陳 瑋，羅洪斌,2,3,4，魯文杰，牟南樵，黃 勝，陳 娟，樊莎莎，謝文執(zhí)，商 楠，楊晨宇，謝楓楓，諶 勤

(湖北民族學(xué)院1.醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室、2.科技學(xué)院醫(yī)學(xué)系生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室、3. 生物資源保護(hù)與利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、4. 神經(jīng)精神共患病研究所、5.附屬民大醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，湖北 恩施 445000)

阿爾茨海默病(Azheimer’s disease, AD)是一種神經(jīng)退行性疾病，也是最為常見(jiàn)的老年癡呆癥，隨著全球老齡化進(jìn)程的不斷加快，其發(fā)病率也呈上升趨勢(shì)[1]。AD的主要臨床特征為進(jìn)行性認(rèn)知功能障礙，老年斑(amyloid-β protein, SP)、神經(jīng)纖維纏結(jié)(neurofibrillary tangles, NFTs)、營(yíng)養(yǎng)不良性神經(jīng)炎和神經(jīng)元功能受損為其主要病理特征[2]。SP是由細(xì)胞外淀粉樣前體蛋白(amyloid precursor protein, APP)異常分裂產(chǎn)生的毒性β淀粉樣肽1～40, 42(Aβ1～40, 42)堆積形成，NFTs是由細(xì)胞內(nèi)Tau蛋白過(guò)度磷酸化異常聚集形成的[2]。同時(shí)，Tau蛋白的過(guò)度磷酸化還是AD早期病理學(xué)特征性改變，所形成的NFTs數(shù)量與患者癡呆程度相關(guān)[3]，因此，通過(guò)抑制Tau的過(guò)度磷酸化應(yīng)該是治療AD的關(guān)鍵。糖原合酶激酶3(glycogen synthase kinase 3,GSK-3)是一種多功能絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，包含GSK-3α和GSK-3β兩種異構(gòu)體。其中GSK-3β在促進(jìn)Tau蛋白異常過(guò)度磷酸化、毒性Aβ的產(chǎn)生、營(yíng)養(yǎng)不良性神經(jīng)炎和神經(jīng)元受損過(guò)程中都起著非常重要的作用[4]，并通過(guò)PI3K/Akt信號(hào)通路發(fā)揮作用[4]。因此，尋找能影響其活性的藥物便成為防治AD的重要研究途徑。

傳統(tǒng)中藥在防治AD方面具有不可替代的優(yōu)勢(shì)，因此有必要進(jìn)行深入研究以尋找較為有效的中藥及其有效成分。頭頂一顆珠(TrilliumTschonoskiiMaxim, TTM)為百合科延齡草屬植物，為傳統(tǒng)土家中藥，多產(chǎn)于鄂西山區(qū)，為當(dāng)?shù)厮拇笊袼幹?，主要功效為?zhèn)靜安神、活血止血、祛痰除瘀等[5]。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，TTM具有潛在的治療AD作用[6]，并有抗氧化、延緩衰老之療效[6]。因此，有必要針對(duì)TTM對(duì)AD的防治作用進(jìn)行深入研究，并掌握其詳細(xì)作用機(jī)制，促進(jìn)該藥開發(fā)利用。

