史東萍 李 強(qiáng)

（河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450000）

肺癌是目前全球發(fā)病率和病死率最高的惡性腫瘤之一，2012年全球肺癌新發(fā)病180萬(wàn)例，死亡160萬(wàn)例，分別占184個(gè)國(guó)家28種癌癥發(fā)病和死亡的13%和19.4%［1］。目前，化療在肺癌的治療中仍然發(fā)揮著重要的作用，然而耐藥問(wèn)題的存在嚴(yán)重影響了化療的效果［2］。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)針對(duì)化療耐藥缺乏有效的手段，中醫(yī)從整體出發(fā)，通過(guò)辨證論治認(rèn)識(shí)和改善化療耐藥，取得了較好的療效［3］。結(jié)合肺癌和化療耐藥的病機(jī)特點(diǎn)，臨床運(yùn)用益氣活血解毒法能夠有效抑制肺癌化療耐藥，增強(qiáng)化療藥物的療效。本研究觀察益氣活血解毒方對(duì)A549/DDP耐藥細(xì)胞株的抑制作用及細(xì)胞凋亡的影響，并通過(guò)JAK2-STAT3信號(hào)通路分子的變化探討益氣活血解毒方的作用機(jī)制?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與細(xì)胞株 SD大鼠，清潔級(jí)，體質(zhì)量（200±20） g，雌雄不限。 動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（豫）2010-0002。A549細(xì)胞、A549/DDP細(xì)胞株保存于河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室。

1.2 藥物與試劑 益氣活血解毒方由黨參、黃芪、丹參、川芎、水蛭、蜈蚣、全蝎、連翹、白花蛇舌草組成。藥物由河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院提供。MTT購(gòu)自Sigma公司；JAK2、STAT3單克隆抗體購(gòu)自CST公司；β-actin一抗、?？故蠖?、羊抗兔二抗購(gòu)自Santa Cruz公司；細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自BD公司；RNA提取試劑盒購(gòu)自TIANGEN公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自Vazyme公司；SYBR?Green I熒光定量PCR試劑盒購(gòu)自Qiagen公司。

1.3 益氣活血解毒方含藥血清制備 大鼠隨機(jī)分為益氣活血解毒方高劑量組、益氣活血解毒方中劑量組、益氣活血解毒方低劑量組和空白對(duì)照組，每組10只。按“動(dòng)物與人體的每千克體質(zhì)量劑量折算系數(shù)表”計(jì)算大鼠等效用藥劑量，分別給予益氣活血解毒方高、中、低劑量及等量0.9%氯化鈉注射液灌胃，每日2次，連續(xù)3 d，末次給藥1 h后采血，分離血清，并將含藥血清置于56℃水浴鍋中30 min滅活補(bǔ)體，0.22 μm抽濾除菌，-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 益氣活血解毒方含藥血清對(duì)A549/DDP細(xì)胞抑制作用比較 A549/DDP細(xì)胞培養(yǎng)于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中，細(xì)胞至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，消化收集細(xì)胞并種板，待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%融合后，無(wú)血清培養(yǎng)基同步化12 h，分別加入益氣活血解毒方高、中、低劑量血清和空白對(duì)照血清，不加細(xì)胞的培養(yǎng)基為空白組，繼續(xù)培養(yǎng)12、24、48、72 h 后，每孔加入 MTT 20 μL，4 h 后，DMSO 溶解，用酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm處各孔的吸光度（A）值。細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率（%）＝（實(shí)驗(yàn)組平均A值-空白組平均A值）/（對(duì)照組平均A值-空白組平均A值）×100%。

