吳勝蓮 唐少軍 靳磊 邵晨霞 楊祎 賀月林

摘要：【目的】評價不同茯苓菌株質(zhì)量并鑒定其遺傳關(guān)系，為茯苓菌株資源合理利用及優(yōu)良菌株選育提供參考?！痉椒ā恳?1株不同來源的茯苓菌株為研究對象，分別采用平面培養(yǎng)法測定其菌絲生長速率，松樹兜栽培法測定其菌核產(chǎn)量，反復(fù)轉(zhuǎn)接法測定其遺傳穩(wěn)定性。提取不同茯苓菌株的總DNA，PCR擴(kuò)增ITS序列，進(jìn)行ITS序列分析，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。同時檢測菌株間的菌絲拮抗性，結(jié)合ITS序列分析結(jié)果進(jìn)一步鑒定茯苓菌株遺傳關(guān)系?！窘Y(jié)果】11個供試菌株中，8、9和12號菌株的菌絲生長速率、菌核產(chǎn)量和遺傳穩(wěn)定性均較高，1、7和13號菌株較低。茯苓ITS序列長度為1600 bp，其序列分析結(jié)果顯示，1、2、3、4、7和10號菌株與Wolfporia cocos intemal transcribed spacer 1的同源性高達(dá)100%，8、9、11、12和13號菌株與W.cocos strain LP-13的同源性達(dá)99%，表明供試茯苓菌株屬于兩個不同的亞種。系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹分析結(jié)果顯示，1、2、3、4、7和10號菌株聚為一類，菌株間的遺傳關(guān)系非常接近，存在同種異名的可能；8、9、11、12和13號菌株聚為另一類，菌株間的遺傳距離較大，存在種內(nèi)差異?！窘Y(jié)論】通過測定菌絲生長速度、菌核產(chǎn)量和遺傳穩(wěn)定性評價茯苓菌株質(zhì)量切實(shí)可行，ITS序列分析可有效將茯苓菌株鑒定到種級分類單元，并明確茯苓菌株間的遺傳關(guān)系。

關(guān)鍵詞：茯苓；菌株；質(zhì)量評價；ITS序列；遺傳關(guān)系

0引言

【研究意義】茯苓（Poria cocos）隸屬于多孔菌科茯苓菌屬，寄生于松植物的根莖部位，是最早納入《中國藥典》的藥用食用菌之一（李燕等，2010），具有健胃、安神、抗癌、增強(qiáng)免疫力等功效（Lee et a1，2004；Chen et al，2010；Lee et al，2013；Sun，2014）。茯苓作為傳統(tǒng)中藥材，在中藥材中的配伍率達(dá)80%（張建逵等，2014）。近年來，茯苓產(chǎn)業(yè)化水平日益提升，優(yōu)良菌種是保障茯苓產(chǎn)量和質(zhì)量的關(guān)鍵，常通過誘變育種、雜交育種、分子育種等手段進(jìn)行選育和改良（彭衛(wèi)紅等，2005；Wu et al，2016；Xiang et al，2016），從而使其滿足產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的需求。但菌種分離、培育等方法存在一定差異，且國內(nèi)以相互引種替代新品種，導(dǎo)致菌種質(zhì)量不一致。因此，建立一套茯苓菌株質(zhì)量評價體系，鑒別茯苓菌株問的生物遺傳學(xué)差異，明確其遺傳關(guān)系，對茯苓優(yōu)良菌株的選育與改良具有重要意義。【前人研究進(jìn)展】目前，國內(nèi)外有關(guān)茯苓的研究主要集中在營養(yǎng)成分和藥理上，對其種質(zhì)特性研究較少。熊杰等（2006）對茯苓菌絲體、子實(shí)體和擔(dān)孢子的形態(tài)特征及適宜的生長發(fā)育條件進(jìn)行了研究，但未對茯苓菌株的質(zhì)量作出系統(tǒng)評價。謝賢安等（2008）利用ISSR分子標(biāo)記對8個不同來源的茯苓菌株進(jìn)行DNA指紋圖譜分析，將所有供試菌株完全區(qū)分開來，發(fā)現(xiàn)其具有豐富的遺傳多樣性。蔡丹鳳（2013）利用RAPD分子標(biāo)記對國內(nèi)14個茯苓當(dāng)家栽培菌株進(jìn)行DNA指紋圖譜分析，并對親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的8個茯苓菌株進(jìn)行結(jié)苓對比，結(jié)果篩選出優(yōu)良菌株川杰1號-A5，其結(jié)苓早，產(chǎn)量高。蔡志欣等（2013）利用SRAP分子標(biāo)記對福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所保藏的32個茯苓菌株進(jìn)行DNA指紋圖譜分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)10對引物擴(kuò)增獲得23條特異性條帶，其中31個茯苓菌株遺傳相似系數(shù)較高，表明茯苓菌株遺傳背景較窄。徐雷等和陳科力（2014）從我國各地收集12個茯苓菌株并開展栽培試驗(yàn)，篩選出適合湖北產(chǎn)區(qū)栽培且具有較高經(jīng)濟(jì)效益的優(yōu)良菌株。【本研究切入點(diǎn)】ITS序列分析以其高效率、高準(zhǔn)確率而廣泛應(yīng)用于近緣種的分類與鑒定。黃龍花等（2009）將ITS序列分析與堿基比對相結(jié)合對鳳尾菇的分類地位及拉丁名進(jìn)行研究，結(jié)果證實(shí)ITS序列分析在近緣種的分類鑒定上具有較高應(yīng)用價值。但至今鮮見通過ITS序列分析系統(tǒng)評價茯苓質(zhì)量并利用菌株問的遺傳關(guān)系辨別同種異名的研究報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】測定不同來源茯苓菌株的菌絲生長速度、菌核產(chǎn)量和遺傳穩(wěn)定性，對其質(zhì)量進(jìn)行評價，并分析菌株問的遺傳關(guān)系，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，為茯苓菌株資源合理利用及優(yōu)良菌株選育提供參考。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

