江 飚，王 晶，羅恒利，陳 佳，李國清，李安興

( 1.中山大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，廣東 廣州 510275； 2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 獸醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510642；3.寧德富發(fā)水產(chǎn)有限公司，福建 寧德 352002 )

刺激隱核蟲(Crytocaryonirritans)寄生于熱帶、亞熱帶海水硬骨魚類的皮膚、鰭、鰓、眼角膜等處，形成大量小白點(diǎn)，可造成魚的鰓和皮膚損傷及功能障礙[1-2]。其生活史包括4個(gè)階段：滋養(yǎng)體、包囊前體、包囊和幼蟲。在水溫24～27 ℃時(shí)，滋養(yǎng)體生長期為3～7 d，成熟后脫離宿主，形成包囊前體；包囊前體沉于水底后黏附于附著物上，逐漸形成厚的囊壁進(jìn)入包囊階段；包囊經(jīng)歷一系列的不對稱二分裂，每個(gè)包囊可分裂成200～300個(gè)子代幼蟲；發(fā)育成熟的幼蟲從包囊逸出，在水中快速游動(dòng)，尋找和感染宿主進(jìn)入下一個(gè)生活周期[2-3]。刺激隱核蟲世代周期短，繁殖率高，大規(guī)模爆發(fā)時(shí)可導(dǎo)致海水養(yǎng)殖魚類的大量死亡，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[4]。

大黃魚 (Pseudosciaenacrocea) 是我國東南沿海海域主要的經(jīng)濟(jì)養(yǎng)殖魚類[5-6]，近年來隨著海水漁業(yè)集約化程度和養(yǎng)殖面積的提高，海區(qū)的養(yǎng)殖密度增大，造成大黃魚刺激隱核蟲病頻發(fā)，給大黃魚養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展帶來很大的困擾[7]。目前，在大水體的開放型養(yǎng)殖漁場中，暫無有效防治刺激隱核蟲病的方法，而在小范圍養(yǎng)殖中，多采用物理和化學(xué)方法防治刺激隱核蟲病，如用淡水浸泡、輪換養(yǎng)殖、紫外線、臭氧、化學(xué)藥物等方法處理養(yǎng)殖水體中的寄生蟲進(jìn)行防治[8-11]。利用免疫方法預(yù)防刺激隱核蟲病是一個(gè)理想的方法，可以使魚獲得較好的免疫保護(hù)，但因?yàn)橐呙缢玫挠紫x不能體外培養(yǎng)，難以大量獲得，這種方法現(xiàn)在還難以大規(guī)模應(yīng)用[12]。基于成本和治療效果，室內(nèi)大黃魚育種和暫養(yǎng)過程中爆發(fā)刺激隱核蟲病，主要通過福爾馬林浸泡治療。

福爾馬林具有防腐殺菌性能，其發(fā)揮作用主要通過與蛋白質(zhì)的氨基結(jié)合而使蛋白凝固[13]。在水產(chǎn)養(yǎng)殖系統(tǒng)中，福爾馬林因能夠通過水生生物代謝，保持低生物累積，常用于水體消毒和治療一些魚類的疾病[14-15]。然而使用福爾馬林不合理不僅不能有效控制刺激隱核蟲病還會帶來諸多的副作用，如使用福爾馬林后魚的病程暫時(shí)得到控制，但易在7～14 d二次爆發(fā)；福爾馬林會降低水中的溶解氧，導(dǎo)致魚缺氧死亡[16]；Buchmann等[17]研究發(fā)現(xiàn)福爾馬林會抑制虹鱒(Oncorhynchusmykiss)分泌黏液，使其更易遭受水霉和細(xì)菌的繼發(fā)性感染；此外，過量使用福爾馬林可能會影響水產(chǎn)品的進(jìn)出口貿(mào)易[18]。因此，在安全有效的殺蟲藥物出現(xiàn)之前，研究如何科學(xué)合理的使用福爾馬林，減少其對水生生物的副作用具有重要意義。筆者對刺激隱核蟲和大黃魚幼魚進(jìn)行不同時(shí)間、不同質(zhì)量濃度福爾馬林的藥浴處理，研究了福爾馬林的毒性作用，并根據(jù)刺激隱核蟲生活史規(guī)律，采用不同質(zhì)量濃度的福爾馬林對感染刺激隱核蟲的大黃魚進(jìn)行藥浴治療試驗(yàn)，探討使用福爾馬林的最佳用量和時(shí)間，以期為大黃魚室內(nèi)養(yǎng)殖過程中能夠合理使用福爾馬林防治刺激隱核蟲病提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)藥物和刺激隱核蟲

