郭陽艷，劉萌萌，楊曉華，任樂樂，劉志宏，劉云峰，章 毅

(山西醫(yī)科大學(xué) 1. 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室、2. 第一醫(yī)院內(nèi)分泌科，山西 太原 030001)

糖尿病是多種病因引起的以慢性、漸進(jìn)性血糖升高為主要特征的代謝性、內(nèi)分泌疾病。除了血糖升高，糖尿病引起各種營養(yǎng)物質(zhì)的代謝紊亂，隨著疾病發(fā)展引起全身慢性并發(fā)癥[1]。各種治療糖尿病的方法與藥物層出不窮，但截止目前糖尿病依然不可治愈，如何更好地治療依然是科研界與臨床的難題。

黃芩為唇形科植物黃芩的干燥根，是我國的傳統(tǒng)中藥。黃芩素(baicalein)是黃芩中含量最高的黃酮類化合物之一，也是發(fā)揮藥效的主要活性成分[2]，可以特異性抑制12-脂氧合酶[3]。黃芩素具有抗炎[4]、抗病毒、抗腫瘤[5]、護(hù)肝[6]、清除自由基、保護(hù)神經(jīng)等廣泛作用。近年來，隨著國內(nèi)外學(xué)者對黃芩素研究的逐漸深入，已經(jīng)證實(shí)黃芩素通過清除自由基和抗氧化[7]、降低血壓及血脂、抑制蛋白激酶C的激活、抑制α-葡萄糖苷酶活性[8]、調(diào)節(jié)炎癥細(xì)胞因子[9]、保護(hù)β細(xì)胞功能[10]等，發(fā)揮降低血糖及抗糖尿病作用，但關(guān)于離子通道的研究甚少。本研究旨在通過胰島素分泌實(shí)驗(yàn)、鈣成像技術(shù)、膜片鉗技術(shù)，探討黃芩素促進(jìn)大鼠胰島素分泌的離子通道機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 Wistar大鼠，♂，體質(zhì)量180～250 g，由中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。生產(chǎn)許可證號：SCXK-(軍)2012-0004。

1.1.2試劑 黃芩素(批號:491-67-8)、Histopaque 1077(批號:RNBF1783)，均購自美國Sigma公司；膠原酶P(瑞士Roche,批號:11104222); RPMI 1640 培養(yǎng)基(批號: C518FA0002)、胎牛血清(批號:B326FA0092)，均購自上海生工；D-葡萄糖(批號:405A0918)、BSA(批號:83100513)均購自北京索萊寶；Dispase II (美國Amresco, 批號:10888700);胰島素檢測試劑盒(北京北方生物技術(shù)研究所,批號:20160320)。

1.1.3儀器 體式顯微鏡(上海中恒,型號:SM262);細(xì)胞培養(yǎng)箱(北京博奧恒信生物科技,型號:HF100);倒置顯微鏡(日本Olympus,型號:AE-2000);臺(tái)式離心機(jī)(長沙湘儀,型號:SC-3610);MODEL電極拉制儀(日本Narishige,型號PP-830);MIRO FORGE拋光儀(日本Narishige,型號:MF-200);EPC10 全自動(dòng)膜片鉗(德國HEKA,型號:MP-285);鈣成像(北京MDE,型號:LAMBDA 10-B)。

1.2方法

1.2.1獲取Wistar大鼠的胰島及胰島β細(xì)胞 快速處死大鼠，無菌條件下剖開腹腔，從膽總管逆行注入1 g·L-1膠原酶，完整剝?nèi)〈笫蟮囊认俳M織，38℃水浴消化11 min，加入Histopaque 1077分離液梯度離心后，體式顯微鏡下手工挑取邊緣整齊、透光率小，直徑大小在100～300 μm的單個(gè)胰島，并將其放入37℃、5% CO2的孵箱中培育[11]。用3 g·L-1的Dispase II 溶液消化培育狀態(tài)好的大鼠胰島，孵箱內(nèi)消化5 min后，取出加入RPMI 1640培養(yǎng)基(含胎牛血清)，離心2 min后棄去上清液，將沉淀混勻后，滴在用細(xì)胞黏附劑處理過的5 mm×5 mm玻片上,將玻片置于RPMI 1640培養(yǎng)基(含胎牛血清)中，放入37℃、5% CO2的孵箱中培育。

