冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病已經(jīng)成為當(dāng)今社會(huì)影響人類健康的重要疾病,目前病因尚未完全明確,一般認(rèn)為動(dòng)脈粥樣硬化是多病因疾病,是多因素共同作用的結(jié)果。近年來多數(shù)學(xué)者支持“內(nèi)皮損傷反應(yīng)學(xué)說”,認(rèn)為本病的各種主要危險(xiǎn)因素最終都損傷動(dòng)脈內(nèi)膜,其中高血脂損傷內(nèi)皮細(xì)胞導(dǎo)致脂肪沉積出現(xiàn)不同程度的內(nèi)皮細(xì)胞泡沫化,被認(rèn)為是動(dòng)脈粥樣硬化的最重要的危險(xiǎn)因素[1-2],血管內(nèi)皮的損害是動(dòng)脈粥樣硬化的始動(dòng)因素[3-4]。氧化型低密度脂蛋白 (ox-LDL) 是主要的致動(dòng)脈粥樣硬化因素[5-6],ox-LDL 的主要活性成分是溶血卵磷脂(lysophosphatidylcholine,lpc),lpc 能模擬 ox-LDL 致動(dòng)脈粥樣硬化作用[7-9]。目前很多文獻(xiàn)報(bào)道用lpc干預(yù)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)制作內(nèi)皮脂質(zhì)化損傷的泡沫化細(xì)胞模型。如何制作理想的內(nèi)皮脂質(zhì)化損傷的泡沫化細(xì)胞模型,是進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究的基礎(chǔ)。目前在很多文獻(xiàn)里一般都僅僅關(guān)注了lpc的終濃度,也就是lpc的絕對濃度對細(xì)胞模型成敗的影響,但是筆者在多次制作內(nèi)皮脂質(zhì)化損傷的泡沫化細(xì)胞模型實(shí)踐中發(fā)現(xiàn), lpc的相對濃度對內(nèi)皮脂質(zhì)化損傷的泡沫化細(xì)胞模型的成敗也很重要,lpc的相對濃度主要通過細(xì)胞不同的接種密度和lpc不同的干預(yù)終體積來體現(xiàn)。希望本文總結(jié)的實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)?zāi)軌蚪o制作內(nèi)皮脂質(zhì)化損傷的泡沫化細(xì)胞模型的初學(xué)者一些借鑒。

1 材料和方法

1.1 主要試劑與儀器 CKX41顯微鏡:Olympus公司; CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱:Thermo公司;生物安全柜:BAKER公司;ECM培養(yǎng)基: Sciencell公司;溶血卵磷脂(lpc):Sigma公司; DMEM basic:Gibco公司;紅油O試劑盒:ScienCell公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞 HUVECs購于美國ATCC。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 lpc配制:稱取lpc 2.5 mg放于滅菌EP管中,用無血清DMEM 25 ml,配制成濃度為100 mg/L的lpc母液,以0.22 μm混合纖維素微孔濾膜正壓過濾除菌,分裝后-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 細(xì)胞活力檢測:采用細(xì)胞增殖和毒性檢測試劑盒(CCK-8)進(jìn)行檢測,上述細(xì)胞活力檢測實(shí)驗(yàn)按照試劑盒使用說明進(jìn)行操作,加入CCK-8后1 h,酶標(biāo)儀讀取各組OD值反映所在組的細(xì)胞活力。細(xì)胞存活率(%)=(實(shí)驗(yàn)孔OD值-空白孔OD值)/(對照孔OD值-空白孔OD值)×100 %。

1.3.3 HUVECs的不同接種密度對lpc干預(yù)后細(xì)胞存活率的影響:實(shí)驗(yàn)分6組,每組分別設(shè)對照組和實(shí)驗(yàn)組,每組3個(gè)復(fù)孔, HUVECs接種于96孔板,HUVECs的不同接種密度分別為A組 0.5×104/孔、B組 0.75×104/孔、C組 1.0×104/孔、D組 1.25×104/孔、E組 1.5×104/孔、F組 2×104/孔,每孔加入終體積100 μl ECM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h后換液,對照組加入無lpc無血清DMEM,終體積100 μl,實(shí)驗(yàn)組參照文獻(xiàn)[8-9]常用的方法,用終濃度含10 μg/ml lpc的無血清DMEM,終體積100 μl;培養(yǎng)24 h檢測細(xì)胞活力。