1.5 各組細(xì)胞凋亡率比較 采用Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒檢測(cè)各組細(xì)胞的凋亡情況。分別培養(yǎng)A549和A549/DDP細(xì)胞，根據(jù)細(xì)胞抑制實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分組：A549空白對(duì)照血清組（A549組）、A549/DDP空白對(duì)照血清組（A549/DDP組）、A549/DDP益氣活血解毒方最佳含藥血清組（益氣活血解毒方組），藥物干預(yù)48 h后，分別收集各組細(xì)胞（1×105），冷PBS洗滌2次，懸浮于200 μL上樣緩沖液中，分別加入5 μL AnnexinV-FITC和10 μL PI溶液，混勻后于室溫避光孵育15 min，再于流式管中再加入無(wú)菌的PBS緩沖液300 μL，流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)測(cè)得的結(jié)果用Flow Jo7.6軟件進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 各組細(xì)胞總蛋白中JAK2、STAT3的表達(dá)比較分別培養(yǎng)A549和A549/DDP細(xì)胞，分組同“1.5”項(xiàng)下方法。藥物干預(yù)48 h后，PBS洗2次，用RIPA裂解液裂解細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白。按照BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行蛋白定量。SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，脫脂奶粉封閉，一抗（JAK2、STAT3，內(nèi)參蛋白為βactin），4℃孵育過(guò)夜，二抗室溫孵育2 h，ECL孵育3～5 min，用數(shù)字化 Western Blot 掃膜儀（C-Digit，美國(guó)LI-COR）掃描采集膜上的蛋白條帶，利用Image J軟件分析計(jì)算各條帶的灰度值，以目的蛋白條帶灰度值與內(nèi)參蛋白（β-actin）條帶灰度值的比值表示目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.7 各組細(xì)胞JAK2、STAT3 mRNA表達(dá)比較 各組細(xì)胞JAK2、STAT3 mRNA的表達(dá)分別培養(yǎng)A549和A549/DDP細(xì)胞，分組同“1.5”項(xiàng)下方法。收集各組細(xì)胞，試劑盒提取細(xì)胞總RNA，核酸蛋白測(cè)定儀測(cè)定樣品RNA濃度和純度，參照試劑盒說(shuō)明書(shū)配置反轉(zhuǎn)錄體系，42℃30 min、85℃5 min進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。以反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA為模板，參照SYBR?Green Master Mix試劑盒說(shuō)明書(shū)配制熒光定量PCR反應(yīng)體系，35～40個(gè)循環(huán)。GAPDH作為內(nèi)參基因，利用2-△△Ct法分析各組目的基因的表達(dá)變化。GAPDH引物序列：上游5′-AAGACCTTGGGCTGGGACTG-3′，下游 5′-TGGCTCG GCTGGCGAC-3′，產(chǎn)物 168 bp。 JAK2 引物序列：上游5′-GGATGTGAGTGGGAGCTGAG-3′，下游 5′-CCTGC TTCTGAAACCCGGC-3′，產(chǎn)物 121 bp。 STAT3 引物序列： 上游 5′-CATCCTGAAGCTGACCCAGG-3′， 下游5′-AGGTCGTTGGTGTCACACAG-3′，產(chǎn)物 73 bp。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料用百分率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組含藥血清在不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)A549/DDP細(xì)胞的抑制率比較 見(jiàn)表1。隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，益氣活血解毒方含藥血清對(duì)A549/DDP細(xì)胞的抑制率整體上在48 h時(shí)達(dá)到高峰，與12、24 h抑制率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），至72 h各劑量組抑制率已呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。不同濃度含藥血清之間比較，高劑量組＞中劑量組＞低劑量組，考慮到有文獻(xiàn)報(bào)道［4-5］抑制率超過(guò)10%時(shí)不僅抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，同時(shí)也會(huì)影響正常細(xì)胞的代謝，因此 最終選擇中劑量含藥血清作用48 h為最佳濃度和時(shí)間點(diǎn)，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

表1 各組含藥血清在不同時(shí)間對(duì)A549/DDP的抑制率比較（%，±s）

表1 各組含藥血清在不同時(shí)間對(duì)A549/DDP的抑制率比較（%，±s）

與本組 12 h 比較，△P＜0.05；與本組 24 h 比較，▲P＜0.05。

組 別 n 12 h 24 h 48 h 72 h益氣活血解毒方高劑量組益氣活血解毒方中劑量組6.16±0.38 8.04±0.26 12.45±0.81△▲ 7.78±0.51 5.85±0.46 6.49±0.42 8.92±0.77△▲ 6.18±0.76益氣活血解毒方低劑量組4.70±0.16 5.28±0.33 6.51±0.25▲ 6.07±0.52

2.2 各組A549/DDP細(xì)胞凋亡情況比較 見(jiàn)表2。與A549組比較，A549/DDP組細(xì)胞凋亡率明顯下降；與A549/DDP組比較，益氣活血解毒方組A549/DDP細(xì)胞凋亡率顯著提高（P＜0.05）。

表2 各組細(xì)胞凋亡情況比較（%，±s）

表2 各組細(xì)胞凋亡情況比較（%，±s）

與 A549 組比較，△P＜0.05；與 A549/DDP 比較，▲P＜0.05。 下同。

組 別 n 早期凋亡細(xì)胞 晚期凋亡細(xì)胞 細(xì)胞凋亡率A549組 6 A549/DDP組 6 6.33±1.35 5.87±1.12 12.15±2.39 2.50±0.81 3.58±1.24 6.14±2.72△益氣活血解毒方組 65.65±1.46 9.02±2.55 14.70±3.76▲

2.3 各組細(xì)胞JAK2、STAT3蛋白表達(dá)比較 見(jiàn)表3、圖1。與A549細(xì)胞組比較，A549/DDP細(xì)胞組JAK2、STAT3蛋白表達(dá)明顯降低（P＜0.05），與A549/DDP組比較，益氣活血解毒方組A549/DDP細(xì)胞JAK2、STAT3蛋白表達(dá)明顯升高（P＜0.05）。

表3 各組細(xì)胞JAK2、STAT3蛋白表達(dá)比較（%，±s）

表3 各組細(xì)胞JAK2、STAT3蛋白表達(dá)比較（%，±s）

組 別 n JAK2相對(duì)表達(dá)量 STAT3相對(duì)表達(dá)量A549組 6 A549/DDP組 6 0.62±0.25 0.94±0.29 0.44±0.13△ 0.51±0.12△益氣活血解毒方組 60.78±0.15▲ 1.18±0.32▲

