孫 婉 劉福存 袁 強(qiáng) 單樂(lè)天 肖魯偉 黃家衛(wèi)

（浙江中醫(yī)藥大學(xué)，浙江 杭州 310000）

附子為毛茛科植物烏頭（Aconitum carmichaelii Debx.）子根的加工品，味辛、甘，性大熱，有毒，歸心、腎、脾經(jīng)；具有回陽(yáng)救逆、補(bǔ)火助陽(yáng)、散寒止痛之功效，用于亡陽(yáng)虛脫、肢冷脈微、陰寒水腫、寒濕痹痛等癥［1］，是四川道地藥材之一，早在《神農(nóng)本草經(jīng)》中就有附子的記載，稱其為“百藥之長(zhǎng)”［2］?，F(xiàn)代藥理研究表明：附子具有強(qiáng)心、升壓、抗休克、抗血栓形成、抗腹瀉和糖皮質(zhì)激素樣作用［3］等多種藥理作用?！吨袊?guó)藥典》中生附子劑量是 3～15 g［4］，《中藥大辭典》中用于內(nèi)服的湯煎劑劑量為 3～9 g，回陽(yáng)救逆可用 18～30 g［5］。 近年來(lái)，中醫(yī)火神派代表人物吳佩衡、范中林用方時(shí)常有劑量動(dòng)輒60 g，更有甚者達(dá)到250～500 g左右，比起中國(guó)藥典規(guī)定的3～15 g用量相差甚遠(yuǎn)。臨床報(bào)道表明，附子中毒的毒性主要表現(xiàn)在心血管系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、消化系統(tǒng)等。如口唇、舌及肢體麻木，胸悶，呼吸困難，頭暈，心慌，咽喉、食管、胃部燒灼感，惡心嘔吐，嚴(yán)重者可出現(xiàn)休克、心律失常、昏迷，甚至死亡［6］。其中附子用量過(guò)大也是附子不良反應(yīng)較多的重要原因之一。附子的主要活性成分是烏頭類生物堿，它們既是附子的藥效成分，也是主要的毒性成分［7-8］。烏頭類生物堿尤其是雙酯二萜類生物堿，如烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿等的毒性大。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道烏頭堿能夠讓人中毒的內(nèi)服劑量為0.2 mg，口服雙酯類生物堿 2～3 mg 即可致人死亡［9］。附子是一味常用中藥，然而其毒性影響了開(kāi)發(fā)和使用。本實(shí)驗(yàn)以不同煎煮時(shí)間的附子為樣本，采用高效液相法測(cè)定其3種毒性成分含量；對(duì)ICR小鼠進(jìn)行急性毒性觀察和評(píng)價(jià)，探索不同煎煮時(shí)間對(duì)附子毒性的影響，為其臨床安全用藥提供文獻(xiàn)依據(jù)。

1 材料與試劑

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器 島津LC-20A高效液相色譜儀，KQ5200B超聲機(jī)（昆山市超聲儀器有限公司），80-2電動(dòng)離心機(jī)（常州奧華儀器公司），HH系列數(shù)顯恒溫水浴鍋（上海江星儀器有限公司），RE-2000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 ICR小鼠，雌雄各半，18～20 g，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（滬）2013-0016。

1.3 藥物與試劑 附子（購(gòu)于四川江油中壩附子科技發(fā)展有限公司，產(chǎn)地：四川江油，批號(hào) 160701）經(jīng)浙江中醫(yī)藥大學(xué)葛爾寧教授鑒定為毛茛科植物烏頭（Aconitum carmichaeli Debx.）子根的加工品。烏頭堿（批號(hào)：16031105）、新烏頭堿（批號(hào)：16032504）、次烏頭堿（批號(hào)：16032106），均購(gòu)自成都曼思特。甲醇（色譜級(jí)，美國(guó) TEDIA，批號(hào)：13060412），三乙胺（分析級(jí)，上海化學(xué)試劑，批號(hào)：20091201），氯仿（分析級(jí)，西隴化工股份有限公司，批號(hào)：121128），二氯甲烷（分析級(jí)，天津賽浮瑞科技有限公司，批號(hào)：20120406001），娃哈哈純凈水（色譜級(jí)，杭州娃哈哈百立食品有限公司，批號(hào)：3106BL）