福爾馬林：分析純，37%～40%甲醛(浙江巨化集團(tuán)公司試劑廠)。

刺激隱核蟲分離于大黃魚，參考文獻(xiàn)[19]的方法，以大黃魚作為動(dòng)物模型，使用亞致死劑量的幼蟲感染大黃魚3～4 d后，將魚轉(zhuǎn)移到新的容器中飼養(yǎng)，并將黏附于桶底的刺激隱核蟲包囊收集于燒杯中，在27 ℃滅菌海水中孵化并收集幼蟲進(jìn)行下一輪感染，建立本試驗(yàn)蟲株的傳代系統(tǒng)，隨時(shí)可以獲得足夠的寄生蟲用于試驗(yàn)。

1.2 試驗(yàn)魚與飼養(yǎng)

大黃魚[(3.00±0.78) g，(21.00±2.39) g]購于福建省寧德市三都澳大灣魚排。隨機(jī)抽取10尾魚，采集魚的鰓和刮取皮膚黏液進(jìn)行鏡檢，未發(fā)現(xiàn)刺激隱核蟲。試驗(yàn)魚在容積為1000 L圓形塑料桶中暫養(yǎng)2周，每日用商品顆粒飼料投喂2次并在投喂前吸除糞便，日投喂量為魚體質(zhì)量的2%～3%。養(yǎng)殖用水采用沙濾海水，鹽度29～31，溫度 (27±1) ℃，溶解氧≥5.0 mg/L，亞硝酸鹽<0.2 mg/L，微流水飼養(yǎng)，流速為100 L/h。

1.3 幼蟲試驗(yàn)

根據(jù)文獻(xiàn)[19]的方法，略作修改：幼蟲脫包達(dá)到高峰期，收集2 h內(nèi)孵化的蟲液，小心混勻后吸取10份(每份10 μL)蟲液于載玻片，每份加1 μL福爾馬林殺死幼蟲，光學(xué)顯微鏡(40×)下計(jì)數(shù)，計(jì)算出幼蟲的密度，用滅菌海水將蟲液密度調(diào)成2500 個(gè)/mL。

將福爾馬林用滅菌海水配成1000 mg/L，96孔板中加入120 μL滅菌海水，在第1和第2個(gè)孔中加入120 μL配好的藥液，從第2個(gè)孔等比稀釋至第12孔。然后每孔加入120 μL(約300個(gè)幼蟲)蟲液，輕輕地混勻，室溫下孵育，以海水為對照組，于10、30、60、120 min觀察結(jié)果，能引起100%幼蟲死亡被認(rèn)為是最終有效質(zhì)量濃度。試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 包囊試驗(yàn)

收集未分裂包囊，經(jīng)多次洗滌至干凈無雜質(zhì)后，挑入24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔約100個(gè)。加入不同比例福爾馬林和滅菌海水，使每孔液體總體積為2 mL，同時(shí)藥物質(zhì)量濃度分別為200、150、125、100、75、50 mg/L，以滅菌海水為對照組，每組藥物質(zhì)量濃度分別處理1、2、4 h后，用滅菌海水多次洗滌徹底除去藥物并加入2 mL新的滅菌海水。置于27 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每日更換1次滅菌海水。試驗(yàn)開始時(shí)置于倒置顯微鏡(40×)下統(tǒng)計(jì)每孔包囊數(shù)，168 h后統(tǒng)計(jì)未孵化包囊數(shù)，本試驗(yàn)重復(fù)3次。包囊死亡率按下式計(jì)算：