供試茯苓菌株編號及來源見表1。Taq DNA聚合酶、pMD18-T載體、質(zhì)粒提取試劑盒和1 kb DNALadder Maker均購自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1菌絲生長速率測定采用打菌塊法將茯苓菌株接種于含PDA固體培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿（直徑9cm）中，正置于26℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1d后，每8h測量菌落直徑，直至菌落長滿培養(yǎng)皿，并計算菌絲生長速率（菌落直徑/培養(yǎng)天數(shù)）。

1.2.2菌核產(chǎn)量測定采用松樹兜栽培法栽培茯苓（蔡丹鳳等，2007），栽培9個月后采收，測定每個菌核的重量，以單株菌核的總重量作為菌核產(chǎn)量。每菌株設(shè)3次重復(fù)。

1.2.3遺傳穩(wěn)定性測定采用打菌塊法將茯苓菌株接種于含PDA固體培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿（直徑9cm）中，正置于26℃培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)，菌絲長滿后為第1代種，再用同樣方法將菌絲轉(zhuǎn)接至新的PDA固體培養(yǎng)基上，菌絲長滿后為第2代種，如此反復(fù)轉(zhuǎn)接7代，將第7代菌絲以打孔法接種（7塊菌塊）至搖瓶液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，同時以第1代為對照，25℃下150r/min振蕩培養(yǎng)7d。離心收集菌絲球，60℃烘干至恒重，用電子天平精確稱重，測定其生物量大小。3次重復(fù)，取平均值。

1.2.4總DNA提取采用改良的氯化芐法（朱衡等，1994）提取茯苓總DNA：用液氮將茯苓菌絲研磨成粉末后，轉(zhuǎn)移至5mL離心管中，加入1mL抽提液（100 mmol/L Tris-HCl，40 mmol/L EDTA，pH 8.0）振蕩混勻，加入0.2μL10%SDS、800.0μL氯化芐和1.0μL RNA酶（2.5 U/L）后劇烈振蕩，50℃保溫1 h（每隔10 min劇烈振蕩一次），加入200μL 3 mol/LNaAC（pH 5.2）混勻，冰浴10 min，室溫下8000 r/min離心5 min，取上清液，加入等體積異丙醇，室溫放置5 min，1000 r/min離心3 min，棄上清液，沉淀用2 mL 70%乙醇洗滌（確保沉淀懸浮起來），自然風(fēng)干，溶于30μL無菌水中，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5ITS序列擴(kuò)增以提取的總DNA為模板，采用通用引物ITS 1（5'-TCCGTAGGTGGTGAACCTGCGG-3'）和ITS4（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'）PCR擴(kuò)增ITS序列。反應(yīng)體系30.0μL：10xPCR Bu-ffer 5.μL，DNA模板2.0μL，Taq DNA聚合酶2 U，dNTP 3.0μL，正、反引物各1.0μL，以無菌去離子水補(bǔ)足至30.0μL。擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性3 min，94℃45 s，55℃45 s，72℃90 s，進(jìn)行32個循環(huán)；72℃延伸10 min，4℃終止反應(yīng)。取2.0μL PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測。

