宋 君，常麗娟，陶 李，張富麗，王 東(四川省農(nóng)業(yè)科學院分析測試中心，四川 成都 610066)

【研究意義】由于價格和消費者的接受程度等因素影響以及相關法律規(guī)定，人們需要區(qū)分轉基因產(chǎn)品與非轉基因產(chǎn)品以及知道產(chǎn)品中轉基因成分的含量。目前，轉基因成分的鑒定一般可以采用檢測外源基因(核酸)和外源蛋白質的方法實現(xiàn)[1-2]，而轉基因成分的精準定量目前得到世界廣泛認可的方法是采用實時熒光定量PCR方法。近年，轉基因生物及產(chǎn)品的檢測方法研究，普遍集中在轉化事件的終點PCR法和實時PCR法[3-5]。此外，有轉基因生物及產(chǎn)品的傳感器方法、質譜法、近紅外光譜法等報道，但因成本高、儀器設備配置要求高、可操作性低等原因未得到廣泛推廣應用。近20年來，人們對基于DNA的轉基因成分實時熒光定量PCR檢測技術研究非常重視[6-8]，建立的部分轉基因成分定量檢測方法已經(jīng)非常成熟且上升為國際、國內(nèi)檢測技術標準并在實踐中大量應用，但卻忽略了這些方法在應用中的質量保證研究?！厩叭搜芯窟M展】有報道指出轉基因成分的定量檢測結果與理論值的相對偏差不高于25 %就能被廣泛接受[9]，而且隨著轉基因成分含量的降低，檢測結果偏差將會上升。是何原因導致轉基因成分定量有較高的相對偏差，影響因素是有哪些，影響因素的貢獻大小是多少，如何提高轉基因成分的定量檢測質量。截止目前，尚無針對上述問題的研究報道。轉基因玉米MIR604是由美國先正達種子公司(Syngenta Seeds Inc.)開發(fā)的的一種抗蟲轉基因玉米，該品系包含由啟動子MTL和終止子NOS調控的抗蟲基因Cry3A和由啟動子Ubi Zm1、終止子NOS調控的標記基因pmi。2006年該品系經(jīng)過安全評價作為食品和飼料加工原材料首次在澳大利亞和新西蘭市場投放。自2007年開始，包括美國、加拿大、日本、阿根廷和巴西在內(nèi)共有5個國家進行商業(yè)化種植MIR604玉米品系(http://www.isaaa.org/gmapprovaldatabase/event/default.asp?EventID=131)。我國自2008年開始批準進口該轉玉米品系用作食品和飼料的加工原材料，禁止商業(yè)化種植?！颈狙芯壳腥朦c】常麗娟等針對轉基因玉米MIR604品系外源基因的側翼序列設計了一對特異引物和探針[10]，建立了成熟的轉基因玉米MIR604品系的實時熒光定量PCR檢測方法并確認了該法對轉基因玉米MIR604品系的特異性和靈敏度(達到5拷貝數(shù))。測量不確定度是評估檢測質量的重要參數(shù)?！緮M解決的關鍵問題】通過對轉基因成分的測量不確定評定研究，可發(fā)現(xiàn)影響檢測質量的因素，并能將影響因素對不確定度的貢獻進行數(shù)值化定量分析，找到影響檢測質量最大的“干擾因子”，從而有針對性地改進實驗環(huán)節(jié)和步驟，提高轉基因成分的定量檢測質量。本文首次采用蒙特卡洛方法(Monte Carlo Method, MCM)開展轉基因玉米MIR604的測量不確定度評定研究，回答并解決長期困擾影響轉基因成分定量檢測質量的問題。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

校準定量PCR儀(擬合校準曲線)的校準子(Calibrator)為10 %的轉基因玉米DAS-4-40278-9有證標準物質基因組DNA的5個梯度濃度稀釋液；1 %含量轉基因玉米DAS-4-40278-9的標準品作為測試樣品；DNA分離和定量PCR試劑采用TIANGEN生化科技有限公司(北京)生產(chǎn)的高效植物基因組DNA 提取試劑盒和SuperReal PreMix (Probe)試劑盒；實驗中使用到引物/探針序列(上海生工合成和標記)參照本實驗室建立的方法[10]；本研究用到的主要儀器有超微量分光光度計(Nanodrop-1000, Thermo, USA)和實時熒光定量PCR儀(7500，ABI, USA)，分別測量分離、純化到的DNA溶液質量(濃度、純度和完整性)和擴增、測量玉米內(nèi)源基因(zSSIIb)、轉基因玉米MIR604片段及其絕對含量。