包囊死亡率/%=未孵化的包囊/包囊總數(shù)×100%

1.5 急性毒性試驗(yàn)

預(yù)試驗(yàn)：為確定試驗(yàn)所需的質(zhì)量濃度，先選擇較大的質(zhì)量濃度系列100、200、400、600、800 mg/L進(jìn)行試驗(yàn)。每質(zhì)量濃度放入5尾魚[(3.00±0.78) g ]，不設(shè)平行組，試驗(yàn)持續(xù)96 h，每日記錄各質(zhì)量濃度組的死亡魚數(shù)，并及時(shí)取出死魚，統(tǒng)計(jì)出24 h 100%死亡的最低質(zhì)量濃度為600 mg/L和96 h全部存活的最高質(zhì)量濃度為200 mg/L。

根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，在藥物質(zhì)量濃度能在24 h內(nèi)使魚全部死亡的最低質(zhì)量濃度和96 h魚全部存活最高質(zhì)量濃度之間，以1.2間隔系數(shù)設(shè)7個(gè)質(zhì)量濃度梯度，分別是200、240、288、346、415、498、598 mg/L 7個(gè)試驗(yàn)組，以海水為對照組，每組設(shè)2個(gè)平行組，每平行組10尾大黃魚[(3.00±0.78) g]，水溫(27±1) ℃。記錄24、48、72、96 h內(nèi)每組魚的死亡數(shù)。

半致死質(zhì)量濃度(LC50)采用Reed-munch方法，分別計(jì)算在12、24、48、96 h的半致死質(zhì)量濃度，即中間忍受限(TLm)：

TLm=C1+P1-(P1-50%)/(P1-P2)×(C2-C1)

式中,C1、C2分別為存活率接近50%的低端質(zhì)量濃度和高端質(zhì)量濃度，P1、P2分別為相應(yīng)的存活率。

安全質(zhì)量濃度(SC)：

SC=0.3×TLm48/(TLm24/TLm48)2

式中,TLm24、TLm48分別為24、48 h的半致死質(zhì)量濃度。

1.6 治療試驗(yàn)

采用2種不同福爾馬林質(zhì)量濃度治療刺激隱核蟲病，分別為125、75 mg/L，以滅菌海水為對照組。每組設(shè)2個(gè)重復(fù)，每重復(fù)組20尾大黃魚 [(21.0±2.39) g]，水溫 (27±1) ℃。試驗(yàn)前對試驗(yàn)魚進(jìn)行人工發(fā)病，按文獻(xiàn)[19]的方法收集孵化2 h內(nèi)的活躍幼蟲并計(jì)算出密度，以3000 個(gè)/魚進(jìn)行人工感染，海水用量為5 L/魚，感染2 h后開啟流水。人工發(fā)病第3 d，每組以對應(yīng)的福爾馬林治療用量藥浴2 h，之后進(jìn)行100%換水，恢復(fù)微流水飼養(yǎng)，每3 d藥浴1次，共3次。每日記錄每組魚的死亡數(shù)，并及時(shí)取出死魚，共記錄14 d。

1.7 數(shù)據(jù)處理

所得數(shù)據(jù)用SPSS 11.0和Microsoft Excel軟件分析處理，采用單方差因素分析顯著性(P<0.05或P<0.01)。并使用GraphPad Prism 5軟件作圖。

2 結(jié) 果

2.1 幼蟲對福爾馬林的敏感性

試驗(yàn)結(jié)果表明，福爾馬林對刺激隱核蟲幼蟲表現(xiàn)出較強(qiáng)的殺滅作用。在福爾馬林稀釋液中藥浴分別處理10、30、60、120 min，殺死全部幼蟲所需要的福爾馬林質(zhì)量濃度分別為62.5、62.5、31.3、15.6 mg/L(表1)。