1.3.4 不同濃度的lpc對HUVECs細(xì)胞存活率的影響:實(shí)驗(yàn)分5組,每組3個(gè)復(fù)孔。A組:對照組,無lpc;B組:lpc 5 μg/ml;C組:lpc 10 μg/ml;D組:lpc 20 μg/ml;E組: lpc 40 μg/ml。HUVECs接種于96孔板,細(xì)胞密度1.0×104/孔,每孔加入終體積100 μl ECM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h后換液,A組加入終體積為100 μl無lpc無血清DMEM;B、C、D、E組加入lpc的終濃度分別為5 μg/ml、10 μg/ml、20 μg/ml、40 μg/ml的無血清DMEM 100 μl繼續(xù)培養(yǎng)24 h測細(xì)胞活力。

1.3.5 lpc的不同干預(yù)體積對HUVECs細(xì)胞存活率的影響:實(shí)驗(yàn)分6組,每組分別設(shè)對照組和實(shí)驗(yàn)組,每組3個(gè)復(fù)孔, HUVECs接種于96孔板,對照組與實(shí)驗(yàn)組的HUVECs的密度均為1.0×104/孔,每孔加入終體積100 μl ECM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h后換液,根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)換液后各組加入培養(yǎng)液的終體積分別為A組 50 μl,B組75 μl, C組100 μl,D組125 μl,E組150 μl,F組200 μl,每個(gè)對照組為無lpc無血清DMEM,每個(gè)實(shí)驗(yàn)組為含終濃度10 μg/ml lpc同體積的無血清DMEM,培養(yǎng)24 h檢測細(xì)胞活力。

1.3.6 初次與再次脂質(zhì)化損傷的HUVECs存活率變化實(shí)驗(yàn):實(shí)驗(yàn)分2組,每組分別設(shè)對照組與實(shí)驗(yàn)組,各組3個(gè)復(fù)孔。A組 初次脂質(zhì)化組: 對照組,HUVECs接種于96孔板,加終體積100 μl ECM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h,換無血清DMEM終體積100 μl繼續(xù)培養(yǎng)24 h,用于檢測;實(shí)驗(yàn)組,HUVECs接種于96孔板,加終體積100 μl ECM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h,換終濃度10 μg/ml lpc的無血清DMEM終體積100 μl繼續(xù)培養(yǎng)24 h,用于檢測。B組 再次脂質(zhì)化組: 對照組,取初次脂質(zhì)化經(jīng)過lpc干預(yù)24 h后的HUVECs,再次胰酶消化傳代接種于96孔板,后續(xù)培養(yǎng)及干預(yù)條件與A組對照組相同;實(shí)驗(yàn)組,取初次脂質(zhì)化經(jīng)過lpc干預(yù)24 h后的HUVECs,再次胰酶消化后接種于96孔板,后續(xù)培養(yǎng)及干預(yù)條件與A組實(shí)驗(yàn)組相同。

1.3.7 lpc干預(yù)后內(nèi)皮細(xì)胞泡沫化檢測:HUVECs接種于96孔板,HUVECs接種密度為1.0×104/孔,培養(yǎng)液終體積100 μl/孔,實(shí)驗(yàn)分2組,每組3個(gè)復(fù)孔:A組,無lpc對照組,加入終體積100 μl ECM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h后換液,加入終體積為100 μl無lpc無血清DMEM繼續(xù)培養(yǎng)24 h,用油紅O試劑盒檢測內(nèi)皮細(xì)胞泡沫化。 B組,lpc干預(yù)組,HUVECs接種于96孔板,加入終體積100 μl ECM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h后換液,加入lpc終濃度為10 μg/ml終體積100 μl的無血清DMEM繼續(xù)培養(yǎng)24 h,用油紅O試劑盒檢測內(nèi)皮細(xì)胞泡沫化。內(nèi)皮細(xì)胞泡沫化檢測按照油紅O試劑盒檢測說明書進(jìn)行操作。

2 結(jié)果

2.1 HUVECs的不同接種密度對lpc干預(yù)后細(xì)胞存活率的影響 結(jié)果顯示隨著內(nèi)皮細(xì)胞接種密度的增加,lpc干預(yù)后細(xì)胞存活率隨之增加,細(xì)胞接種密度在(0.5～1.5)×104/孔各組間細(xì)胞存活率差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,2×104/孔組的細(xì)胞存活率比1.5×104/孔組稍有增高,2組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。各組細(xì)胞存活率結(jié)果見圖1。