1.2 DNA提取

標準物質和試樣DNA的分離、純化以及PCR反應體系配置，按照試劑盒說明書操作。

1.3 校準曲線擬合和試樣測量

把標準物質DNA的溶液分別稀釋成105、21、4.2、0.84和0.17 ng/μl，然后用上述4 μl系列標準物質DNA溶液[按照玉米基因組大小(5×109base) pairs][11]計算，分別相當于1.9×106、4×105、8×104、1.6×104、3.2×103copies DNA分子)的對數(shù)值(校準子)及其PCR儀檢測到的響應Ct值(校準子)作為擬合zSSIIb基因、MIR604片段校準曲線的輸入量。試樣DNA溶液稀釋到12.5 ng/μl。PCR反應體系含4 μl標準物質DNA溶液或試樣溶液、2×主混液10 μl，上、下游引物各0.5 μM，探針0.25 μM，滅菌水補至20 μl。每個DNA濃度點做3個平行實驗；試樣重復做24次測量。PCR反應程序為 95 ℃，10 min； 95 ℃，15 s；59 ℃，1 min(45 cycles)。

1.4 數(shù)學測量模型和不確定度評定

轉基因玉米MIR604的測量分為3個階段，包含3個數(shù)學模型。

第1階段是按照(1)式(數(shù)學模型)擬合zSSIIb基因和MIR604片段的校準曲線:

Ct=m×lgA+k

(1)

式中，A為zSSIIb基因或MIR604片段的已知量，Ct為A的儀器響應值(threshold of cycles,Ct)，二者作為擬合曲線的輸入量；k和m分別為校準曲線的輸出量截距和斜率。

第2階段是把PCR儀檢測到的試樣zSSIIb基因和MIR604片段的Ct值作為輸入量代入(2)式(校準曲線方程的變形式)，計算獲得試樣zSSIIb基因和MIR604片段的絕對量:

A=10(Ct-k)/m

(2)

第3階段是把試樣zSSIIb基因和MIR604片段的絕對量作為輸入量代入(3)式計算獲得試樣中轉基因玉米MIR604的相對百分含量C輸出量:

C=A外/A內(nèi)×100 %

(3)

式中，A外和A內(nèi)分別為試樣中MIR604片段和zSSIIb基因的絕對量。

按照ISO-GUM Supp1[12]，采用MCM進行概率分布傳遞來評定轉基因玉米MIR604的測量不確定度。編寫MATLAB代碼實現(xiàn)評定過程中的抽樣、計算。

2 結果與分析

2.1 輸入量PDF的設定和抽樣

本研究涉及到的輸入量包括用于PCR儀校準的系列校準子(Cti)、校準曲線斜率(m)和截距(k)、試樣內(nèi)/外源基因Ct值、試樣內(nèi)/外源基因絕對含量(A內(nèi)/A外)，其中校準曲線斜率(m)和截距(k)、試樣內(nèi)/外源基因絕對含量(A內(nèi)/A外)在不同的階段既作為輸入量同時也作為輸出量。

表1 zSSIIb內(nèi)源基因校準曲線擬合Table 1 Fitting of calibration curve for endogenous gene zSSIIb

表2 MIR604片段校準曲線擬合Table 2 Fitting of calibration curve for MIR604 fragment

PCR儀校準的系列校準子(Cti)(表1～2)、試樣內(nèi)/外源基因Ct值(表3)的PDF遵守均勻分布R(a,b)(a為均勻分布的下限，b均勻分布的上限)，從標準均勻分布R(0，1)中抽取隨機數(shù)r，對任意值ξ，滿足ξ=a+(b-a)r；試樣內(nèi)/外源基因絕對含量(A內(nèi)/A外)的PDF設定為正態(tài)分布N[y,u2(y)] [y為最佳估計值，u(y)為標準不確定度]，從標準正態(tài)分布N(0，1)中抽取隨機數(shù)r，對任意值ξ，構造ξ=y+u(y)r；由于校準曲線的斜率m和截距k是2個相關聯(lián)的量。因此，m和k的PDF設定為雙元正態(tài)聯(lián)合，按照JCGM 101:2008[12]、JCGM 102:2011[13]規(guī)定和Sega[14]報道的方法處理。各輸入量的分布類型、均值和包含區(qū)間見表4。

