成像系統(tǒng)、紫外分光光度劑(Beckman公司)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 復(fù)蘇系膜細(xì)胞HMCs細(xì)胞株，加入低糖DMEM培養(yǎng)液(D-葡萄糖5.5 mmol/L)，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，每2天更換1次培養(yǎng)液。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板中，密度為 4×105/孔，達(dá)90%融合時(shí)更換無(wú)血清的DMEM培養(yǎng)液同步化12 h，用于后續(xù)分組處理。

1.3 系膜細(xì)胞FN、ColⅣ分泌最佳培養(yǎng)時(shí)間點(diǎn)及葡萄糖最佳干預(yù)濃度的確定 系膜細(xì)胞分別在正常濃度(D-葡萄糖5.5 mmol/L)、高糖濃度(D-葡萄糖終濃度分別為10、20、30 mmol/L)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并按照觀察時(shí)間長(zhǎng)短分為6、12、24、48 h四個(gè)時(shí)間點(diǎn)。ELISA法檢測(cè)各濃度及各時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞上清液中FN、ColⅣ蛋白含量，以FN、ColⅣ蛋白含量最高的時(shí)間點(diǎn)為最佳時(shí)間點(diǎn)，F(xiàn)N、ColⅣ蛋白含量最高的葡萄糖濃度為葡萄糖最佳干預(yù)濃度。最終確定最佳干預(yù)時(shí)間為24 h，葡萄糖最佳干預(yù)濃度為30 mmol/L。

1.4 系膜細(xì)胞分組與干預(yù) 將系膜細(xì)胞分為正常對(duì)照組、高糖組、高糖+西格列汀低劑量組、高糖+西格列汀中劑量組、高糖+西格列汀高劑量組。正常對(duì)照組在D-葡萄糖終濃度5.5 mmol/L的培養(yǎng)基中培養(yǎng)；高糖組在D-葡萄糖終濃度為30 mmol/L的培養(yǎng)基中培養(yǎng)；高糖+西格列汀低、中、高劑量組在D-葡萄糖終濃度為30 mmol/L，西格列汀終濃度分別為0.1、1、10 μmol/L的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。各組均培養(yǎng)24 h。

1.5 系膜細(xì)胞增殖能力觀察 采用MTT法。取各組細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度至5×104/mL；每孔100 μL接種于96孔板中，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h貼壁后，加入干預(yù)藥物，培養(yǎng)24 h。每孔加50 μL 1×MTT，在37 ℃孵育4 h后吸出上清液；每孔加150 μL DMSO，用平板搖床搖勻，酶標(biāo)儀在570 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)每孔的光密度。先將各測(cè)試孔的OD值減去本底OD值(完全培養(yǎng)基加MTT，無(wú)細(xì)胞)，得出各受試孔OD值。

1.6 系膜細(xì)胞ECM相關(guān)蛋白ColⅣ、FN蛋白表達(dá)檢測(cè) 采用Western blotting法。收集各組細(xì)胞，細(xì)胞裂解提取總蛋白，將各樣本蛋白濃度調(diào)整至一致后點(diǎn)樣，SDS-PAGE電泳分離后4 ℃ 300 mA轉(zhuǎn)膜70 min；5%脫脂牛奶封閉37 ℃ 2 h。加入稀釋后的一抗(鼠抗人ColⅣ一抗1∶800，鼠抗人FN一抗1∶400)4 ℃孵育過(guò)夜，棄去一抗，用PBST在脫色搖床下洗膜10 min×4次，加HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG(稀釋度1∶80 000)室溫下孵育1 h后，棄去二抗，洗膜4次后，加入ECL化學(xué)發(fā)光顯示劑顯影曝光，Gel pro4.0凝膠光密度分析軟件分析蛋白條帶IOD值。

2 結(jié)果

2.1 各組系膜細(xì)胞增殖能力比較 與正常對(duì)照組比較，高糖組系膜細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)(P<0.05)。高糖+西格列汀中、高劑量組系膜細(xì)胞增殖能力均低于高糖組(P均<0.05)。見(jiàn)表1。

2.2 各組系膜細(xì)胞Fn、ColⅣ蛋白表達(dá)比較 與正常對(duì)照組比較，高糖組系膜細(xì)胞 FN及ColⅣ蛋白表達(dá)增加(P均<0.05)。高糖+西格列汀中劑量組、高糖+西格列汀高劑量組系膜細(xì)胞 FN及ColⅣ蛋白表達(dá)均低于高糖組，且高糖+西格列汀高劑量組低于高糖+西格列汀中劑量組(P均<0.05)。見(jiàn)圖1、表1。

注：與正常對(duì)照組比較，*P<0.05；與高糖組比較，△P<0.05；與高糖+西格列汀中劑量組比較，#P<0.05。

注：1為正常對(duì)照組；2為高糖組；3為高糖+西格列汀低劑量組；4為高糖+西格列汀中劑量組；5為高糖+西格列汀高劑量組。

圖1各組系膜細(xì)胞FN、ColⅣ蛋白表達(dá)情況(Westernblotting法)

