王冬梅，王永學(xué)，楊熙晨，趙迎迎(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院，河南新鄉(xiāng)453003；新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院)

牙周炎是細菌性感染引起的常見口腔疾病，致病菌以革蘭陰性厭氧菌為主，致病菌形成菌落并以菌斑形式沉積在牙間、牙面和修復(fù)體的表面，侵犯牙齦及牙周組織而導(dǎo)致慢性炎癥發(fā)生[1,2]。抑制并清除牙周組織致病菌落是治療牙周炎的重要途徑，機械清除被認為是最有效的治療方法[3]。但是牙周組織解剖形態(tài)復(fù)雜，存在一些器械難以到達的部位，操作死區(qū)較多，并且機械治療對牙周組織破壞嚴重，容易引起繼發(fā)性損傷[4]。米諾環(huán)素屬于四環(huán)素家族成員，是治療牙周的常用藥物，具有廣譜抗菌作用，能對抗牙周組織局部嚴重、抑制膠原酶活性及促進牙周組織再生[5]。鹽酸米諾環(huán)素軟膏(派力奧)由于作用面積、作用時間的局限性，不能在牙周組織發(fā)揮較好的抗菌作用，臨床應(yīng)用效果不滿意。2016年3～10月，我們以鹽酸米諾環(huán)素為原料藥，融合微量殺菌功能元素鋅以及具有良好生物相容性的納米材料，制備持久、緩釋、高黏附的米諾環(huán)素-鋅納米緩釋凝膠，觀察其對大鼠實驗性牙周炎的治療效果。

1 材料與方法

1.1 動物與材料 6月齡SD雄性大鼠30只，體質(zhì)量(248±27)g，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供。牙齦卟啉單胞菌ATCC33277購自四川大學(xué)口腔疾病研究國家重點實驗室。派力奧購自Sunstar INC公司(日本)。

1.2 米諾環(huán)素-鋅納米緩釋凝膠制備 2%殼聚糖乙酸溶液和0.02 mmol/L硫酸鋅溶液等體積60～70 ℃水浴回流4 h，自然冷卻至室溫，獲得殼聚糖-鋅絡(luò)合物溶液。該溶液中加入適量米諾環(huán)素水溶液，攪拌均勻。持續(xù)攪拌下緩慢滴加三聚磷酸鈉(TPP)，體積比為7∶1，至溶液呈現(xiàn)乳白色終止滴加。無水乙醇沉淀微球，洗滌，冷凍干燥得含米諾環(huán)素的殼聚糖-鋅微球。預(yù)冷2%殼聚糖溶液和58%β-GP(4∶1)混合，調(diào)pH 7.0，然后添加含米諾環(huán)素的殼聚糖-鋅微球，攪拌均勻即可，終溶液中米諾環(huán)素濃度2%，鋅濃度1.25 μg/mL。4 ℃保存?zhèn)溆?。上述混合液置?7 ℃水浴約3 min可形成凝膠。

1.3 大鼠實驗性牙周炎模型構(gòu)建 30只大鼠均給予1%戊巴比妥鈉40 mg/kg行腹腔注射麻醉。采用0.3 mm正畸鋼絲，在左上頜第一磨牙近牙齦根方處行牙頸部結(jié)扎，持續(xù)1周。牙齦卟啉單胞菌ATCC33277溶于生理鹽水，均勻涂布至牙齦齦溝內(nèi)，1次/周，持續(xù)6周。6周后可觀察到磨牙牙齦充血、紅腫，探診有血液溢出、牙周袋形成、牙齦溝液增加；取大鼠磨牙齦下菌斑進行細菌厭氧培養(yǎng)，可見菌落密集形成，認為牙周炎模型構(gòu)建成功。

1.4 分組與干預(yù)方法 將模型大鼠隨機分為對照組、派力奧組、米諾環(huán)素凝膠組各10只。派力奧組以派力奧軟膏注入牙周袋內(nèi)，至充滿為止；米諾環(huán)素凝膠組以米諾環(huán)素-鋅納米緩釋凝膠注入牙周袋內(nèi)，至充滿為止；對照組以等體積生理鹽水注入牙周袋內(nèi)，至充滿為止。每周用藥1次，連續(xù)4周。