1.4 附子原藥材鑒定液的制備 取附子粉末（過(guò)3號(hào)篩）約2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加氨試液3 mL，精密加入異丙醇-乙酸乙酯（1∶1）混合溶液 50 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理（功率300 W，頻率40 kHz，水溫＜25℃）30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用異丙醇-乙酸乙酯（1∶1）混合溶液補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)。精密量取續(xù)濾液25 mL，40℃以下減壓回收溶劑至干，殘?jiān)芗尤攵燃淄? mL溶解，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

1.5 附子不同時(shí)間水煎液的制備 取2份生附子50 g分別置于1 L的圓底燒瓶中，加10倍的水，浸泡30 min，各加回流提取30、60 min濾過(guò)，殘?jiān)尤?倍的水，再各加熱回流提取30、60 min；濾過(guò)，合并兩次煎液，真空減壓加熱濃縮1 g/mL，即得不同時(shí)間煎煮液，各煎煮液以5000 r/min離心10 min，取上清液即得。

2 HPLC測(cè)定不同煎煮時(shí)間的附子水煎液中3種毒性生物堿的含量

2.1 色譜條件 Hypersil-BDS柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；以甲醇-水-氯仿-三乙胺（100∶50∶3∶0.15）為流動(dòng)相， 流速：1 mL/min，柱溫 30 ℃，進(jìn)量樣 5 μL。

2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取新烏頭堿、烏頭堿、次烏頭堿標(biāo)準(zhǔn)品各1.0、0.96、1.4 mg，加入10 mL二氯甲烷定容，充分搖勻溶解作為對(duì)照品混合溶液。

2.3 供試品溶液的制備 供試品1溶液制備：取制備的附子原藥材鑒定液，0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，即得供試品1溶液。供試品2、3溶液制備：取不同煎煮時(shí)間（30、60 min）的附子水煎液各 18 mL，分別用二氯甲烷和氯仿，各萃取3次，18 mL/次，合并二氯甲烷和氯仿層萃取液，55℃減壓回收至干，加二氯甲烷定容3 mL，0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，即得供試品2、3溶液。

2.4 樣品含量測(cè)定 按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品中3個(gè)毒性成分的含量。

3 HPLC試驗(yàn)結(jié)果

3.1 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 按照上述色譜條件，取2.3項(xiàng)下所制備的供試品1、2、3溶液分別進(jìn)樣，所得譜圖見(jiàn)圖1。

供試品1溶液（附子水煎0 min）

供試品2溶液（附子水煎30 min）

圖1 不同煎煮時(shí)間附子水煎液HPLC色譜圖

3.2 線性關(guān)系考察 分別將“2.2”項(xiàng)下所配制的的新烏頭堿（0.1 mg/mL）、烏頭堿（0.096 mg/mL）和次烏頭堿（0.14 mg/mL）的混合對(duì)照品溶液稀釋 2、4、6、8、10 倍。在上述色譜條件下，按稀釋液濃度由低至高順序依次進(jìn)樣。以平均峰面積對(duì)進(jìn)樣量進(jìn)行線性回歸。回歸方程見(jiàn)表1，表明在上述范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表1 3種烏頭堿的線性關(guān)系

3.3 精密度試驗(yàn) 取“2.2”項(xiàng)下制備的系列混合對(duì)照品溶液 5 μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件，重復(fù)測(cè)定 6次，測(cè)定峰面積，結(jié)果表明，新烏頭頭堿、烏頭堿和次烏頭堿峰面積的RSD分別為1.2%、1.8%、2.3%。