表3 試樣中內(nèi)源基因zSSIIb和MIR604片段的Ct值Table 3 Ct values of endogenous gene zSSIIb and MIR604 fragment in the sample

表4 各輸入/輸出量的分布及不確定度和95 %包含概率的包含區(qū)間Table 4 The probability distribution of all inputs and outputs and their 95 % coverage intervals

續(xù)表4 Continued table 4

影響因子或輸入/出量概率分布平均值標準不確定度包含概率為95 %包含區(qū)間Ct_S10均勻分布24.320.2023.99^24.65Ct_S11均勻分布24.290.2023.96^24.62Ct_S12均勻分布24.360.2024.03^24.69Ct_S13均勻分布24.550.2024.22^24.88Ct_S14均勻分布24.490.2024.16^24.82Ct_S15均勻分布24.470.2024.14^24.80Ct_S16均勻分布24.740.2024.41^25.07Ct_S17均勻分布24.690.2024.36^25.02Ct_S18均勻分布24.570.2024.24^24.90Ct_S19均勻分布24.700.2024.37^25.03Ct_S20均勻分布24.730.2024.40^25.06Ct_S21均勻分布24.610.2024.28^24.94Ct_S22均勻分布24.730.2024.40^25.06Ct_S23均勻分布24.690.2024.36^25.02Ct_S24均勻分布24.760.2024.43^25.09Ct_S1#均勻分布32.790.1832.49^33.09Ct_S2#均勻分布32.700.1832.40^33.00Ct_S3#均勻分布32.510.1832.21^32.81Ct_S4#均勻分布32.490.1832.19^32.79Ct_S5#均勻分布32.600.1832.30^32.90Ct_S6#均勻分布32.290.1831.99^32.59Ct_S7#均勻分布32.700.1832.40^33.00Ct_S8#均勻分布32.380.1832.08^32.68Ct_S9#均勻分布32.570.1832.27^32.87Ct_S10#均勻分布32.130.1831.83^32.43Ct_S11#均勻分布32.440.1832.14^32.74Ct_S12#均勻分布32.430.1832.13^32.73Ct_S13#均勻分布32.600.1832.30^32.90Ct_S14#均勻分布32.610.1832.31^32.91Ct_S15#均勻分布32.610.1832.31^32.91Ct_S16#均勻分布32.560.1832.26^32.86Ct_S17#均勻分布32.540.1832.24^32.84Ct_S18#均勻分布32.450.1832.15^32.75Ct_S19#均勻分布32.770.1832.47^33.07Ct_S20#均勻分布32.470.1832.17^32.77Ct_S21#均勻分布32.570.1832.27^32.87Ct_S22#均勻分布32.980.1832.68^33.28Ct_S23#均勻分布32.880.1832.58^33.18Ct_S24#均勻分布32.680.1832.38^32.98Q_zSSIIb正態(tài)分布141.573.93133.86^149.27Q_MIR604正態(tài)分布1.400.041.33^1.48C正態(tài)分布0.00993.76×10-40.0092^0.0107

注：a.Ct11～Ct53(統(tǒng)稱Cti)表示zSSIIb基因測量中標準物質各濃度點的響應值；b.Ct11#～Ct53#(統(tǒng)稱Cti#)表示59122測量中標準物質各濃度點的響應值；c.Ct_S1～Ct_S24(統(tǒng)稱Ct_Si)表示試樣24次重復測量zSSIIb基因獲得的Ct值；d.Ct_S1#～Ct_S24#(統(tǒng)稱Ct_Si#)表示試樣24次重復測量59122片段獲得的Ct值；e.Q_zSSIIb表示試樣中zSSIIb的絕對含量；f.Q_MIR604表示試樣中59122片段的絕對含量；g.C表示試樣中59122片段的相對含量；h.mzSSIIb和mMIR604分別zSSIIb基因和MIR604片段的校準曲線的斜率；i.kzSSIIb和kMIR604分別zSSIIb基因和MIR604片段的校準曲線的截距。

