桑 鋒 李 強(qiáng) 錢潔玉 李 杰 劉 真岳靜宇 沈俊嶺 鄧博文 李承乘 徐立然△

（1.河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450000；2河南省病毒性疾病中醫(yī)藥防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450000）

艾滋病患者腸道屏障功能嚴(yán)重受損，HIV感染使機(jī)體免疫功能過度激活，免疫細(xì)胞大量釋放腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、γ-干擾素（IFN-γ）等細(xì)胞因子，進(jìn)而損傷腸道屏障功能，腸腔內(nèi)的細(xì)菌及內(nèi)毒素通過腸壁進(jìn)入淋巴、血液及遠(yuǎn)隔器官，引起機(jī)體感染及損傷。因此，HIV在腸黏膜大量復(fù)制，損傷腸黏膜上皮屏障，導(dǎo)致腸道微生物易位，是全身免疫異常激活的重要原因［1-2］。益艾康膠囊是治療艾滋病的臨床經(jīng)驗(yàn)復(fù)方，臨床療效肯定，尤其是減少腹瀉等HIV/AIDS患者機(jī)會性感染發(fā)生頻次，提高患者生存質(zhì)量，降低病死率。本實(shí)驗(yàn)利用IFN-γ刺激Caco-2腸黏膜屏障體外模型模擬體內(nèi)HIV損傷腸黏膜的病理過程，觀察益艾康干預(yù)后，腸黏膜屏障的通透性和完整性的改變，探討益艾康膠囊對腸黏膜的保護(hù)作用?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 SPF級Wistar雌性大鼠30只，體質(zhì)量（230±20）g，由河南省實(shí)驗(yàn)動物中心提供，許可證號：SCXK（豫）2010-0002，飼養(yǎng)環(huán)境溫度 20～25 ℃，相對濕度50%～65%。

1.2 試藥與儀器 1）試藥。Caco-2細(xì)胞：購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所。DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清：Hyclone，Thermo 公司（美國）。 噻唑藍(lán)（MTT）：Sigma公司（美國）。 熒光素鈉（粉劑）：Sigma公司（美國）。益艾康膠囊：河南省中醫(yī)藥研究院提供，制劑批號：Lz05002。IFN-γ：Sigma公司（美國）。 兔抗 ZO-1多克隆抗體、小鼠抗β-Actin單克隆抗體、?？剐∈驣gG二抗、山羊抗兔IgG二抗：Santa Cruz公司（美國）。2）儀器。CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱：Termo 3111，美國。超凈工作臺：DL-CJ-2ND，哈爾濱東聯(lián)。倒置熒光相差顯微鏡：Olympus CKX41-A32PH，日本。臺式低速離心機(jī)：TD24-WS，長沙湘儀。電阻測定儀：Millipore Millicell-ERS，美國。酶標(biāo)儀：BD 680，美國。

1.3 腸黏膜單層屏障模型的構(gòu)建 Caco-2細(xì)胞接種在24孔Transwell培養(yǎng)板（0.4 μm孔徑，0.65 cm直徑）中，接種密度為 5×104個(gè)/cm2，每孔 200 μL，基底側(cè)加入培養(yǎng)液800 μL，接種24 h后更換培養(yǎng)液，接下來1周隔天換液，1周后每日換液。細(xì)胞培養(yǎng)21 d后待用。

1.4 益艾康含藥血清的制備 SPF級Wistar雌性大鼠隨機(jī)分為空白對照組和益艾康組。益艾康組給藥劑量按照正常成人臨床等效劑量折算，大鼠灌服2.08 g/kg，空白組給予等量蒸餾水。每日2次，連續(xù)4 d。末次灌胃1 h后腹主動脈取血。分離血清，56℃滅活30 min，0.22 μm微孔濾膜過濾除菌后，分裝，-80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 不同濃度益艾康含藥血清對Caco-2細(xì)胞活性和增殖的影響 取對數(shù)生長期Caco-2細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板，細(xì)胞分為實(shí)驗(yàn)組和空白對照組，實(shí)驗(yàn)組分別加入含不同濃度益艾康含藥血清的培養(yǎng)基（5%、10%、15%、20%，用空白鼠血清將各含藥血清組按照最大濃度含藥血清組所含血清量補(bǔ)足），空白對照孔加入空白鼠血清。分別培養(yǎng) 12、24、48、72 h 后，MTT 法檢測各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的增殖率。