注:統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果均是每一組細(xì)胞存活率與相鄰的前一組相比較;ns:P>0.05;*P<0.05;** P<0.01;***P<0.001圖1 HUVECs的不同接種密度對lpc干預(yù)后細(xì)胞存活率的影響

2.2 不同濃度的lpc對HUVECs細(xì)胞存活率的影響 結(jié)果顯示，lpc干預(yù)組各組間隨著lpc濃度的增加，細(xì)胞存活率出現(xiàn)下降趨勢，5 μg/ml組細(xì)胞存活率高達(dá)(89.96±3.06)%，40 μg/ml組細(xì)胞存活稀少，存活率僅有(5.18±0.88)% ，各組細(xì)胞存活率結(jié)果見圖2。

注:統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果均是每一組細(xì)胞存活率與相鄰的前一組相比較;*P<0.05;** P<0.01;***P<0.001圖2 不同濃度的lpc對HUVECs存活率的影響

2.3 lpc的不同干預(yù)體積對HUVECs細(xì)胞存活率影響的結(jié)果 在同樣的細(xì)胞接種密度,同樣的lpc濃度干預(yù)條件下,lpc不同的干預(yù)體積也是對細(xì)胞存活率顯示出了明顯的影響,從50 μl/孔到150 μl/孔各組細(xì)胞存活率隨著lpc干預(yù)體積的增加細(xì)胞存活率逐漸降低,并且每組間都有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,200 μl/孔組的細(xì)胞存活率比150 μl/孔組的細(xì)胞存活率進(jìn)一步降低,但是差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,各組細(xì)胞存活率結(jié)果見圖3。

注:統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果均是每一組細(xì)胞存活率與相鄰的前一組相比較;ns:P>0.05;*P<0.05;** P<0.01;***P<0.001圖3 lpc的不同干預(yù)體積對HUVECs細(xì)胞存活率的影響

2.4 初次與再次脂質(zhì)化損傷的HUVECs存活率實(shí)驗(yàn)結(jié)果 再次脂質(zhì)化損傷的內(nèi)皮細(xì)胞存活率比較特殊,不是因?yàn)樵俅问艿絣pc損傷而進(jìn)一步下降,反而較初次脂質(zhì)化損傷的細(xì)胞存活率出現(xiàn)了明顯的升高,而且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,各組細(xì)胞存活率結(jié)果見圖4。

注:2組間比較,***P<0.001圖4 初次與再次脂質(zhì)化損傷的HUVECs存活率

2.5 lpc干預(yù)后內(nèi)皮細(xì)胞泡沫化檢測結(jié)果 結(jié)果顯示無lpc干預(yù)的對照組HUVECs內(nèi)未見油紅O染色(見圖5,6),lpc干預(yù)的實(shí)驗(yàn)組HUVECs內(nèi)出現(xiàn)較多的油紅O染色(見圖7,8),提示HUVECs出現(xiàn)了泡沫化。

圖5 對照組內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)未見油紅O染色(顯微鏡啟用顏色視野,×200)

圖6 對照組內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)未見油紅O染色 (顯微鏡啟用白平衡視野,×200)

圖7 lpc組內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)見油紅O染色(顯微鏡啟用顏色視野,×200)

圖8 lpc組內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)見油紅O染色 (顯微鏡啟用白平衡視野,×200)

3 討論

本實(shí)驗(yàn)顯示無lpc干預(yù)的對照組HUVECs內(nèi)未見油紅O染色,給予lpc干預(yù)的實(shí)驗(yàn)組HUVECs內(nèi)出現(xiàn)較多的油紅O染色,顯示HUVECs出現(xiàn)了泡沫化,表明本實(shí)驗(yàn)成功制作了lpc脂質(zhì)化損傷內(nèi)皮的泡沫化細(xì)胞模型。有文獻(xiàn)報(bào)道用油紅O染色觀察組織或細(xì)胞的脂質(zhì)化程度[10-11],油紅O染色量的多少可以反映HUVECs內(nèi)的脂肪滴多少,是直觀體現(xiàn)HUVECs泡沫化程度的一個(gè)指標(biāo)。