1.2.2胰島素分泌實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)分為5組,分別為2.8 mmol·L-1葡萄糖(低糖)、16.7 mmol·L-1葡萄糖(高糖)、16.7 mmol·L-1葡萄糖+20 μmol·L-1黃芩素、16.7 mmol·L-1葡萄糖+50 μmol·L-1黃芩素、16.7 mmol·L-1葡萄糖+100 μmol·L-1黃芩素，每組7個(gè)EP管，35個(gè)EP管內(nèi)各加入含2.8 mmol·L-1葡萄糖的KRBH孵育液800 μL，每個(gè)EP管內(nèi)挑取5個(gè)胰島，于37℃、5% CO2的孵箱中孵育30 min。KRBH孵育液各成分濃度(mmol·L-1)：128.8 NaCl、4.8 KCl、1.2 KH2PO4、1.2 MgSO4、2.5 CaCl2·2H2O、10 HEPES、5 NaHCO3，pH 7.4。每100 mL KRBH中加入2 g BSA。30 min后取出所有EP管，棄去上清液，每組分別加入500 μL的2.8 mmol·L-1葡萄糖、16.7 mmol·L-1葡萄糖及含不同濃度黃芩素(20、50、100 μmol·L-1)的高糖KRBH，繼續(xù)于孵箱中孵育30 min后取出，取上清液，用放免法檢測胰島素含量。

1.2.3鈣成像實(shí)驗(yàn) 將細(xì)胞置于含2 μmol·L-1Fura-2AM(Ca2+熒光探針，也稱染液)和2.8 mmol·L-1葡萄糖的KRBH孵育液中，37℃、5% CO2孵箱中避光孵育30 min后取出，用含2.8 mmol·L-1葡萄糖的KRBH洗去染液,將載有細(xì)胞的玻片置于激光共聚焦顯微鏡上，用8通道給藥系統(tǒng)持續(xù)分別給予16.7 mmol·L-1葡萄糖、含50 μmol·L-1黃芩素的高糖KRBH及60 mmol·L-1KCl。設(shè)定激發(fā)光340 nm和380 nnm,發(fā)射光510 nm，得到F340/F380，此比值反映細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度變化。

1.2.4膜片鉗實(shí)驗(yàn) 配制電極內(nèi)、外液。電極外液各成分濃度(mmol·L-1)：138 NaCl、5.6 KCl、1.2 MgCl2·6H2O、2.6 CaCl2、5 HEPES，pH 7.4。電極內(nèi)液各成分濃度(mmol·L-1)：140 KCl、1 MgCl2·6H2O、0.05 EGTA、10 NaCl、10 HEPES、0.3 Mg-ATP，pH 7.4。PP-830電極拉制儀拉制玻璃電極，充灌電極內(nèi)液后電阻大小為4～7 MΩ,將孵育好的細(xì)胞浸在含11.1 mmol·L-1葡萄糖及含11.1 mmol·L-1葡萄糖和不同藥物濃度的電極外液中。選取細(xì)胞膜電容>7PF的細(xì)胞(視為β細(xì)胞[12])，電極尖端與細(xì)胞膜片之間形成高阻封接(電阻≥GΩ)后，將電壓鉗制在-70 mV,給予-70～80 mV的電壓刺激400 ms,負(fù)壓破膜，全細(xì)胞記錄模式下記錄Kv電流。