3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取供試品溶液5μL，分別于 0、1、2、4、8、12 h進(jìn)樣，測(cè)定峰面積，新烏頭堿、烏頭堿和次烏頭堿峰面積的RSD分別為1.1%、2.0%、1.8%。表明供試品溶液在12 h穩(wěn)定性良好。

3.5 重復(fù)性試驗(yàn) 按“2.3”項(xiàng)下平行制備6份供試品溶液，在上述色譜條件下進(jìn)樣5 μL，測(cè)定峰面積，新烏頭堿、烏頭堿和次烏頭堿的峰面積RSD分別為1.49%、2.43%、1.08%。

3.6 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取0.1g已知3種毒性成分含量的附子粗粉6份，分別精密加入與樣品中等量的對(duì)照品，按“2.3”項(xiàng)下方法制備得供試品溶液，用“2.1”項(xiàng)下色譜條件各進(jìn)樣5 μL，測(cè)定3種烏頭堿的峰面積，新烏頭堿、烏頭堿、次烏頭堿的平均加樣回收率（n=6）為 99.2%、96.8%、99.5%，RSD 分別為 1.84%、2.4%、1.33%。

3.7 樣品中3種毒性成分檢測(cè) 由表2可知，附子0 min水煎液中3種烏頭堿含量最高。隨著煎煮時(shí)間的延長(zhǎng)，新烏頭堿在附子水煎30 min和附子水煎60 min含量變化不大，烏頭堿和次烏頭堿含量明顯減少，煎煮60 min時(shí)，烏頭堿幾乎檢測(cè)不到（由于樣品中3個(gè)成分含量差異較大，附子水煎0 min是經(jīng)過(guò)稀釋后測(cè)量的；而附子水煎30 min和附子水煎60 min的樣品是經(jīng)過(guò)萃取后測(cè)量的，最后統(tǒng)一折換成生藥量）。

表2 樣品中3種烏頭堿的含量（n＝3，μg/g）

4 小鼠急性毒性試驗(yàn)

4.1 藥物制備 1）附子0min藥物制備。按“1.4”項(xiàng)下方法制備附子的異丙醇-乙酸乙酯混合溶液，將續(xù)濾液40℃減壓回收溶劑至干，殘?jiān)尤胝麴s水溶解，使得藥物濃度達(dá)到5 g/mL，即得。2）附子水煎液的制備。按“1.5”項(xiàng)下方法制備附子水煎30 min藥液和附子水煎60 min藥液，并將水煎液濃縮到5 g/mL。

4.2 分組及給藥 取清潔級(jí)ICR小鼠32只，按體質(zhì)量隨機(jī)分組：正常對(duì)照組、附子0 min組，附子水煎30 min組、附子水煎60 min組，每組8只，雌雄各半。實(shí)驗(yàn)前小鼠禁食不禁水12 h。各組小鼠按100 kg/g灌胃給藥，每日1次，連續(xù)7 d，正常對(duì)照組每日給予蒸餾水。

4.3 小鼠日常及行為學(xué)觀察 各組小鼠灌胃給藥后，正常飼養(yǎng)，每日觀察，4 h后稱取體質(zhì)量，密切觀察各小鼠的動(dòng)度進(jìn)食、飲水情況及7 d內(nèi)可能出現(xiàn)的飲食異常、異常肌肉運(yùn)動(dòng)、對(duì)外反應(yīng)遲緩、瞳孔改變、異常分泌物、大小便異常、眼球凸出、眼瞼下垂、呼吸異常、皮膚顏色改變等毒性反應(yīng)和死亡情況。若有小鼠死亡，則將死亡小鼠解剖，肉眼觀察心、肝、脾、肺、腎等臟器的病理變化，7 d觀察期結(jié)束后，將每組存活的小鼠取血處死并進(jìn)行解剖，按照上述同樣方法對(duì)主要臟器大體病理變化進(jìn)行肉眼觀察并記錄。小鼠取血后，將所取的血樣水平靜置2 h，3000 r/min低速離心10 min，取上清液即得小鼠血清。采用相關(guān)儀器設(shè)備檢測(cè)血清中以下指標(biāo)：谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（GOT）、肌酸激酶（CK）、乳酸脫氫酶（LDH）。