圖1 各組細(xì)胞JAK2、STAT3蛋白免疫印跡條帶圖

2.4 各組細(xì)胞JAK2、STAT3 mRNA表達(dá)比較 見(jiàn)表4。與 A549細(xì)胞組比較，A549/DDP細(xì)胞組 JAK2、STAT3 mRNA 表達(dá)明顯降低（P＜0.05），與 A549/DDP組比較，益氣活血解毒方組A549/DDP細(xì)胞JAK2、STAT3 mRNA 表達(dá)明顯升高（P＜0.05）。

表4 各組細(xì)胞JAK2、STAT3 mRNA表達(dá)比較（±s）

表4 各組細(xì)胞JAK2、STAT3 mRNA表達(dá)比較（±s）

組別 n GAPDH（Ct值）JAK2 STAT3 Ct值 △Ct值 2-△△Ct Ct值 △Ct值 2-△△Ct A549組 17.61±0.7623.84±0.85 6.22±1.42 22.22±0.59 4.61±1.29 A549/DDP組 18.70±0.83 27.16±0.78 8.47±1.24 0.21△ 25.29±0.71 6.60±1.14 0.25△益氣活血解毒方組 17.18±0.64 23.96±0.62 6.80±0.78 3.21▲ 21.40±0.54 4.23±1.03 5.18▲

3 討 論

化療耐藥是限制目前腫瘤治療眾多化療方案療效的基本問(wèn)題，化療耐藥的機(jī)制主要包括促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的藥物外排、增強(qiáng)化療導(dǎo)致的損傷修復(fù)、調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡信號(hào)通路抑制腫瘤細(xì)胞凋亡等［6］。增殖和凋亡調(diào)節(jié)失控是化療耐藥發(fā)生的重要機(jī)制，促凋亡基因的缺失或抗凋亡基因的過(guò)度表達(dá)多會(huì)導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物產(chǎn)生耐藥性［7］。JAK2/STAT3通路是人體內(nèi)生理與病理反應(yīng)的一條重要信號(hào)途徑，是多種惡性腫瘤發(fā)生的關(guān)鍵因素，參與了腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、分化、發(fā)育及轉(zhuǎn)移過(guò)程［8-9］。 大量研究證實(shí)，JAK2/STAT3 在肺癌、卵巢癌、腎癌、慢性粒細(xì)胞白血病、骨髓瘤等疾病中持續(xù)異常高表達(dá)，能夠激活轉(zhuǎn)錄Bcl-2、Bcl-x1等凋亡基因，從而調(diào)控細(xì)胞的凋亡［10-11］。

中藥因其低毒高效和多階段性作用的優(yōu)勢(shì)已在腫瘤多藥耐藥逆轉(zhuǎn)的研究中逐步受到重視［12-13］。中藥對(duì)于NSCLC化療耐藥干預(yù)主要是通過(guò)減少化療藥物的外排，抑制細(xì)胞核屏蔽功能 、減少藥物的代謝，調(diào)整凋亡失衡等方面［14］實(shí)現(xiàn)的。劉亞莉等研究發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)中益氣湯含藥血清能使通過(guò)降低Bad、NF-κB表達(dá)、提高Caspase-9表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn) A549/DDP細(xì)胞的凋亡［15］。徐立群等發(fā)現(xiàn)，參慈膠囊能升高A549/DDP荷瘤裸鼠肺癌組織DKK-3 mRNA表達(dá)，降低β-catenin、Cyclin-D1 mRNA表達(dá)，通過(guò)影響wnt/β-catenin信號(hào)通路相關(guān)基因的表達(dá)，可能是參慈膠囊逆轉(zhuǎn)人肺腺癌A549/DDP裸鼠體內(nèi)順鉑耐藥的作用機(jī)制之一［16］。

益氣活血解毒方由黨參、黃芪、丹參、川芎、水蛭、蜈蚣、全蝎、連翹、白花蛇舌草組成，具有益氣活血、解毒通絡(luò)的功效。本研究顯示，不同劑量益氣活血解毒方含藥血清作用后，A549/DDP的增殖均受到不同程度的抑制，在干預(yù)48 h時(shí)抑制率達(dá)到最大；通過(guò)對(duì)細(xì)胞凋亡的觀察發(fā)現(xiàn)，A549/DDP細(xì)胞凋亡率相對(duì)于A549下降，而益氣活血解毒方能明顯促進(jìn)A549/DDP的凋亡，這說(shuō)明益氣活血解毒方可能通過(guò)抑制細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡干預(yù)肺癌化療耐藥。進(jìn)一步探討其作用機(jī)制發(fā)現(xiàn)，與A549細(xì)胞組比較，A549/DDP細(xì)胞組JAK2、STAT3蛋白及mRNA表達(dá)明顯降低，與對(duì)照血清組比較，益氣活血解毒方最佳含藥血清組A549/DDP細(xì)胞JAK2、STAT3蛋白及mRNA表達(dá)明顯升高。這提示益氣活血解毒方干預(yù)肺癌化療耐藥的作用可能與調(diào)節(jié)JAK2-STAT3信號(hào)通路，促進(jìn)細(xì)胞凋亡實(shí)現(xiàn)的。

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