1 材料與方法

1.1藥物與試劑TTM購(gòu)自湖北華潤(rùn)新龍(恩施)醫(yī)藥有限公司，并經(jīng)專家文德鑒副教授鑒定。根據(jù)臨床用藥人的劑量(60 kg)為標(biāo)準(zhǔn)，文獻(xiàn)記載[5]TTM臨床標(biāo)準(zhǔn)劑量為5～6 g，每人用藥劑量為0.083 g·kg-1·d-1，成人與大鼠的折算系數(shù)為6.25，其相對(duì)于人的臨床用量大鼠等效劑量為0.083×6.25=0.5 g·kg-1·d-1。換算成大鼠(250 g為標(biāo)準(zhǔn)體質(zhì)量)的低、中、高劑量分別為0.125、0.25、0.5 g·kg-1·d-1，換算根據(jù)《藥理實(shí)驗(yàn)中動(dòng)物間和動(dòng)物與人體間的等效劑量換算》進(jìn)行計(jì)算。其水煎液制備方法：稱量20 g TTM，提前1 d水充分浸泡，d 2加適量水煎煮1 h，煎煮2次，合并藥液，紗布過(guò)濾，再低速離心棄底下沉淀物，得到上清液，再濃縮定量至0.2 kg·L-1的溶液，保存?zhèn)溆?。GF-109203X (GFX)：英國(guó)Tocris公司；Wortmannin (WT)：美國(guó)Millipore公司；超敏二步法免疫組化檢測(cè)試劑盒：中國(guó)北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；GSK-3β抗體：美國(guó)Cell Signaling Technology公司；S9-GSK-3β、pT205、pT231、pS262、pT356、pS396、pS404抗體：美國(guó)SAB公司；Tau-5抗體：美國(guó)Abcam公司；β-actin抗體：美國(guó)Proteintech公司；BCA蛋白測(cè)定試劑盒、DAB顯色試劑盒：中國(guó)康為世紀(jì)生物科技有限公司。

1.2儀器DMS-2型Morris水迷宮系統(tǒng)(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所)；大鼠68002雙臂腦定位儀(中國(guó)瑞沃德生命科技有限公司)；099CK5424電動(dòng)勻漿機(jī)(美國(guó)GLAS-COL公司)；FDL-400S超聲儀(中國(guó)凡辛朗科技有限公司)；1510全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司)； Odyssey掃描儀(Licor biosciences，美國(guó)Gene Company)；電泳儀電源、垂直電泳槽、濕轉(zhuǎn)槽(美國(guó)Bio-Rad公司)； VT1200S振蕩切片機(jī)(德國(guó)Leica公司)。

1.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組購(gòu)自湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心的♂SD大鼠，合格證號(hào)42000600003985，該中心許可證號(hào)SCK(鄂)2015-0018。大鼠體質(zhì)量(250±30)g，50只，自由進(jìn)食飲水1周后隨機(jī)分配為5組：假手術(shù)組、AD模型組、高、中、低TTM治療組、每組10只。

1.4AD模型的建立及給藥和Morris水迷宮訓(xùn)練給藥組均按每只SD大鼠體質(zhì)量給予足量TTM的水煎液灌胃7 d，假手術(shù)組和AD模型組則灌胃飲用水7 d。從灌胃d 2開始進(jìn)行水迷宮訓(xùn)練，訓(xùn)練5 d后，尋找能在15 s內(nèi)找到隱藏平臺(tái)的SD大鼠(其搜索軌跡應(yīng)簡(jiǎn)單、筆直)用于以下實(shí)驗(yàn)[7]。訓(xùn)練d 6，再行側(cè)腦室注射WT+GFX各5 μL(將WT和GFX均溶于2% DMSO中，濃度均為100 μmol·L-1)造模[8]。假手術(shù)組給予10 μL的2% DMSO。術(shù)后給予溫暖環(huán)境，待大鼠蘇醒。24 h后立即進(jìn)行Morris水迷宮測(cè)試。其訓(xùn)練和測(cè)試方法均參照文獻(xiàn)[7]，并做適當(dāng)修改。記錄實(shí)驗(yàn)大鼠尋找平臺(tái)的潛伏期和游泳軌跡。

1.5海馬勻漿蛋白Westernblot分析Morris水迷宮測(cè)試完后，立即斷頭取腦，并在冰上快速分離出完整海馬，勻漿后行Western blot(WB)實(shí)驗(yàn)，參照本課題組前期建立實(shí)驗(yàn)方法完成[12-13]。一抗分別為Tau蛋白多個(gè)磷酸化位點(diǎn)(p-Tau)以及GSK-3β、S9-GSK-3β、PKC、PI3K、Akt、突觸囊泡素(Synaptophysin)和突觸素-1(Synapsin-1)等。熒光二抗孵育1 h后，用1×TBST洗滌3次，每次10 min。最后Odyssey掃描成像顯色分析，使用其專有軟件分析灰度值。