4.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS23.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。計(jì)量資料以（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析及LSD檢驗(yàn)。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

5 小鼠急性毒性試驗(yàn)結(jié)果

5.1 小鼠急性毒性癥狀觀察 灌胃后，附子0 min組和附子水煎30 min組急性毒性表現(xiàn)相似，表現(xiàn)為呼吸急促，躁動(dòng)不安，之后閉眼，眼球渾濁、黯淡，精神沉郁，呼吸短促，體溫偏低，懶動(dòng)，協(xié)調(diào)性差等現(xiàn)象。特別是附子0 min組癥狀加重，尾巴青紫，被毛凌亂。附子水煎60 min組小鼠無(wú)顯著變化，活動(dòng)量減少；正常對(duì)照組小鼠活躍，在籠中來(lái)回走動(dòng)，攝食飲水均正常。死亡的小鼠被毛凌亂、無(wú)光澤，尾巴、四肢青紫，眼球塌陷。對(duì)死亡小鼠進(jìn)行解剖，肝臟體積增大、色暗紅、邊緣變鈍，其他臟器無(wú)明顯異常。

5.2 附子水煎液給藥后對(duì)存活小鼠的體質(zhì)量變化見(jiàn)表3。與正常對(duì)照組相比，各給藥組小鼠的體質(zhì)量明顯下降（P＜0.05）；通過(guò)比較體質(zhì)量差值可知不同煎煮時(shí)間的附子水煎液對(duì)小鼠的毒性有顯著差異（P＜0.05）；說(shuō)明隨著煎煮時(shí)間的延遲，附子對(duì)小鼠的毒性降低。

表3 不同時(shí)間附子水煎液對(duì)小鼠體質(zhì)量的影響（g，±s）

表3 不同時(shí)間附子水煎液對(duì)小鼠體質(zhì)量的影響（g，±s）

—表示無(wú)數(shù)據(jù)，給藥1 d后即死亡。與正常對(duì)照組比較，*P＜0.05。下同。

組 別 n 體質(zhì)量差值給藥前體質(zhì)量 給藥后體質(zhì)量正常對(duì)照組 8 2.37附子0 min組 8 —附子水煎30 min組 8 -1.45*24.63±1.84 27.00±2.04 23.31±2.03 —24.85±2.65 23.40±2.29*附子水煎60 min組 8 -0.25*23.63±2.62 23.38±3.10*

5.3 各組小鼠死亡率統(tǒng)計(jì) 見(jiàn)表4。附子0 min組灌胃給藥30 min后，小鼠均發(fā)生死亡現(xiàn)象，死亡率為100.00%；附子水煎30 min組第3日給藥發(fā)現(xiàn)小鼠死亡，給藥7 d后，小鼠死亡率為37.50%；而附子水煎60 min組和空白組小鼠在給藥7 d內(nèi)無(wú)死亡現(xiàn)象。

表4 不同煎煮時(shí)間的附子對(duì)小鼠死亡率的影響

5.4 各組小鼠血常規(guī)檢查結(jié)果 見(jiàn)表5。與正常對(duì)照組相比，附子水煎30 min組小鼠血液中ALT、GOT、CK和LDH含量均升高且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）表明附子水煎30 min水煎液對(duì)肝臟和心臟有一定的毒性。但附子水煎 60 min水煎液中 ALT，AST，CK和LDH含量與正常對(duì)照組相比，均未見(jiàn)顯著差異（P＞0.05）。

表5 各組小鼠血常規(guī)檢查結(jié)果比較（±s）

表5 各組小鼠血常規(guī)檢查結(jié)果比較（±s）

組 別 n ALT（U/L） GOT（U/L） CK（U/L） LDH（IU/L）正常對(duì)照組 3附子水煎30 min組 3 30.27±0.61 79.60±4.40 859.67±123.46 762.72±120.38 71.13±2.60*159.50±88.96*1843.38±1364.77*1668.52±335.78*附子水煎60 min組 344.67±9.60 82.77±11.97 491.41±339.49 848.10±501.04