本實(shí)驗(yàn)顯示lpc 5 μg/ml時(shí)細(xì)胞存活率與對照組相比降低較少,lpc的濃度從10～40 μg/ml,各組細(xì)胞存活率明顯下降,各組間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。本實(shí)驗(yàn)顯示lpc的濃度達(dá)20 μg/ml及40 μg/ml時(shí)細(xì)胞存活率僅為(13.31±4.46)%和(5.18±0.88)%,鏡下觀察存活細(xì)胞不僅數(shù)量稀少而且生長狀態(tài)不好,難以用于有效實(shí)驗(yàn)研究,本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道一致[12]。用lpc作用于HUVECs制作脂質(zhì)化損傷內(nèi)皮的泡沫化細(xì)胞模型時(shí),一般都認(rèn)為lpc的終濃度為10 μg/ml時(shí)是制作內(nèi)皮脂質(zhì)化損傷泡沫化細(xì)胞模型的適宜濃度,但是實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)在終濃度10 μg/ml的lpc干預(yù)條件下,不同的細(xì)胞接種密度和不同的lpc干預(yù)體積導(dǎo)致的細(xì)胞存活率差別很大,可能出現(xiàn)lpc干預(yù)組細(xì)胞存活率過低或者無lpc干預(yù)的對照組細(xì)胞增長過度密集，出現(xiàn)生長抑制的現(xiàn)象。

目前文獻(xiàn)報(bào)道在進(jìn)行l(wèi)pc干預(yù)HUVECs的脂質(zhì)化損傷實(shí)驗(yàn)時(shí),96孔板上HUVECs接種密度為(0.1～2)×104/孔不等[13-14],各文獻(xiàn)報(bào)道細(xì)胞接種密度差異巨大,但是細(xì)胞接種密度對細(xì)胞存活率的影響未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)顯示HUVECs不同接種密度對細(xì)胞存活率的影響也很大,在0.5×104/孔時(shí)細(xì)胞增殖速度緩慢,lpc干預(yù)后細(xì)胞存活數(shù)量稀少。接種數(shù)量為(0.75～1.5)×104/孔時(shí)細(xì)胞增長速度有明顯增加,而且lpc干預(yù)后細(xì)胞存活率從(35.41±4.00)%逐漸增加到(76.80±5.83)%,而且各組間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。但是2×104/孔組lpc干預(yù)后細(xì)胞存活率增高速度放緩,與1.5×104/孔組細(xì)胞存活率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,而且此時(shí)對照組細(xì)胞出現(xiàn)增長過度密集,可能引發(fā)細(xì)胞生長抑制。這說明內(nèi)皮細(xì)胞脂質(zhì)化損傷的細(xì)胞模型成敗不僅與合適的lpc干預(yù)濃度有關(guān),也與適宜的HUVECs接種密度有關(guān)。細(xì)胞接種密度過于低時(shí),細(xì)胞增長緩慢而且lpc干預(yù)后細(xì)胞稀少可能無法獲得有效的細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行有效的實(shí)驗(yàn)研究。增加細(xì)胞接種密度可以增加細(xì)胞增長速度并且提高lpc干預(yù)后的細(xì)胞存活率。但是細(xì)胞接種密度增加到一定程度可能給對照組細(xì)胞帶來過度增長，出現(xiàn)生長抑制現(xiàn)象從而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性,這一點(diǎn)需要避免出現(xiàn)。

本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)lpc干預(yù)后細(xì)胞存活率與培養(yǎng)孔內(nèi)的lpc干預(yù)體積有關(guān),也就是與lpc干預(yù)時(shí)的培養(yǎng)液的終體積有關(guān),實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在同樣的細(xì)胞接種密度和同樣的lpc終濃度條件下,lpc干預(yù)的實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞存活率與lpc干預(yù)體積呈負(fù)相關(guān)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在lpc干預(yù)HUVECs的脂質(zhì)化損傷的細(xì)胞模型中,在不增加細(xì)胞接種密度的條件下,通過調(diào)節(jié)lpc干預(yù)體積,細(xì)胞存活率的變化范圍很大,可以從(17.19±1.82)%調(diào)節(jié)到(77.78±4.10)%,從而滿足不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮筒煌膶?shí)驗(yàn)需求,同時(shí)也避免了單純依靠增加細(xì)胞接種密度提高細(xì)胞存活率時(shí)導(dǎo)致的對照組細(xì)胞出現(xiàn)過度生長抑制的現(xiàn)象,因此lpc干預(yù)體積也可以作為調(diào)節(jié)細(xì)胞存活率的又一個(gè)有效參數(shù)。因此通過綜合調(diào)節(jié)lpc濃度、細(xì)胞接種密度以及l(fā)pc干預(yù)體積可以更加有助于制作一個(gè)滿足不同實(shí)驗(yàn)需求的脂質(zhì)化損傷的泡沫化細(xì)胞模型。