1.6 益艾康含藥血清對Caco-2單層細(xì)胞跨細(xì)胞電阻（TEER）的影響 細(xì)胞Caco-2細(xì)胞形成單層屏障后，用IFN-γ、益艾康含藥血清進(jìn)行干預(yù)并分組：空白對照組（空白鼠血清）、IFN-γ 組（模型組）、益艾康組、IFN-γ+益艾康組，每組3個(gè)復(fù)孔，設(shè)3個(gè)時(shí)相點(diǎn)：24 h、48 h、72 h。用電阻儀測量各組單層細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)的跨膜電阻值。

1.7 益艾康含藥血清對Caco-2單層細(xì)胞熒光素鈉滲漏量的影響 分組方法同“1.6”項(xiàng)下方法。在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)吸棄培養(yǎng)板內(nèi)培養(yǎng)液，在腔側(cè)加入熒光素鈉（用Hanks液配制質(zhì)量濃度為2 g/L）200 μL，基底側(cè)加入Hanks液 800 μL，培養(yǎng) 2 h 后分別取樣 100 μL，在激發(fā)波長427 nm，發(fā)射波長536 nm的條件下，檢測熒光強(qiáng)度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算熒光素鈉在基底側(cè)轉(zhuǎn)運(yùn)液的濃度及滲透系數(shù)，熒光素鈉滲漏率=基底側(cè)熒光素鈉漏出量/腔側(cè)熒光素鈉加入量×100%。

1.8 Western blot檢測各組細(xì)胞總蛋白中ZO-1的表達(dá)變化 用細(xì)胞刮刮下Transwell腔側(cè)的Caco-2單層細(xì)胞，PBS洗2次，RIPA裂解液裂解細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白。按照BCA蛋白濃度測定試劑盒說明書進(jìn)行蛋白定量。SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，脫脂奶粉封閉，一抗（ZO-1）4℃孵育過夜，二抗室溫孵育1 h，ECL孵育3～5 min，暗室曝光、顯影、定影。掃描X光片上的蛋白條帶，利用軟件分析計(jì)算各條帶的灰度值，以目的蛋白條帶灰度值與內(nèi)參蛋白（β-actin）條帶灰度值的比值表示目的蛋白的相對表達(dá)量。

1.9 Real time PCR檢測各組細(xì)胞ZO-1 mRNA的表達(dá)變化 收集Transwell腔側(cè)的Caco-2單層細(xì)胞，PBS洗2次。試劑盒提取細(xì)胞總RNA，核酸蛋白測定儀測定樣品RNA濃度和純度，參照試劑盒說明書配置反轉(zhuǎn)錄體系，42℃30 min、85℃ 5 min進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。GAPDH序列：上游 5′-AAGACCTTGGGCTGGGACTG-′3，下游 5′-TGGCTCGGCTGGCGAC-3′，產(chǎn)物 168 bp。ZO-1 序列：上游 5′-TTATTTGGGCTGTGGCGTGA-3′，下游 5′-AA TCCAGGAGCCCTGTGAAG-3′，產(chǎn)物 184 bp。 以反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA為模板，參照SYBR?Green Master Mix試劑盒說明書配制熒光定量PCR反應(yīng)體系，35～40個(gè)循環(huán)。GAPDH作為內(nèi)參基因，利用2-△△Ct法分析各組目的基因的表達(dá)變化。2-△△Ct≥2，組間比較目的基因表達(dá)明顯增高；2-△△Ct≤0.5，組間比較目的基因表達(dá)明顯降低。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料用百分率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 不同濃度益艾康含藥血清對Caco-2細(xì)胞增殖活性的比較 見表1。與空白對照組比較，5%、10%益艾康含藥血清能不同程度的促進(jìn)Caco-2的增殖活性，以10%含藥血清最為明顯；15%、20%益艾康含藥血清在短時(shí)間能促進(jìn)Caco-2的增殖，隨時(shí)間延長其增殖能力下降。因此本研究后續(xù)實(shí)驗(yàn)以10%含藥血清濃度為最佳干預(yù)濃度。