1.6腦片免疫組化法(immunohistochemistry,IHC)染色大鼠迷宮測(cè)試完后，7%水合氯醛麻醉大鼠，固定后，參照文獻(xiàn)方法[7]行4%多聚甲醛液灌流內(nèi)固定，取完整大腦后，再用4%多聚甲醛繼續(xù)后固定。振蕩切片機(jī)切完整腦片，保存于含0.02%的疊氮鈉PBS液中備用。取有完整海馬的腦片行IHC法染色，詳見(jiàn)文獻(xiàn)[7]。一抗抗體為Tau蛋白第404磷酸化位點(diǎn)抗體(pS404)(1 ∶100)。結(jié)束實(shí)驗(yàn)后再用中性樹膠封片，顯微鏡下觀察拍照。

1.7腦片尼氏染色(Nisslstaining) 取海馬清楚的完整腦片置于16孔平板中。1×PBS洗滌3次，每次5 min。吸取適量尼氏染色液滴于腦片上，37℃染色10～15 min，ddH2O洗凈，乙醇梯度脫水，二甲苯透明，最后中性樹膠封片，顯微鏡下觀察拍照。

1.8高爾基染色(Golgistaining) 水迷宮測(cè)試完后，上述同樣藥物麻醉，固定后，按參考文獻(xiàn)方法[7]依次用沖洗液、固定液、媒染液體內(nèi)灌流，灌流完畢后，取腦，切開兩個(gè)半球，再橫切成3等份。用新鮮媒染液泡3 d，每天更換新鮮媒染液。3 d后用1.5% AgNO3溶液在搖床里鍍銀，搖晃清洗3次，直至置換出的液體清亮，之后置于暗處鍍銀3 d，每日換新鮮的1.5% AgNO3溶液。在暗處配好2%重鉻酸鉀水溶液，把腦塊置于其中切片，35～40 μm厚度，染色30 min，染色結(jié)束后用雙蒸水清洗1 min×2次，貼片，脫水，透明，封片。

2 結(jié)果

2.1TTM對(duì)AD模型大鼠空間認(rèn)知功能的影響Fig 1水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，注射WT+GFX后，大鼠尋找平臺(tái)的潛伏期與對(duì)照組相比均明顯延長(zhǎng)(P<0.01)，表明該AD模型大鼠空間學(xué)習(xí)記憶力明顯被抑制。而預(yù)先給予低、中、高劑量TTM可明顯改善AD模型大鼠空間學(xué)習(xí)認(rèn)知障礙(P<0.05)，其逃避潛伏期明顯縮短，并具有劑量依賴性(Fig 1A)。同時(shí)，TTM各治療組大鼠其搜尋策略均明顯改善，游泳軌跡接近直線(Fig 1B)。上述結(jié)果表明，不管是低、中劑量的TTM，還是高劑量的TTM均能有效改善WT+GFX激活GSK-3β活性所誘導(dǎo)的大鼠空間學(xué)習(xí)記憶障礙。

2.2TTM對(duì)AD模型大鼠腦海馬組織中GSK-3β活性的影響Western blot結(jié)果顯示(Fig 2A、2B)，AD模型鼠腦海馬中表示非活性狀態(tài)的GSK-3β(GSK-3β第9位絲氨酸被磷酸化，即S9-GSK-3β)表達(dá)比對(duì)照組降低，其與總GSK-3β表達(dá)量的比值明顯下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，表明造模成功。對(duì)比模型組，TTM低、中、高治療組的S9-GSK-3β表達(dá)水平升高，其與總GSK-3β表達(dá)量的比值也升高，并差異具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。結(jié)果表明，低、中、高劑量的TTM均能有效降低GSK-3β活性，且有劑量依賴性。同時(shí)檢測(cè)了PKC、PI3K、Akt等的表達(dá)情況及其磷酸化水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TTM組的p-PKC、p-Akt磷酸化水平比模型組高，說(shuō)明用藥組PKC和Akt活性升高(Fig 2C、2D)，這一結(jié)果提示，TTM能通過(guò)上調(diào)PKC和Akt活性，抑制下游GSK-3β的活性。