1.2.6重組質(zhì)粒構(gòu)建及轉(zhuǎn)化將PCR擴(kuò)增獲得的ITS序列連接至pMDl8-T載體，轉(zhuǎn)入大腸桿菌top10后，提取陽性質(zhì)粒送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測序。

1.2.7ITS序列分析及系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹構(gòu)建將ITS序列測序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫上進(jìn)行BLAST比對，從中獲取與供試茯苓菌株親源關(guān)系較近的模式菌株ITS序列。運(yùn)用MEGA 3.1和ClustalX 1.81，采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。

1.2.8菌株間的菌絲拮抗性檢測將茯苓菌株接種到PDA固體培養(yǎng)基，每個平皿接3種茯苓菌株，28℃培養(yǎng)至菌絲覆蓋整個平皿，觀察各菌株問的菌絲是否有拮抗線。結(jié)合ITS序列分析結(jié)果進(jìn)一步鑒定茯苓菌株，以確認(rèn)ITS序列分析分類的菌株問是否具有菌絲拮抗性。

1.3統(tǒng)計分析

利用SPSS 19.0對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析。

2結(jié)果與分析

2.1茯苓菌株菌絲生長速率及菌核產(chǎn)量測定結(jié)果

由表2可看出，所有茯苓菌株的菌絲生長速度均較快，5 d即可長滿培養(yǎng)皿，但不同茯苓菌株的菌絲生長速率和菌核產(chǎn)量存在明顯差異，其中以8號菌株的菌絲長勢最好，菌絲潔白，氣生菌絲粗壯濃密，生長速率最高，達(dá)1.82 cm/d，其次是12號（1.80 cm/d）和9號菌株（1.78 cm/d），而1號菌株最低，僅1.60 cm/d，且菌絲較稀疏；菌核產(chǎn)量也以8號菌株最高，達(dá)6.76 kg，其次為12號（6.04kg）和9號菌株（5.76kg），以1號菌株最低，僅5.08 kg；8、9和12號菌株的菌核形狀規(guī)則、肉質(zhì)純白，無泡苓、砂苓及跑苓現(xiàn)象，結(jié)實(shí)程度（比重）較好，1、7和13號菌株呈不規(guī)則狀，有泡苓現(xiàn)象，質(zhì)量較差。

2.2茯苓菌株遺傳穩(wěn)定性分析結(jié)果

將各菌株傳代前后的生物量進(jìn)行比較，結(jié)果如表3所示，2、3、4、8、9、10、11和12號菌株的第7代與第1代發(fā)酵生物量無顯著差異（P>0.05，下同），但1、7和13號菌株的第7代發(fā)酵生物量顯著降低，表明1、7和13號菌株的遺傳穩(wěn)定性較差，不適合用于發(fā)酵生產(chǎn)。

2.3茯苓總DNA的提取結(jié)果

利用改良的氯化芐法能有效提取茯苓總DNA，省時省力，且提取的茯苓總DNA條帶清晰（圖1），性質(zhì)穩(wěn)定，無干擾條帶，純度高，可作為PCR擴(kuò)增ITS序列的DNA模板。

2.4茯苓ITS序列擴(kuò)增及比對分析結(jié)果

茯苓ITS序列PCR擴(kuò)增結(jié)果顯示，PCR產(chǎn)物條帶單一且清晰，大小約1600 bp，與預(yù)期結(jié)果相符（圖2）。將PCR產(chǎn)物雙向測序后進(jìn)行拼接，發(fā)現(xiàn)茯苓ITS序列大小為1600 bp。將其在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST比對分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)相似菌株共有4個，其中1、2、3、4、7和10號菌株與W.cocos intemal tran-scribed spacer 1的同源性高達(dá)100%，8、9、11、12和13號菌株與W.cocos strain LP-13的同源性達(dá)99%。因此，初步鑒定供試茯苓菌株屬于兩個不同的亞種。

2.5茯苓菌株的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹構(gòu)建結(jié)果

從構(gòu)建的茯苓菌株系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹（圖3）可知，1、2、3、4、7和10號菌株聚為一類（Group 1），且和4個相似菌株在同一個分支上，表明1、2、3、4、7和10號菌株與4個相似菌株的同源性較高，菌株問的遺傳距離為0，存在著同種異名的可能；而8、9、11、12和13號菌株聚為另一類（Group 2），與4個相似菌株均不在同一個分支上。Group 1和Group 2遺傳差異大，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，且Group 2菌株問的遺傳距離也較大，存在種內(nèi)差異?？梢姡谙到y(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹可篩選出遺傳差異較大的菌株，為茯苓菌種選育提供親本材料。