1.5 觀察指標

1.5.1 治療前后牙齦菌落數(shù) 于治療前及完成治療后，用生理鹽水對大鼠炎癥磨牙沖洗30 s，使用無菌刮治器在牙齦3個位置取菌斑，厭氧環(huán)境下培養(yǎng)6 d。取黑色菌落，ImagePro-pus5.0計數(shù)牙菌斑總菌數(shù)、牙齦卟啉單胞菌數(shù)。

1.5.2 治療前后牙齦出血指數(shù)(SBI)、牙菌斑指數(shù)(PLI) ①SBI:治療前及治療后，將大鼠頭部固定，暴露大鼠患牙，探針探入牙齦溝內(nèi)10 s，觀察牙齦溝出血情況。評分標準：探診無出血為0分；探診后點狀出血，牙齦無顏色改變，無水腫為1分；探診出血，牙齦出現(xiàn)顏色改變，無水腫為2分；探診出血，牙齦出現(xiàn)顏色改變，輕度水腫為3分；探診出血，牙齦出現(xiàn)顏色改變，水腫明顯為4分；自發(fā)性牙齦出血為5分。②PLI:治療前及治療后，在大鼠患牙牙面均勻涂抹2%堿性品紅溶液，生理鹽水沖洗3次，牙齦表面紫紅色即為菌斑位置。評分標準：牙齦無牙菌斑存在為0分，存在薄牙菌斑為1分，存在中等量牙菌斑為2分，存在大量牙菌斑為3分。

1.5.3 治療后牙齒松動度(TM)、牙槽骨喪失(ABL) ①TM:以治療后患牙向頰舌向松動為1分，患牙向頰舌向及近中遠中向均松動為2分，患牙向頰舌向及近中遠中向、垂直向均松動為3分。②ABL:治療后處死大鼠，除去上頜骨軟組織，于1 mol/L氫氧化鈉浸泡5～10 min，甲基藍染色以顯色釉牙骨質(zhì)界，在20倍放大鏡下采用千分尺測量患牙釉牙骨質(zhì)界與牙槽嵴頂?shù)木嚯x，取近頰點、頰點、遠頰點、近舌點、舌點和遠舌點6個測量值，以均值描述牙槽骨喪失值。

2 結(jié)果

2.1 三組牙齦菌落數(shù)比較 治療后米諾環(huán)素凝膠組與派力奧組牙菌斑總菌數(shù)均下降(P均<0.05)，米諾環(huán)素凝膠組牙菌斑總菌數(shù)、牙齦卟啉單胞菌數(shù)均低于派力奧組和對照組(P均<0.05)。見表1。

2.2 三組治療前后SBI、PLI比較 治療后派力奧組、米諾環(huán)素凝膠組SBI、PLI均下降，米諾環(huán)素凝膠組SBI、PLI低于派力奧組和對照組(P均<0.05)。見表2。

表1 三組牙齦菌落數(shù)比較(個，

注：與同組治療前比較，*P<0.05；與對照組同期比較，﹟P<0.05；與派力奧組同期比較，△P<0.05。

表2 三組治療前后SBI、PLI比較(分，

注：與同組治療前比較，*P<0.05；與對照組同期比較，﹟P<0.05；與派力奧組同期比較，△P<0.05。

2.3 三組治療后TM、ABL比較 治療后米諾環(huán)素凝膠組、派力奧組TM、ABL均低于對照組(P均<0.05)。米諾環(huán)素凝膠組TM、ABL均低于派力奧組(P均<0.05)。見表3。