Fig 1 TTM prevents rats from WT+GFX induced spatial

A: TTM shortened the escape latency of WT+GFX injected SD rats in a dose-dependent manner; B: TTM improved the swimming pathway which was recorded 24 h after the injection of WT+GFX (after).**P<0.01vscontrol;##P<0.01vsbefore WT+GFX injection;ΔP<0.05vsafter WT+GFX injection.

Fig 2 Effects of TTM on WT+GFX induced overactivation of

A: Western blot results showed the activity of GSK-3β in AD model group increased compared with blank group and TTM inhibited the high activity of GSK-3β induced by WT+GFX; B: TTM up-regulated the level of S9 GSK-3β phosphorylation and the results had statistical significance; C: Western blot results showed the activity of PKC and Akt in AD model group decreased compared with blank group and TTM increased the high activity of PKC and Akt induced by WT+GFX; D: TTM up-regulated the level of T636 PKC phosphorylation and S473 Akt phosphorylation and the results had statistical significance.#P<0.05,##P<0.01vscontrol(DMSO);*P<0.05,**P<0.01vsWT+GFX injection.

2.3TTM對(duì)AD模型大鼠腦海馬Tau蛋白磷酸化的影響為了研究TTM對(duì)海馬Tau蛋白磷酸化的影響，分別進(jìn)行WB和IHC實(shí)驗(yàn)。WB結(jié)果證明，AD模型組Tau蛋白pT205、pT231、pS356、pS396、pS404等5個(gè)位點(diǎn)磷酸化水平高于對(duì)照組，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，P<0.05)。TTM預(yù)處理后，Tau蛋白多個(gè)位點(diǎn)磷酸化水平下降，如pT205、pT231、pS356、pS396、pS404位點(diǎn)均下降，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01和P<0.05)，見(jiàn)Fig 3A、3B。結(jié)果表明，TTM對(duì)AD大鼠腦海馬Tau蛋白磷酸化水平有明顯下調(diào)作用。IHC主要觀察各組海馬區(qū)Tau蛋白第404絲氨酸位點(diǎn)磷酸化水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，模型大鼠海馬CA3和CA1區(qū)其Tau蛋白第404絲氨酸磷酸化水平明顯高于陰性對(duì)照組。而TTM低、中劑量組，CA3和CA1區(qū)Tau蛋白404絲氨酸位點(diǎn)磷酸化水平明顯改善(P<0.01，P<0.05)。這一結(jié)果和WB結(jié)果一致，見(jiàn)Fig 3C、3D。

2.4TTM對(duì)AD大鼠腦海馬突觸蛋白表達(dá)的影響Western blot結(jié)果發(fā)現(xiàn)，低、中、高劑量TTM均能有效促進(jìn)AD大鼠的Synapsin-1、Synaptophysin、GluR-1等突觸蛋白的表達(dá)，其中3個(gè)用藥組Synapsin-1表達(dá)量均高于模型組(P<0.05)，Synaptophysin的表達(dá)增多明顯(P<0.01)，二者具有劑量依賴性。3個(gè)用藥組GluR-1表達(dá)量也明顯增多(P<0.01)，上述結(jié)果差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)Fig 4A、4B。提示不同劑量的TTM可通過(guò)增加AD大鼠突觸蛋白的表達(dá)，達(dá)到改善認(rèn)知功能障礙的目的。