本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)再次脂質(zhì)化損傷的內(nèi)皮細(xì)胞存活率較初次脂質(zhì)化損傷的細(xì)胞存活率明顯升高,而且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,出現(xiàn)這種現(xiàn)象是否是因?yàn)樵谥|(zhì)化損傷的過程中內(nèi)皮細(xì)胞對脂質(zhì)損傷出現(xiàn)了預(yù)適應(yīng)還是其他的分子機(jī)制,在今后的實(shí)驗(yàn)研究中將會(huì)進(jìn)一步探索。

[]

[1] 葛均波,徐永健.內(nèi)科學(xué)[M].8版.北京:人民衛(wèi)生出版社,2013:220-227.

[2] 王曉楠,周葉,于曉紅,等. 瑞舒伐他汀對ox-LDL誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞損傷中Sphk1/S1P/NF-κB信號(hào)通路的影響[J].中國老年學(xué)雜,2017,37(8):1897-1899.

[3] Zhai H,Chen QJ, Gao XM,et al. Inhibition of the NF-κB pathway by R65 ribozyme gene via adeno-associated virus serotype 9 ameliorated oxidized LDL induced human umbilical vein endothelial cell injury[J].Int J Clin Exp Pathol,2015,8(9):9912-9921.

[4] Li JL, Chen SY, Cai XN, et al. TLR2 expression doesn’t change in ox-LDL mediated inflammation in Human umbilical vein endothelial cells under high glucose culture[J].Int J Clin Exp Med, 2015,8(11):22004-22010.

[5] 任開新,樊子旭,游如春,等. DAPT 在 ox-LDL 損傷 HUVECs過程中的細(xì)胞保護(hù)作用[J].中國病理生理雜志,2017,33(6):1125-1129.

[6] Zhang YL, Cao XQ, Zhu WW,et al. Resveratrol enhances autophagic flux and promotes Ox-LDL degradation in HUVECs via upregulation of SIRT1[J].Oxid Med Cell Longev, 2016,21(2):1-13.

[7] Jung HJ,Im SS,Song DK, et al.Effects of chlorogenic acid on intracellular calcium regulation in lysophosphatidylcholine-treated endothelial cells[J]. BMB Rep,2017,50(6):323-328.

[8] 劉勇,余艷榮,彭維杰,等.吳茱萸次堿改善溶血性磷脂酰膽堿誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞縫隙連接細(xì)胞間通訊功能障礙[J].中國藥理學(xué)通報(bào),2013,29(11):1514-1519.

[9] 張賽丹,彭振宇,劉韶,等.甲基蓮心堿對LPC誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞損傷的保護(hù)作用及與ADMA的關(guān)系[J]. 中國中藥雜志,2008,33(21):2526-2529.

[10] 陳光強(qiáng),朱琳,胡量,等. CRP對血管內(nèi)皮細(xì)胞泡沫化及IL-6、MCO-1表達(dá)的影響[J]. 醫(yī)學(xué)研究雜志,2009,38(7):46-49.

[11] Cherepanova OA,Gomez D,Shankman LS,et al. Activation of the pluripotency factor OCT4 in smooth muscle cells is atheroprotective[J]. Nature Med,2016, 22(6):657-668.

[12] 趙晶,徐守竹,宋凡,等.二苯乙烯苷調(diào)節(jié)ROS相關(guān)JNK通路對LPC誘導(dǎo)HUVECs損傷的作用[J]. 中成藥,2015,37(3):487-492.

[13] 廖昆,尹衛(wèi)東.阿托伐他汀對溶血磷脂酰膽堿所致血管內(nèi)皮功能損傷的保護(hù)作用[J].吉林醫(yī)學(xué),2011,32(19):3944-3945.

[14] 韓海玲,孫玉芹,宋文剛,等.紅花黃色素對內(nèi)皮細(xì)胞增殖及凋亡的保護(hù)作用[J].中國實(shí)驗(yàn)診斷學(xué),2011,15(1):51-54.