圖1 MIR604玉米相對含量的概率分布Fig.1 The plot of probability distribution for relative content of MIR604 maize

2.2 PDF傳遞和輸出

從2.1中各輸入量的 PDF中抽取106個樣本值，對每個樣本向量計算相應的測量模型值。將106個模型值按照嚴格遞增次序排序從而得到輸出量的PDF、均值和包含區(qū)間。

3 討 論

本研究首次使用MCM法實施各影響因素的“概率分布傳播”來評定轉基因成分的測量不確定度。本實驗混合樣品中轉基因玉米MIR604的相對含量為0.99 %接近理論含量1 %，相對偏差為1 %，小于常麗娟等[10]報道結果(1.05 %)的相對偏差(5 %)。本次混合樣品中轉基因玉米MIR604的相對含量的標準不確定度為3.76×10-4，遠遠小于理化分析中不確定度的可接受水平(10 %)。程序計算獲得的包含概率為95 %條件下的轉基因玉米MIR604的相對含量包含區(qū)間為2.91 %～3.00 %，即轉基因玉米MIR604的相對含量落在2.91 %～3.00 %非常窄的范圍內(nèi)的概率為95 %，充分顯示本實驗的測量質量非常高，測量數(shù)據(jù)非?？煽?。

開展測量不確定度評定的目的是了解實驗過程中影響測量結果的因素及其大小。轉基因成分定量分析包括樣品制備、DNA提取、PCR擴增、校準曲線擬合和轉基因成分含量計算等步驟。每一個步驟都可能包含了一些不確定度成分，目前在樣品制備、DNA提取階段，由于尚未建立科學的測量模型(數(shù)學模型)，所以很難對樣品制備和DNA提取階段的不確定度成分進行量化評定。本文僅對校準曲線制備、PCR擴增和含量計算等步驟產(chǎn)生的不確定度成分進行量化評估。從表4反應的各不確定度成分貢獻大小依次(從大到小)為玉米內(nèi)源基因zSSIIb絕對含量不確定度3.93，濃度點4.2 ng/μl稀釋產(chǎn)生的不確定0.32(相同濃度點對應于外源片段Ct值的也有較大的不確定度0.21)，測試樣品內(nèi)源基因Ct值不確定度0.20，測試樣品外源片段Ct值不確定度0.18，濃度點21 ng/μl處外源片段Ct值的不確定0.17，其余不確定度都小于0.1，最終輸出量轉基因玉米MIR604的相對含量C的不確定度極小。本次評定的不確定大小反應出除最大的玉米內(nèi)源基因zSSIIb絕對含量不確定度(因各種不可控因素影響一般不用絕對含量作為轉基因含量)外，主要影響轉基因成分檢測質量的不確定度成分是校準曲線擬合過程中校準子制備產(chǎn)生的不確定度(0.32)。影響校準子制備的因素為液體轉移量的準確性。因此，提高轉基因成分定量分析質量的關鍵因素提高實驗操作過程中的液體轉移量的準確度。

4 結 論

經(jīng)過基于MATLAB軟件編寫的程序代碼模擬106次抽樣、計算、傳遞各個變量的PDF，獲得了混合樣品中轉基因玉米MIR604的相對含量C(最終輸出量)的PDF和不確定度。測量過程的所有輸入/出量的PDF、最佳估計值、標準不確定度和95 %包含概率的包含區(qū)間結果見表4。zSSIIb基因和MIR604片段的校準曲線分別為y=-3.38x+31.74和y=-3.30x+33.06。Q_zSSIIb和Q_MIR604絕對含量的平均值分別為141.57和1.40，標準不確定度分別為3.93和0.04，95 %包含概率的包含區(qū)間分別為133.86～149.27和1.33～1.48。MIR604片段相對含量C的平均值、標準不確定度和95 %包含概率的包含區(qū)間分別為0.99 %、3.76×10-4和0.92 %～1.07 %。圖1為經(jīng)MATLAB程序運行產(chǎn)生的呈正態(tài)分布的轉基因玉米MIR604相對含量的概率密度。所有成分中，不確定度貢獻最大的成分是是液體轉移量的偏差。因此，液體轉移量的準確度是提高轉基因成分檢測質量的關鍵。

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