3 討論

DN的發(fā)病過(guò)程伴隨著腎小球肥大、腎小球和腎小管基底膜增厚以及系膜區(qū)ECM堆積，最終導(dǎo)致腎小球硬化[3]。腎小球系膜細(xì)胞是腎小球中功能最活躍的細(xì)胞，是腎小球硬化發(fā)生發(fā)展的主要參與者[4,5]。正常情況下，腎小球系膜細(xì)胞的數(shù)量、形態(tài)和位置保持相對(duì)穩(wěn)定。而在糖尿病代謝紊亂，如高糖的病理情況下，腎小球系膜細(xì)胞可以出現(xiàn)表型轉(zhuǎn)化——系膜細(xì)胞增殖、肥大、凋亡增加[6,7]；表型轉(zhuǎn)化后的腎小球系膜細(xì)胞可使分泌ECM增加，導(dǎo)致腎小球硬化，參與DN的發(fā)生發(fā)展。

FN是一種血漿糖蛋白，在腎臟可以通過(guò)結(jié)合纖維蛋白、纖維蛋白原，使其他膠原沉積于腎小球和腎小管基底膜。研究發(fā)現(xiàn)，在腎臟疾病的早期即有FN的升高，隨著病程的延長(zhǎng)，其增加更為明顯，是導(dǎo)致腎臟纖維化的重要因素[8]。ColⅣ是構(gòu)成腎小球基底膜膠原蛋白的最主要成分，正常情況下含量極微，但在病理情況下，其合成增多及降解減少致ECM積聚，是許多腎臟疾病發(fā)生、終至腎小球硬化的主要原因或重要參與因素之一[9]。本研究發(fā)現(xiàn)，與正常對(duì)照組比較，高糖組系膜細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)，系膜細(xì)胞 FN及ColⅣ蛋白表達(dá)增加。提示高糖培養(yǎng)條件下，系膜細(xì)胞增殖指數(shù)增高，細(xì)胞外基質(zhì)重要成分FN、ColⅣ表達(dá)合成增加。表明高糖能誘導(dǎo)系膜細(xì)胞出現(xiàn)異常增殖，合成和分泌大量基質(zhì)成分，最終導(dǎo)致腎小球硬化。

DPP-4抑制劑西格列汀自2006年獲得FDA批準(zhǔn)上市以來(lái)，其安全性、有效性得到了臨床證實(shí)，其在臨床指南中的地位也逐漸提高。大量的臨床及基礎(chǔ)研究證實(shí)，西格列汀在2型糖尿病患者中應(yīng)用可以有效地降低血糖，而且有不增加體質(zhì)量、減輕胰島素抵抗、保護(hù)胰島功能的優(yōu)點(diǎn)[10]。隨著西格列汀臨床的廣泛應(yīng)用，臨床中發(fā)現(xiàn)西格列汀對(duì)糖尿病大血管及微血管病變也有一定保護(hù)作用[11]。Penno等[12]采用Meta分析發(fā)現(xiàn)，西格列汀可以降低2型糖尿病患者尿微量白蛋白水平，且此作用不依賴于患者糖化血紅蛋白水平的降低。Mori等[13]研究發(fā)現(xiàn)，西格列汀可以降低2型糖尿病患者尿微量白蛋白水平，且此作用不依賴于患者血糖水平的降低。國(guó)內(nèi)的很多臨床及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)，西格列汀具有獨(dú)立于降糖作用之外的腎臟保護(hù)作用[14]。但其腎臟保護(hù)作用的具體機(jī)制尚不明確。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，西格列汀可以通過(guò)下調(diào)糖尿病大鼠腎臟組織中的8-羥基脫氧鳥(niǎo)苷(8-OHdG)的表達(dá)，上調(diào)超氧化物歧化酶(SOD)的表達(dá)，改善氧化應(yīng)激水平，發(fā)揮對(duì)糖尿病大鼠腎臟的保護(hù)作用[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，高糖+西格列汀中、高劑量組系膜細(xì)胞增殖能力均低于高糖組，高糖+西格列汀中劑量組、高糖+西格列汀高劑量組系膜細(xì)胞 FN及ColⅣ蛋白表達(dá)均低于高糖組，且高糖+西格列汀高劑量組低于高糖+西格列汀中劑量組。提示西格列汀干預(yù)能顯著抑制系膜細(xì)胞增殖，下調(diào)系膜細(xì)胞FN、ColⅣ蛋白表達(dá)，且西格列汀含量較高時(shí)的抑制作用越強(qiáng)。表明西格列汀能夠通過(guò)抑制系膜細(xì)胞增殖，下調(diào)FN和ColⅣ的表達(dá)，進(jìn)而減少ECM在腎臟的進(jìn)行性堆積，這可能是其保護(hù)腎臟的重要作用機(jī)制之一。

綜上所述，高糖能促進(jìn)系膜細(xì)胞增殖、促進(jìn)系膜細(xì)胞ECM的產(chǎn)生，西格列汀可抑制系膜細(xì)胞增殖，減少系膜細(xì)胞FN、ColⅣ的表達(dá)，這可能是其發(fā)揮腎臟保護(hù)作用的機(jī)制之一。目前本研究結(jié)果僅限于體外實(shí)驗(yàn)，下一步將繼續(xù)開(kāi)展動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)。

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