2 結(jié)果

2.1黃芩素對大鼠胰島素分泌的影響實(shí)驗(yàn)分組如下：2.8 mmol·L-1葡萄糖(2.8G)、16.7 mmol·L-1葡萄糖(16.7G)作為對照、在16.7G前提下加入不同濃度的黃芩素。如Fig 1所示，20、50 μmol·L-1黃芩素呈濃度梯度性促進(jìn)胰島素分泌，100 μmol·L-1的黃芩素沒有進(jìn)一步促進(jìn)分泌。實(shí)驗(yàn)表明，黃芩素可以促進(jìn)胰島素的分泌，其體外促進(jìn)大鼠胰島素分泌的最佳藥物濃度是50 μmol·L-1。

Fig 1 Effects of baicalein on insulin secretion of rat islets(n=7)

Rat islets were incubated in KRB buffer with 2.8 mmol·L-1glucose or 16.7 mmol·L-1glucose or different concentrations of baicalein for 30 min. Insulin secreted into supernatant was measured by ELISA.**P<0.01vs2.8G;#P<0.05,##P<0.01vs16.7G.

2.2黃芩素對細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度([Ca2+]i)影響選取最佳促進(jìn)胰島素分泌濃度，分別用16.7 mmol·L-1葡萄糖、50 μmol·L-1黃芩素、60 mmol·L-1氯化鉀干預(yù)胰島β細(xì)胞，F(xiàn)340/F380反映細(xì)胞內(nèi)[Ca2+]i。Fig 2結(jié)果表明，50 μmol·L-1黃芩素干預(yù)細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)[Ca2+]i較16.7 mmol·L-1葡萄糖干預(yù)時(shí)升高，差異且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。結(jié)果表明，黃芩素可以提高細(xì)胞內(nèi)[Ca2+]i。

Fig 2 Effect of baicalein on intracellular [Ca2+]i levels(n=6)

A: The radio of F340/F380 reflected intracellular [Ca2+]ilevels. β-cells were treated with 16.7 mmol·L-1glucose or 50 μmol·L-1baicalein or 60 mmol·L-1KCl intervention, 60 mmol·L-1KCl intervention was treated as positive control; B: Bar graph using the mean of the radio of ΔF340/F380.**P<0.01vs16.7G.

2.3黃芩素對β細(xì)胞Kv通道的影響分別用含11.1 mmol·L-1葡萄糖的電極外液及不同藥物濃度的電極外液干預(yù)細(xì)胞，含11.1 mmol·L-1葡萄糖的電極外液干預(yù)的細(xì)胞作為對照組，分別經(jīng)過高阻封接、鉗制電壓、破膜后，全細(xì)胞模式下記錄Kv電流。Fig 3結(jié)果表明，與對照組相比，20 μmol·L-1黃芩素抑制了Kv電流，50 μmol·L-1黃芩素進(jìn)一步抑制β細(xì)胞Kv。實(shí)驗(yàn)表明，黃芩素可以濃度梯度性抑制β細(xì)胞Kv電流。

3 討論

糖尿病的主要特征是胰島β細(xì)胞功能缺陷和胰島素發(fā)揮作用障礙[1]，因此，促進(jìn)胰島β細(xì)胞分泌功能、改善胰島素抵抗可以有效治療糖尿病。黃芩素是從傳統(tǒng)中藥黃芩的干燥根里提取的黃酮類化合物，近年來由于其廣泛的藥理學(xué)作用而受到大量關(guān)注。國內(nèi)外研究證實(shí)，黃芩素具有抗糖尿病及改善糖尿病并發(fā)癥預(yù)后的作用。黃芩素可以通過減輕INS-1細(xì)胞炎癥損傷促進(jìn)胰島素分泌[7]，通過PI3K/Akt/GSK3β信號通路改善糖尿病大鼠相關(guān)的認(rèn)知障礙，通過減輕新陳代謝紊亂[13]治療糖尿病等，但黃芩素抗糖尿病的離子通道機(jī)制尚不清楚。