表3 三組治療后TM、ABL比較

注：與對照組比較，*P<0.05；與派力奧組比較，﹟P<0.05。

3 討論

牙周炎的致病菌以革蘭陰性厭氧菌為主，細菌表面物質(zhì)、分泌的毒素、體內(nèi)酶等不僅可直接或間接損傷牙周組織，而且還能激發(fā)宿主炎性免疫反應(yīng)，引起組織細胞變性壞死、牙周膜纖維破壞、牙槽骨吸收等一系列損害，導(dǎo)致牙齦出血、牙周溢膿、牙齒過敏、牙齒松動甚至脫落等一系列癥狀[6]。牙周炎的治療主要包括機械和非機械性治療。機械治療是牙周炎主要治療方式[3]，但是由于牙周組織解剖形態(tài)復(fù)雜、操作難度大，嚴重影響機械治療的效果。抗菌藥物目前被廣泛用于口腔炎性疾病的治療，取得了一定效果[7]。但是抗菌藥物治療牙周炎存在用藥方式選擇的難題，全身用藥時只有一小部分藥物運送到牙周組織，治療濃度相對較低，難以最大限度發(fā)揮抗菌作用；而大劑量、長時間使用抗菌藥物又易引起不良反應(yīng)，同時可導(dǎo)致菌群失調(diào)或耐藥菌株的產(chǎn)生[8]；如果采用含漱、沖洗、涂布等局部用藥方式，則藥物作用面積有限，并且在牙周停留時間較短，藥物滲透性差，影響抗菌效果[4]。

緩釋劑能夠使藥物緩慢、有控制地釋放到病變局部組織，可持續(xù)有效地作用于病變部位。由于藥物在局部緩慢釋放，從而避免了全身用藥所引起的細菌耐藥和不良反應(yīng)。緩釋劑在保持牙周部有效抗菌藥物濃度的同時，還可以減少給藥次數(shù)，從而提高患者的依從性[9]。米諾環(huán)素在牙周炎過程中主要發(fā)揮抗菌作用，其對中間普氏菌、牙齦卟啉單胞菌、伴放線聚集桿菌等主要牙周致病菌均有抑制作用[10]。米諾環(huán)素是脂溶性抗菌藥物，滲透性強，除了能直接穿透細菌細胞壁與tRNA結(jié)合，達到抑菌效果還能外，還能抑制膠原酶活性、促進成纖維細胞附著，抑制骨吸收等作用[11]。鹽酸米諾環(huán)素的高效性和長效性，適宜制備緩釋劑用于牙周炎等局部炎性疾病的治療。鋅作為人體內(nèi)所必需的元素，具有廣泛的生物學(xué)效應(yīng)，局部高濃度的鋅對細菌具有直接殺滅作用[12]。鋅可與細菌內(nèi)核酸、蛋白質(zhì)中的巰基(-SH)、氨基(-NH2)等含硫、氨官能團發(fā)生反應(yīng)來阻斷蛋白表達，以達到殺滅細菌作用。此外，鋅參與機體內(nèi)多種酶的合成與激活，加速組織細胞生長發(fā)育及創(chuàng)傷后組織修復(fù)[13]，促進牙周膜細胞的增殖和分化[14]，在一定程度上具有保護牙體組織和抗菌、促愈的雙重功效。在米諾環(huán)素、鋅之外，我們采用生物可降解聚合物納米材料作為載體，其具有良好的生物相容性，能夠高效富集到靶組織，使裝載藥物最大限度發(fā)揮靶向治療作用，并且可在體內(nèi)降解，不會對人體造成損害。

清除細菌是治療牙周炎最重要的手段。鹽酸米諾環(huán)素軟膏的有效成分是2%含量的鹽酸米諾環(huán)素，與我們自制米諾環(huán)素-鋅納米緩釋凝膠中米諾環(huán)素濃度相同。本研究結(jié)果顯示，治療后米諾環(huán)素凝膠組牙菌斑總菌數(shù)、牙齦卟啉單胞菌數(shù)均低于派力奧組和對照組，提示采用自制米諾環(huán)素-鋅納米緩釋凝膠治療的大鼠無論是牙菌斑總菌數(shù)還是牙齦卟啉單胞菌數(shù)均低于鹽酸米諾環(huán)素軟膏治療，表明米諾環(huán)素-鋅納米緩釋凝膠較鹽酸米諾環(huán)素軟膏有更好的抑菌效果；米諾環(huán)素凝膠組SBI、PLI低于派力奧組，提示米諾環(huán)素-鋅納米緩釋凝膠有較為肯定的抑菌作用；米諾環(huán)素凝膠組TM、ABL低于派力奧組，提示米諾環(huán)素凝膠治療后的牙齒松動度、牙槽骨喪失情況優(yōu)于鹽酸米諾環(huán)素，表明米諾環(huán)素-鋅納米緩釋凝膠可以有效改善牙周炎的臨床體征。