2.6茯苓菌株間的菌絲拮抗性檢測結(jié)果

選取1、2、3、8和12號菌株進(jìn)行菌絲拮抗性檢測，結(jié)果表明，茯苓1、2和3號菌株間無菌絲拮抗線，進(jìn)一步證實(shí)茯苓1、2和3號菌株存在同種異名的可能；但1、2、3號菌株與8、12號菌株間有菌絲拮抗線，表明茯苓1、2、3號和8、12號菌株存在種屬差異，屬于兩個不同的亞種，與茯苓ITS序列分析結(jié)果一致。說明茯苓菌株問的菌絲拮抗性可用于鑒別菌株間遺傳關(guān)系。

3討論

目前，食用菌菌種雜而混亂，菌種制備不規(guī)范，菌種退化且同種異名現(xiàn)象普遍存在，嚴(yán)重影響食用菌產(chǎn)業(yè)化的發(fā)展，因此，加強(qiáng)食用菌菌株質(zhì)量評價對食用菌的生產(chǎn)和育種具有重要意義。其中，菌絲生長速率、菌核產(chǎn)量、遺傳穩(wěn)定性等生物學(xué)特性是評價食用菌菌種質(zhì)量的重要指標(biāo)（王振福，1997）。本研究通過對不同來源茯苓菌株的菌絲生長速率、菌核產(chǎn)量和遺傳穩(wěn)定性進(jìn)行測定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，8、9和12號菌株較優(yōu)質(zhì)，菌絲潔白粗壯、生長速度快、質(zhì)地致密、菌絲爬壁能力強(qiáng)，具有濃郁、特殊的茯苓芳香味，尤其是8號菌株，其生長速率和菌核產(chǎn)量均高于其他菌株，且遺傳穩(wěn)定性較高，可應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)；而1、7和13號菌株培養(yǎng)6 d后菌絲褐化，培養(yǎng)基有色素產(chǎn)生，且菌核產(chǎn)量較低，遺傳穩(wěn)定性較低，質(zhì)量較差，不適用于生產(chǎn)。

菌株生物學(xué)特性能反應(yīng)菌種質(zhì)量的優(yōu)劣，但無法鑒定菌株的種屬及遺傳關(guān)系，難以鑒別是否同種異名。由于茯苓無菌絲鎖狀聯(lián)合且子實(shí)體形成時間長（Lindner and Banik，2008），缺乏可靠的形態(tài)學(xué)和生化鑒定指標(biāo)，對茯苓菌株種屬鑒定較困難。但通過ITS序列分析和BLAST比對研究茯苓菌株間的基因差異，能簡便、快速、客觀地揭示其遺傳關(guān)系（Leeet al，2000；Atsumi et al，2007）。本研究通過ITS序列分析鑒別茯苓菌株問的遺傳關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)11株茯苓菌株可分為兩個大類，1、2、3、4、7和10號菌株聚為一類，且遺傳距離非常接近，其同源性為100%，推測可能為同一個種，存在同種異名的可能；8、9、11、12和13號菌株聚為另一類，菌株問的遺傳距離較大，菌株間存在種內(nèi)差異。兩個大類遺傳差異較大，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。此外，在大多數(shù)真菌中存在不親和性，其是一種識別異己的遺傳系統(tǒng)，能引起反應(yīng)區(qū)產(chǎn)生拮抗反應(yīng)（潘麗晶等，2013）。本研究利用這一原理對不同茯苓菌株進(jìn)行菌絲拮抗性檢測，結(jié)果表明，1、2、3號菌株與8、12號菌株存在種屬差異，屬于兩個不同的亞種，與茯苓ITS序列分析結(jié)果一致。可見，我國茯苓菌株的遺傳差異不明顯，需加大茯苓菌種資源的保護(hù)及研究力度，促進(jìn)茯苓產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。

4結(jié)論

通過測定菌絲生長速度、菌核產(chǎn)量和遺傳穩(wěn)定性評價茯苓菌株質(zhì)量切實(shí)可行，ITS序列分析可有效將茯苓菌株鑒定到種級分類單元，并明確茯苓菌株問的遺傳關(guān)系。