周 靜 李 敏 金偉鋒 李曉紅 韓 進(jìn) 張宇燕

（浙江中醫(yī)藥大學(xué)，浙江 杭州 310053）

黃芩為唇形科黃芩Scutellaria baicalensis Georgi的干燥根，具有清熱燥濕、瀉火解毒、止血、安胎等功效［1］，臨床主要用于濕溫、暑濕，胸悶嘔惡，濕熱痞滿，瀉痢，黃疸，肺熱咳嗽，高熱煩渴，血熱吐衄，癰腫瘡毒，胎動(dòng)不安，在醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域應(yīng)用十分廣泛。黃芩主要含黃酮類、酚酸類、氨基酸、多糖、微量元素等［2-4］，其中黃酮及其苷類是其最主要的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，已鑒定出結(jié)構(gòu)的超過40余種，主要為黃芩苷、黃芩素、漢黃芩苷、漢黃芩素等。近來大量研究顯示，黃芩及其黃酮類化合物具有抗菌抗病毒、抗氧化、清除氧自由基、抗炎、抗腫瘤、解熱、鎮(zhèn)痛、保護(hù)心腦血管及神經(jīng)元、保肝等多種藥理作用［5-6］。如黃芩總黃酮苷元對(duì)肝臟、肺具有明顯的保護(hù)作用［7-10］；黃芩素可明顯抑制模型小鼠耳廓的腫脹，具有體內(nèi)抗炎作用［11］；黃芩素靜脈注射可降低氧化應(yīng)激反應(yīng)和心肌的炎癥反應(yīng)，改善內(nèi)毒素休克大鼠心肌的收縮能力［12］；黃芩苷可通過調(diào)節(jié)Foxp3的表達(dá)，促進(jìn)Treg細(xì)胞功能，還可以通過脂質(zhì)調(diào)節(jié)及免疫調(diào)節(jié)來改善動(dòng)脈粥樣硬化的病變進(jìn)展［13］；黃芩苷因能減少Fas蛋白和FasL蛋白表達(dá)，而對(duì)新生缺氧缺血性腦損傷（HIBD）小鼠的神經(jīng)元具有一定保護(hù)作用［14］；黃芩苷具有抗抑郁的作用，上調(diào)AMPA受體的表達(dá)，抑制抑郁模型大鼠神經(jīng)元凋亡［15］。黃芩苷對(duì)CoCl2誘導(dǎo)的SHSY-5y細(xì)胞損傷具有明顯的保護(hù)作用，可能因黃芩苷具有抗氧化作用，從而減少了細(xì)胞的損傷［16］。

配伍組方是中醫(yī)用藥特色，黃芩、黃連在臨床常配伍使用，取得較好的臨床療效，實(shí)驗(yàn)研究也證明，兩者配伍表現(xiàn)相須相使作用［17-19］。本實(shí)驗(yàn)主要開展影響黃芩黃酮提取的因素分析，可為黃芩的制劑工藝、資源開發(fā)等提供參考，并在此基礎(chǔ)上，以黃酮類為代表成分，觀察黃芩黃連不同比例配伍后對(duì)黃酮溶出的影響，從化學(xué)成分的角度探討黃芩與黃連的中醫(yī)藥配伍規(guī)律。

1 材 料

黃芩、黃連藥材購于胡慶余堂，均符合2015年版《中華人民共和國藥典（一部）》［1］黃芩、黃連項(xiàng)下的要求。蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（100080-200306），中國藥品生物制品檢定所。其余均為分析純。DGG-9140電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；ARA520電子天平，美國奧豪斯Ohaus；TM-1900雙光束紫外可見分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取蘆丁對(duì)照品4.8 mg，用75%的乙醇溶解，搖勻，定容到25 mL的容量瓶中，即得質(zhì)量濃度為0.192 mg/mL的對(duì)照品溶液。

2.2 供試品溶液的制備

精密吸取各試驗(yàn)的樣品液1mL置于25 mL容量瓶中，加75%乙醇稀釋至刻度，再吸取1 mL置于10 mL容量瓶加75%乙醇稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。

2.3 最大吸收波長的選擇

精密吸取蘆丁對(duì)照品溶液2 mL，置25 mL容量瓶中，加5%NaNO2溶液1.0 mL，搖勻，放置6 min，加10%Al（NO3）3溶液 1.0 mL，搖勻，放置 6 min，加 4%NaOH溶液10.0 mL，搖勻，用75%乙醇定容至25 mL，搖勻，放置 15 min，以相應(yīng)的試劑為空白，于 200～700 nm波長處掃描，結(jié)果在507 nm處有最大吸收。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

精密吸取對(duì)照品溶液 1、2、3、4、5、6、7 mL，置 25 mL量瓶中，5%NaNO2溶液 1.0 mL，搖勻，放置 6 min，加10%Al（NO3）3溶液 1.0 mL，搖勻，放置 6 min，加入 4%NaOH溶液10.0 mL，然后加75%乙醇溶液至刻度，在測定波長處測定吸收度。分別以吸收度為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，繪制得到標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.0139x+0.0651（R2=0.9993），表明蘆丁在 7.68～53.76 μg/mL 范圍內(nèi)與吸光度呈良好的線性關(guān)系。

2.5 精密度試驗(yàn)

精密吸取對(duì)照品溶液1 mL，按“2.4”項(xiàng)下標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作操作測定6次，計(jì)算蘆丁吸光度RSD=0.18%。表明其精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密吸取同一供試品溶液，6 h內(nèi)每隔1 h測定1次，計(jì)算=0.45%。顯示其穩(wěn)定性良好。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取同批樣品6份，按“2.2”項(xiàng)下供試品溶液及“2.4”項(xiàng)下“標(biāo)準(zhǔn)曲線制備”的方法操作測定，計(jì)算黃酮含量，結(jié)果RSD=1.52%。