2.2 包囊對福爾馬林的敏感性

結(jié)果顯示，包囊存活率與福爾馬林質(zhì)量濃度、處理時(shí)間成負(fù)相關(guān)。當(dāng)福爾馬林質(zhì)量濃度為50～125 mg/L時(shí)，隨著福爾馬林質(zhì)量濃度增加，殺滅作用隨之增強(qiáng)；當(dāng)福爾馬林質(zhì)量濃度為125～200 mg/L，處理時(shí)間1 h及以上，對包囊的殺滅作用均為100%。50 mg/L的福爾馬林對包囊的存活率具有一定的影響，且包囊存活率隨藥浴處理時(shí)間的延長而降低，但處理4 h尚不能殺死全部包囊。

處理1 h可以100%殺滅包囊所需福爾馬林質(zhì)量濃度為100～125 mg/L，處理2、4 h完全殺滅包囊的福爾馬林質(zhì)量濃度為50～75 mg/L(表2)。被福爾馬林處理過的包囊不能夠進(jìn)行分裂，包囊逐漸呈暗黃，內(nèi)部結(jié)構(gòu)瓦解，而未處理包囊能正常發(fā)育，幼蟲逸出后形成透明空殼(圖1)。

表1 福爾馬林殺滅刺激隱核蟲幼蟲的效果

注：“++++”、“+++”、“++”、“+”、“-”分別代表能引起100%、75%、50%、25%、0%幼蟲死亡.

圖1 福爾馬林處理刺激隱核蟲包囊的顯微鏡觀察(40×)a：未分裂包囊;b:75 mg/L福爾馬林處理2 h包囊168 h的形態(tài);c:未處理的包囊168 h的形態(tài).

%

注：表中代表包囊存活的百分比， *示與對照組差異顯著(P<0.05)；#示與對照組差異極顯著(P<0.01).

2.3 大黃魚幼魚藥物安全性

幼魚對福爾馬林表現(xiàn)出一定的耐受力，結(jié)果見表3，隨著福爾馬林質(zhì)量濃度的增加，大黃魚死亡逐步升高，而較低質(zhì)量濃度下(≤200 mg/L)不會造成死亡，當(dāng)福爾馬林質(zhì)量濃度為240 mg/L時(shí)，12 h內(nèi)出現(xiàn)死亡，死亡率為5%；當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到498 mg/L時(shí)，大黃魚幼魚12 h內(nèi)的死亡率達(dá)到95%；12、24、48、96 h的半致死質(zhì)量濃度分別為394.7、365.3、334.4、322.8 mg/L (表4)；計(jì)算可知，體質(zhì)量(3.00±0.78) g的大黃魚安全質(zhì)量濃度為119.57 mg/L。

表3 大黃魚幼魚對福爾馬林的耐受力 %

注：表中為大黃魚(3.00±0.78) g幼魚在不同福爾馬林質(zhì)量濃度處理后12、24、48、96 h的死亡率.

表4 福爾馬林對大黃魚幼魚的半致死質(zhì)量濃度

2.4 治療效果

根據(jù)福爾馬林殺滅包囊的質(zhì)量濃度設(shè)置了75、125 mg/L兩個(gè)質(zhì)量濃度梯度，結(jié)果見圖1，對照組和75 mg/L組在第6 d開始出現(xiàn)大量死亡，其中對照組在第8 d全部死亡，75 mg/L在第12 d全部死亡，而125 mg/L組的死亡率顯著低于對照組和75 mg/L組(P<0.01)，存活率為87.5%。