表1 不同濃度益艾康含藥血清對Caco-2細(xì)胞增殖活性的比較（%，±s）

表1 不同濃度益艾康含藥血清對Caco-2細(xì)胞增殖活性的比較（%，±s）

與10%含藥血清組48 h比較，△P＜0.05；與本組24 h比較，▲P＜0.05。

組 別12 h 24 h 48 h 72 h 5%含藥血清組10%含藥血清組15%含藥血清組3.22±0.24 6.14±0.41 11.54±0.79△▲ 12.06±2.44 3.75±0.27 9.73±0.38 18.66±1.32▲ 13.69±1.89 5.76±0.38 13.19±1.13 11.78±1.27△ 8.11±1.76 20%含藥血清組7.24±0.36 15.34±1.45 11.28±1.73△ 7.37±2.23

2.2 各組細(xì)胞腸黏膜屏障TEER變化比較 見表2。與空白對照組相比，IFN-γ干預(yù)不同時(shí)間點(diǎn)TEER值均有所降低，48 h降低最為顯著（P＜0.05），與 IFN-γ組相比，益艾康在不同時(shí)間點(diǎn)均能提高模型組Caco-2細(xì)胞單層TEER值。

表2 各組細(xì)胞腸黏膜屏障TEER變化比較（%，±s）

表2 各組細(xì)胞腸黏膜屏障TEER變化比較（%，±s）

與空白對照組比較，△P＜0.05；與 IFN-γ 組比較，▲P＜0.05。 下同。

組 別24 h 48 h 72 h空白對照組IFN-γ組益艾康組537±89 529±53 562±73 462±52 275±35△ 312±173 558±72 539±82▲ 573±64 IFN-γ+益艾康組484±64 393±87▲ 488±66

2.3 各組細(xì)胞腸黏膜屏障通透性比較 見表3。結(jié)果顯示，IFN-γ干預(yù)不同時(shí)間后，熒光素鈉滲漏量均有不同程度的增加，48 h后增加已非常明顯，與空白對照比較，差異顯著（P＜0.05）；與 IFN-γ 組相比，益艾康能明顯降低熒光素鈉的滲漏量（P＜0.05）。

表3 各組細(xì)胞熒光素鈉透過率比較（%，±s）

表3 各組細(xì)胞熒光素鈉透過率比較（%，±s）

組 別24 h 48 h 72 h空白對照組IFN-γ組益艾康組12.02±1.03 15.24±1.03 20.17±1.03 15.25±1.28 36.88±2.37△ 55.70±3.38△12.21±0.78 14.68±2.43▲ 23.21±1.32▲IFN-γ+益艾康組14.13±0.96 22.25±1.64▲ 36.48±3.76▲

2.4 各組細(xì)胞ZO-1蛋白表達(dá)變化比較 見圖1，表4。與空白對照組相比，IFN-γ干預(yù)后，ZO-1蛋白表達(dá)量顯著降低（P＜0.05）；益艾康能明顯提高 ZO-1蛋白的表達(dá)，與IFN-γ組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖1 各組細(xì)胞緊密連接蛋白ZO-1的表達(dá)

表4 各組細(xì)胞細(xì)胞ZO-1蛋白表達(dá)比較（±s）

表4 各組細(xì)胞細(xì)胞ZO-1蛋白表達(dá)比較（±s）

組 別ZO-1相對表達(dá)量空白對照組IFN-γ組益艾康組1.14±0.25 0.45±0.13△1.07±0.21▲IFN-γ+益艾康組0.94±0.27▲

2.5 各組細(xì)胞ZO-1 mRNA表達(dá)變化比較 見表5。IFN-γ組ZO-1 mRNA相對表達(dá)量明顯低于空白對照組，益艾康組ZO-1 mRNA相對表達(dá)量明顯高于IFN-γ組。

表5 各組細(xì)胞ZO-1 mRNA表達(dá)比較（%，±s）

表5 各組細(xì)胞ZO-1 mRNA表達(dá)比較（%，±s）

組別 GAPD（Ct值）ZO-1 Ct值 △Ct值 2-△△Ct空白對照組 15.88±1.73 19.78±1.48 3.90±1.76 IFN-γ 組 15.97±2.65 23.59±2.16 7.62±1.48 0.08△益艾康組 16.73±1.91 22.51±2.80 5.78±1.17 3.58▲IFN-γ+益艾康組 15.57±1.70 20.07±3.74 4.50±0.68 8.69▲