3 討 論

明代張景岳把附子稱作“良將”，《傷寒論》中涉及到附子的條文共有37條，包含附子的方藥共就有20首，并被歷代醫(yī)家廣泛應(yīng)用，可見(jiàn)附子在治病救人方面表現(xiàn)出的重要性，其中在萬(wàn)方數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索到，在500張習(xí)用方子中，排名第9位［10］，附子的使用率為13.20%，可見(jiàn)其地位超然。但因附子毒性強(qiáng)烈，如有使用不當(dāng)又可置人于死地，所以說(shuō)附子當(dāng)之無(wú)愧為“最有效亦最難用的藥”［11］。由于附子有毒性，臨床不乏不良反應(yīng)的病例報(bào)道。如何避免附子的毒性反應(yīng)，是附子臨床應(yīng)用中需要足夠重視的問(wèn)題。炮制既可以使中藥的療效得以提高，使藥物的不良反應(yīng)消除或降低，又可以改變藥物的性味、功能和臨床療效［12］。生附子毒性劇烈，一般需經(jīng)過(guò)炮制后使用。附子的炮制方法有著悠久的歷史，每個(gè)朝代的炮制方法各不相同，其中漢代以炮、煨、炒、燒等炮制方法為主，而到了唐代以后，在原有基礎(chǔ)上增加了一些炮制方法，例如有蜜制、黑豆制、醋制、姜制、童便制、甘草制及多種輔料浸制、煮制、蒸制［13］。附子的煎煮時(shí)間也影響其毒性與藥效。附子的毒性作用主要是其中所含的生物堿——烏頭堿類所致，其主要毒性是抑制心臟傳導(dǎo)系統(tǒng)。但烏頭堿水溶性大，遇熱易被分解破壞，生附子經(jīng)鹽水浸泡、蒸熟，加工成熟附子后，不穩(wěn)定不耐熱的烏頭堿已大部分被分解破壞，不及生附子含量的20%［14］。通過(guò)煎煮以降低附子的毒性，目前常用的方法是久煎。根據(jù)HPLC結(jié)果可知，煎煮時(shí)間的延長(zhǎng)，使得3種毒性成分含量下降；小鼠急性毒性實(shí)驗(yàn)表明附子水煎時(shí)間越長(zhǎng)，小鼠的死亡率降低，其體質(zhì)量下降得越發(fā)不明顯。但水煎60 min的附子水煎液中雙酯型生物堿（新烏頭堿和次烏頭堿）仍舊存在；且在急性毒性實(shí)驗(yàn)中小鼠體質(zhì)量減輕，表明附子水煎60 min后毒性仍存在，對(duì)人的健康造成威脅。在煎煮過(guò)程中雙酯型生物堿先水解轉(zhuǎn)化為單酯型生物堿和水解型單酯型生物堿，然后進(jìn)一步水解成毒性可基本忽略的生物原堿（胺醇型生物堿）［15］。可見(jiàn)煎煮時(shí)間對(duì)酯型生物堿的含量有顯著影響，適度久煎可顯著降低雙酯型生物堿含量，增加單酯型生物堿含量，即解毒存效，但過(guò)度久煎可完全破壞雙酯型生物堿，也使單酯型生物堿含量下降，即藥理活性亦隨之減弱或消失［16］。本實(shí)驗(yàn)專注點(diǎn)在于煎煮時(shí)間對(duì)附子毒性的影響，只一味得延長(zhǎng)煎煮時(shí)間，苯甲酰類生物堿含量也會(huì)下降，其藥效也會(huì)大打折扣。應(yīng)當(dāng)在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中加入單酯這個(gè)考察因素，通過(guò)HPLC檢測(cè)其含量或者通過(guò)相關(guān)的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)來(lái)檢測(cè)藥效。

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