現(xiàn)有的研究證實(shí)，胰島素是人體內(nèi)唯一可以降低血糖的激素，由胰島β細(xì)胞分泌。胰島β細(xì)胞是可興奮細(xì)胞，刺激后分泌的胰島素與其細(xì)胞膜上離子通道的活動(dòng)密切相關(guān)。胰島β細(xì)胞上主要的離子通道包括ATP敏感性鉀通道(KATP)、電壓依賴性鉀通道(Kv)和電壓門控性鈣通道(voltage-gated calcium channel，VDCC)。葡萄糖是刺激胰島素分泌的主要因素，其進(jìn)入細(xì)胞經(jīng)過糖酵解和氧化磷酸化生成ATP，細(xì)胞內(nèi)ATP/ADP比例升高使KATP通道關(guān)閉，細(xì)胞動(dòng)作電位去極化。當(dāng)動(dòng)作電位去極化到一定程度時(shí)，電壓門控性鈣通道開放，細(xì)胞外Ca2+內(nèi)流，使細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度升高，促發(fā)胰島素囊泡的運(yùn)動(dòng)、與細(xì)胞膜融合釋放胰島素。當(dāng)細(xì)胞膜電位去極化到一定程度后，Kv開放,細(xì)胞內(nèi)K+外流，細(xì)胞動(dòng)作電位復(fù)極化，分泌活動(dòng)停止[14]。

在本研究中，關(guān)于胰島素分泌功能的實(shí)驗(yàn)證實(shí)，高糖情況下，黃芩素呈濃度梯度依賴性的方式促進(jìn)胰島素分泌，其體外實(shí)驗(yàn)最佳藥物濃度為50 μmol·L-1。β細(xì)胞分泌功能與細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度成正比[14]，我們通過鈣成像實(shí)驗(yàn)得到細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度變化，研究黃芩素促進(jìn)分泌的作用與細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的關(guān)系。本實(shí)驗(yàn)鈣成像結(jié)果顯示，用黃芩素50 μmol·L-1干預(yù)胰島β細(xì)胞，細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度上升，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。因此推斷，黃芩素促進(jìn)分泌的作用是通過升高細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度產(chǎn)生的。參與β細(xì)胞分泌活動(dòng)的離子通道Kv參與β細(xì)胞動(dòng)作電位的復(fù)極化，抑制Kv通道可以減少細(xì)胞內(nèi)K+外流，延長動(dòng)作電位，使β細(xì)胞動(dòng)作電位復(fù)極化過程減慢，從而延長分泌活動(dòng)的時(shí)間，促進(jìn)分泌。我們運(yùn)用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)研究不同濃度黃芩素(20、50 μmol·L-1)的促進(jìn)分泌作用與Kv通道的關(guān)系。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，黃芩素呈濃度梯度依賴性的方式抑制Kv電流。因此，黃芩素可以通過抑制Kv通道，延長動(dòng)作電位促進(jìn)分泌。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)通過胰島素分泌實(shí)驗(yàn)、鈣成像技術(shù)、膜片鉗技術(shù)，從不同的角度闡明了黃芩素可以促進(jìn)大鼠胰島素分泌功能，即通過抑制胰島β細(xì)胞Kv通道，增加細(xì)胞內(nèi)鈣離子的濃度，從而進(jìn)一步增加胰島素的分泌。胰島素分泌過程中KATP通道的關(guān)閉也是其中一個(gè)重要環(huán)節(jié)[14]，黃芩素是否對KATP通道和VDCC通道有作用，以及各離子通道之間的聯(lián)系尚有待進(jìn)一步的研究。

Fig 3 Effects of baicalein on Kv channels(n=6)

A: Representative Kv current traces under different concentrations of baicalein; B: Current-voltage relationship curves of different concentrations of baicalein on Kv channels from rat β cells; C: Bar graph using summary of the mean current density of Kv channels recorder at 80mV depolarization.*P<0.05,**P<0.01vscontrol.

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