3 討 論

胃腸道黏膜病變是HIV感染的一個(gè)代表性特征。超過85%的艾滋病毒感染是通過黏膜傳輸進(jìn)行，在HIV感染的所有階段均存在定量和定性的黏膜免疫感染。腸道是HIV復(fù)制的主要場所，HIV感染的主要特點(diǎn)是胃腸道固有層中CCR5+記憶CD4+T細(xì)胞的大量丟失［3-4］。這種損失歸因于HIV對細(xì)胞的直接殺傷作用和未感染細(xì)胞的凋亡作用。而腸道內(nèi)CD4+T細(xì)胞的損耗意味著免疫功能異常和腸道上皮完整性的破壞，進(jìn)而導(dǎo)致微生物易位增加、免疫激活和疾病的進(jìn)展［5-6］。此外，派氏淋巴小結(jié)及固有層CD4+T細(xì)胞的消耗使產(chǎn)生分泌型IgA和防御素的能力降低，使腸道微生物持續(xù)過度生長，微生物易位導(dǎo)致血漿中脂多糖（LPS）和16S rRNA水平增加，進(jìn)而可以引起慢性局部和全身性免疫激活的發(fā)展，最終使病情惡化［7-9］。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，脾胃為人體后天之本，是氣血生化之源，臟腑經(jīng)絡(luò)之樞。“脾旺四季不受邪”“內(nèi)傷脾胃，百病由生”。徐立然等提出艾滋病中醫(yī)“脾為樞機(jī)”的觀點(diǎn)，認(rèn)為艾滋病的病因?yàn)椤耙叨尽眱?nèi)侵，經(jīng)血液、黏膜或胚胎而侵入體內(nèi)，首先損傷脾臟，脾虛是其發(fā)病的重要環(huán)節(jié)，更是貫穿艾滋病發(fā)病全過程的基本病機(jī)［10-13］。中醫(yī)脾胃系統(tǒng)的功能與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為胃腸道具有消化吸收、能量代謝、黏膜屏障和免疫防御等生理功能基本一致?！鹅`樞·五癃律液別》“脾為之衛(wèi)”更可以看做是對腸道屏障功能的高度概括。

益艾康膠囊是1996年河南省艾滋病治療專家到艾滋病高發(fā)區(qū)巡診后擬定的臨床經(jīng)驗(yàn)方，臨床療效肯定，經(jīng)過10余年的臨床應(yīng)用及研究初步證實(shí)益艾康膠囊能夠改善HIV/AIDS患者臨床癥狀、體征，尤其是減少HIV/AIDS患者機(jī)會性感染發(fā)生頻次，提高患者生存質(zhì)量，降低病死率［14-16］。本研究結(jié)果顯示，用10%的益艾康含藥血清處理后，Caco-2細(xì)胞單層TEER值明顯高于IFN-γ組，熒光素鈉的滲漏量明顯降低。這些均提示，益艾康能降低IFN-γ引起的腸黏膜屏障的通透性增加，維持腸黏膜屏障的完整性，益艾康對IFN-γ引起的腸黏膜屏障體外模型的損傷有一定的保護(hù)作用。對HIV/AIDS腸黏膜屏障的保護(hù)作用可能是益艾康改善機(jī)體免疫狀態(tài)、降低機(jī)會性感染發(fā)生頻率的重要機(jī)制。細(xì)胞間緊密連接是構(gòu)成腸黏膜機(jī)械屏障、維持腸黏膜完整性的主要結(jié)構(gòu)，ZO-1是最早發(fā)現(xiàn)的緊密連接的重要成分之一，其表達(dá)量的變化能夠影響正常腸黏膜結(jié)構(gòu)的完整性。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，IFN-γ干預(yù)后，腸黏膜屏障ZO-1表達(dá)量明顯降低，而益艾康含藥血清能明顯抑制這種變化的發(fā)生，益艾康與IFN-γ共同干預(yù)腸黏膜屏障后，與單純IFN-γ組相比，Caco-2單層屏障細(xì)胞中ZO-1的表達(dá)量顯著升高。這提示，益艾康保護(hù)腸黏膜的機(jī)制可能與增加緊密連接蛋白ZO-1的表達(dá)從而維持腸黏膜細(xì)胞之間緊密連接結(jié)構(gòu)的完整性有關(guān)。

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