2.8 回收率試驗(yàn)

取已知含量的黃芩，精密加入蘆丁對(duì)照品適量，按“2.2”項(xiàng)下供試品溶液的制備和“2.4”項(xiàng)下標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作操作測定吸收度，計(jì)算黃酮的平均回收率為98.52%，RSD=0.55%。

2.9 不同提取因素對(duì)黃芩黃酮含量的影響

2.9.1 不同加水量對(duì)黃酮提取的影響 取黃芩5g，分別加 6、8、10、12、14、16 倍體積的水煎煮 60 min 后，過濾，濾液定容至25 mL。按照“標(biāo)準(zhǔn)曲線制備”方法測定總黃酮含量。結(jié)果見圖1，隨溶劑體積增大，黃酮的質(zhì)量濃度即溶出逐漸增加，當(dāng)10倍體積時(shí)提取質(zhì)量濃度最高，隨后逐漸降低。

圖1 不同加水量對(duì)黃酮質(zhì)量濃度的影響

2.9.2 不同顆粒大小對(duì)黃酮提取的影響 取5 g黃芩最粗粉、粗粉、中粉、細(xì)粉，分別加10倍體積的水煎煮60 min后，過濾，濾液定容至25 mL。按照“標(biāo)準(zhǔn)曲線制備”方法測定總黃酮含量。結(jié)果見圖2，隨著粒度減小，黃酮溶出逐漸增加，其中細(xì)粉黃酮溶出質(zhì)量濃度最高。

圖2 不同顆粒大小對(duì)黃酮質(zhì)量濃度的影響

2.9.3 不同提取時(shí)間對(duì)黃酮提取的影響 取5 g黃芩，加 10 倍體積的水，分別煎煮 5、10、15、30、45、60、75、90、105、120 min 后過濾，濾液定容至 25 mL。 按照“標(biāo)準(zhǔn)曲線制備”方法測定總黃酮含量。結(jié)果見圖3，隨著提取時(shí)間，黃酮逐漸溶出，當(dāng)45～60 min到達(dá)最高，而后基本不再大量增加。

圖3 不同提取時(shí)間對(duì)黃酮質(zhì)量濃度的影響

2.9.4 不同提取次數(shù)對(duì)黃酮提取的影響 取5 g黃芩，每次加10倍體積的水，分別煎煮1次、2次、3次、4次、5次后過濾，濾液定容至25 mL。按照標(biāo)準(zhǔn)曲線制備方法測定總黃酮含量。結(jié)果見圖4，當(dāng)提取2次時(shí)所測的黃酮含量最高，隨著提取次數(shù)的增多，黃酮質(zhì)量濃度并沒有增加，反而降低了。

圖4 不同的提取次數(shù)對(duì)黃酮質(zhì)量濃度的影響

2.10 黃芩與黃連不同比例配伍后對(duì)黃酮溶出的動(dòng)態(tài)影響

取黃芩與黃連以 1∶1（黃芩 5 g、黃連 5 g）、1∶2（黃芩 5 g、黃連 10 g）、1∶3（黃芩 5 g、黃連 15 g）、2∶1（黃芩10 g、黃連 5 g）、3∶1（黃芩 15 g、黃連 5 g）等不同的比例配伍，分別加 10 倍體積的水，在煎煮 15、30、45、60、75、90 min等不同時(shí)間點(diǎn)，按照“標(biāo)準(zhǔn)曲線制備”方法測定總黃酮含量。結(jié)果見表1及圖5，黃芩與黃連不同比例配伍后，黃酮溶出的速率受到明顯的影響，溶出規(guī)律也不盡相同：當(dāng)1∶1（黃芩與黃連）配伍時(shí)，分別在30、80 min有最大溶出，2∶1配伍時(shí)，在30 min有較大溶出，3∶1配伍時(shí)，在30 min開始有較大溶出，隨后均保持一定水平，1∶2配伍時(shí)，在 30 min有較大溶出，1∶3配伍時(shí)，黃酮溶出均比較高，且在90 min達(dá)到較高的濃度 24.022 μg/mL。

表1 黃芩與黃連不同比例配伍后對(duì)黃酮溶出的動(dòng)態(tài)影響

圖5 黃芩與黃連不同比例配伍后對(duì)黃酮溶出的動(dòng)態(tài)影響

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)加水量、顆粒大小、提取時(shí)間、提取次數(shù)等因素的考察，結(jié)果表明這4個(gè)因素對(duì)黃芩的主要有效成分黃酮類化合物的溶出均具有明顯的影響，在此基礎(chǔ)上，選出各自最佳條件為：加水量為10倍體積，顆粒大小為細(xì)粉，提取時(shí)間為60 min，提取2次。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在含黃芩的制劑工藝、資源開發(fā)等方面應(yīng)充分考慮這些因素。

黃酮是黃芩的主要有效成分之一，具有較強(qiáng)的藥理作用，本實(shí)驗(yàn)在研究影響黃芩黃酮提取因素的基礎(chǔ)上，觀察了與不同比例的黃芪配伍后對(duì)總黃酮溶出的影響，以黃酮類成分為考察指標(biāo)，探討中醫(yī)藥配伍對(duì)成分的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，黃芩與黃連不同比例配伍后對(duì)黃酮溶出的動(dòng)態(tài)影響比較明顯，且當(dāng)黃芩與黃連3∶1配伍時(shí)，黃酮溶出最高，表明中藥不同比例配伍對(duì)成分的溶出具有明顯的影響，從而在臨床表現(xiàn)出不同的治療效果。

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