圖2 不同處理組大黃魚的死亡率

3 討 論

福爾馬林在生產(chǎn)上，被廣泛用于水體消毒和防治魚類疾病[13]，對魚類體外寄生蟲病的防治效果尤為明顯。在水產(chǎn)上常用的3種藥物中，福爾馬林對多子扇形游仆蟲(Euplotesvannus)和寡毛雙眉蟲(Diophrysoligothrix)的殺滅效果優(yōu)于魯哥氏液、高錳酸鉀[20-21]；Shinn 等[22]研究表明，水體中合理的福爾馬林含量，可有效防控多子小瓜蟲(Ichthyophthiriusmultifiliis)病的爆發(fā)；閆茂倉等[14]研究也發(fā)現(xiàn)，全池潑灑20～80 mg/L的福爾馬林可有效防治刺激隱核蟲病。

由本試驗(yàn)結(jié)果可知，刺激隱核蟲對福爾馬林耐受力較低，當(dāng)福爾馬林質(zhì)量濃度為62.5 mg/L藥浴處理 10 min或福爾馬林質(zhì)量濃度為15.6 mg/L處理2 h均可100%殺死刺激隱核蟲幼蟲；當(dāng)質(zhì)量濃度為75 mg/L處理2 h可以完全殺滅包囊。因此，在試驗(yàn)條件下，使用質(zhì)量濃度為75 mg/L的福爾馬林，處理2 h可以完全殺滅體外刺激隱核蟲。而利用125、75 mg/L兩種劑量的福爾馬林，每3 d藥浴處理感染刺激隱核蟲的大黃魚的研究結(jié)果表明，在實(shí)際生產(chǎn)中，質(zhì)量濃度75 mg/L福爾馬林不能完全殺滅水體中刺激隱核蟲包囊，還會造成刺激隱核蟲對宿主的重復(fù)感染；而當(dāng)藥浴福爾馬林質(zhì)量濃度達(dá)到125 mg/L以上時(shí)，可殺滅水體中所有自由生活階段刺激隱核蟲。生產(chǎn)中，利用質(zhì)量濃度125 mg/L福爾馬林藥浴一次感染刺激隱核蟲的病魚，可滅活自由生活階段的刺激隱核蟲，防止再次對宿主的重復(fù)感染從而有效控制刺激隱核蟲病。

刺激隱核蟲病是海水魚類養(yǎng)殖業(yè)危害重大的寄生蟲病[4,6]，易發(fā)生多次重復(fù)感染或?qū)е卖~類繼發(fā)細(xì)菌病，進(jìn)而造成死亡[26]。滋養(yǎng)體階段的刺激隱核蟲寄生于魚的真皮內(nèi)，藥物難以殺滅，是其難以治療的主要原因。殺滅水體中自由生活階段的刺激隱核蟲和切斷寄生蟲的傳播途徑是目前預(yù)防和治療該病的重要策略，生產(chǎn)中，定期輪換養(yǎng)殖池或通過墊布移除水體中刺激隱核蟲包囊等物理方法或依賴如甲醛、硫酸銅等化學(xué)藥物殺蟲可以有效控制刺激隱核蟲病[7,9,27]。但物理方法在實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用中耗時(shí)耗力，工人更偏向使用化學(xué)藥物。雖然福爾馬林對魚的毒性較低，但生產(chǎn)中大量不合理的使用會導(dǎo)致許多不良后果，如造成病原菌耐性、對魚的毒性、污染環(huán)境、藥物殘留導(dǎo)致的食品安全問題等等。本試驗(yàn)結(jié)果雖然表明一定范圍內(nèi)的福爾馬林質(zhì)量濃度對大黃魚無顯著影響，但大黃魚是應(yīng)激性很強(qiáng)的魚類[5]，大量和長期使用福爾馬林易造成大黃魚自身抗病力下降，導(dǎo)致其他疾病的爆發(fā)[16-18]。因此實(shí)際生產(chǎn)上要根據(jù)滋養(yǎng)體在魚體的寄生期為3～7 d和包囊從形成到孵化出幼蟲至少需要3 d時(shí)間的規(guī)律，每隔3 d用125 mg/L的福爾馬林對魚池進(jìn)行藥浴處理，處理3次，可有效殺滅水體中的刺激隱核蟲，防止該寄生蟲對大黃魚的重復(fù)感染。

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