綜上所述，米諾環(huán)素-鋅納米緩釋凝膠能夠有效治療大鼠實驗性牙周炎，可以抑制牙齦致病菌落生長、炎癥蛋白表達，減輕炎癥導(dǎo)致的牙齦出血、牙齦松動等臨床癥狀，具有臨床應(yīng)用價值。

：

[1] Tobón-Arroyave SI, Isaza-Guzmán DM, Pineda-Trujillo N, et al. Association study of vitamin d receptor (vdr) - related genetic polymorphisms and their haplotypes with chronic periodontitis in colombian population[J]. J Clin Diagn Res, 2017, 11(2):60-66.

[2] Usin MM, Tabares SM, Menso J, et al. Generalized aggressive periodontitis: microbiological composition and clinical parameters in non-surgical therapy[J]. Acta Odontol Latinoam, 2016,29(3):255-261.

[3] Martande S, Kumari M, Pradeep AR, et al. Comparative evaluation of efficacy of subgingivally delivered 1.2% Atorvastatin and 1.2% Simvastatin in the treatment of intrabony defects in chronic periodontitis: a randomized controlled trial[J]. J Dent Res Dent Clin Dent Prospects, 2017,11(1):18-25.

[4] 孟煥新. 牙周病學(xué)[M]. 4版.北京:人民衛(wèi)生出版社,2013:25.

[5] Perayil J, Menon KS, Biswas R, et al. Comparison of the efficacy of subgingival irrigation with 2% povidone-iodine and tetracycline HCl in subjects with chronic moderate periodontitis: A clinico microbiological study[J]. Dent Res J (Isfahan), 2016,13(2):98-109.

[6] Koneru B, Shi Y, Wang YC, et al. Tetracycline-containing MCM-41 mesoporous silica nanoparticles for the treatment of escherichia coli[J]. Molecules, 2015,20(11):19690-19698.

[7] Chhina S, Rathore AS, Juneja S. Alpha-2-Macroglobulin levels in gingival crevicular fluid pre- and post-scaling and root planing with adjunctive tetracycline fibers in chronic periodontitis: a randomized controlled trial[J]. J Contemp Dent Pract, 2015,16(6):474-478.

[8] Yadav SK, Khan G, Mishra B. Advances in patents related to intrapocket technology for the management of periodontitis[J]. Recent Pat Drug Deliv Formul, 2015,9(2):129-145.

[9] 王姹,徐燕員,李全利,等.米諾環(huán)素凝膠輔助治療牙周炎的臨床研究[J].安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報,2012,47(1):63-66.

[10] Madhumathi K, Sampath KT. Regenerative potential and anti-bacterial activity of tetracycline loaded apatitic nanocarriers for the treatment of periodontitis[J]. Biomed Mater, 2014,9(3):035002.

[11] Jhinger NK, Jain R. Comparison of periochip (chlorhexidine gluconate 2.5 mg) and arestin (minocycline hydrochloride 1mg) in the management of chronic periodontitis[J]. Indian J Dent, 2015,6(1):20-26.

[12] 楊旸,唐子圣.鋅與齲病關(guān)系的研究進展[J].牙體牙髓牙周病學(xué)雜志,2012,22(9):543-546.

[13] Banerji A, Panzov V, Young M, et al. Hospital admissions for lower respiratory tract infections among infants in the Canadian Arctic: a cohort study[J]. CMAJ Open, 2016,4(4):615-622.

[14] 羅立偉.鋅對人牙周膜細胞增殖分化的影響研究分析[J].吉林醫(yī)學(xué),2009,30(23):28-30.