2.5尼氏染色法結(jié)果尼氏小體是顯示神經(jīng)細(xì)胞功能活性的一個(gè)重要指標(biāo)，在神經(jīng)元受到損害時(shí)，尼氏小體會(huì)從核周向外緩慢溶解，發(fā)展至完全消失，但該病變可逆。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，模型組腦海馬CA1和CA3區(qū)神經(jīng)元數(shù)量減少，著色較淺，胞體萎縮并呈空泡狀，尼氏小體明顯減少。但TTM中、高劑量組大鼠腦海馬的CA1和CA3區(qū)尼氏小體數(shù)量增多，胞體飽滿，著色較深，細(xì)胞核大圓，呈劑量依賴性。提示中、高劑量的TTM有助于修復(fù)AD大鼠神經(jīng)元活性，促進(jìn)神經(jīng)發(fā)育(Fig 5A、5B)。

Fig 3 Effects of TTM on WT+GFX induced Tau hyperphosphorylation in SD rat

A: Western blot results showed the level of multiple phosphorylation sites of Tau in AD model group rat hippocampus was observably up-regulated than control group, which could be down-regualted by TTM; B: Western blot results of multiple phosphorylation sites of Tau had statistical significance; C: Immunohistochemistry results showed the level of Tau S404 phosphorylation in AD model group observably increased compared with control group in the area of CA1 and CA3, which could be decreased by TTM; D: The immunohistochemistry results of Tau S404 phosphorylation had statistical significance.#P<0.05,##P<0.01vscontrol (DMSO);*P<0.05,**P<0.01vsWT+GFX injection.

Fig 4 Effects of TTM on WT+GFX induced expression of

A: Western blot research showed the level of synapsin-1, synaptophysin and gluR-1 in AD model group rat hippocampas was down-regulated compared with blank group. Compared with AD model group, TTM up-regulated the level of synapsin-1, synaptophysin and gluR-1; B: TTM up-regulated the level of synapsin-1, synaptophysin and gluR-1 and results had statistical significance.#P<0.05vscontrol (DMSO);*P<0.05,**P<0.01vsWT+GFX injection.

2.6TTM對(duì)AD大鼠海馬神經(jīng)元樹突的影響與模型組相比，高爾基染色結(jié)果顯示，TTM中、高劑量組CA1區(qū)錐體細(xì)胞的頂樹突和基樹突的分支數(shù)增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見(jiàn)Fig 6A、6B。而低、中、高劑量組DG區(qū)顆粒細(xì)胞中軸突長(zhǎng)度明顯增長(zhǎng)，且樹突分支數(shù)明顯增多(P<0.01)，見(jiàn)Fig 6C、6D。以上結(jié)果表明，中、高劑量TTM能明顯增加AD大鼠腦海馬CA1和DG區(qū)樹突復(fù)雜性。另外，TTM中、高劑量組CA1區(qū)錐體細(xì)胞頂樹突三級(jí)分支的樹突棘密度明顯增加(P<0.01)，見(jiàn)Fig 6E；而在DG區(qū)顆粒細(xì)胞中3個(gè)用藥組蘑菇型樹突棘(Fig 6F、6G)密度明顯高于模型組，且呈劑量依賴性(P<0.01)，瘦長(zhǎng)型小棘在中、高劑量組增加(P<0.01)，見(jiàn)Fig 6H。結(jié)果表明，中、高劑量TTM明顯改善AD大鼠海馬區(qū)CA1和DG區(qū)樹突棘密度，中劑量TTM促進(jìn)瘦長(zhǎng)型小棘發(fā)育，高劑量TTM對(duì)蘑菇型小棘和瘦長(zhǎng)型小棘均有明顯促進(jìn)發(fā)育作用。

3 討論

TTM作為土家族特色藥材，具有鎮(zhèn)靜安神、活血化瘀等功效[5]，對(duì)新生大鼠缺血/缺氧腦損傷具有保護(hù)作用[9]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，TTM對(duì)岡田酸 (okadaic acid, OA) 誘導(dǎo)的AD大鼠腦海馬具有抗氧化作用[6]，說(shuō)明該藥對(duì)AD防治具有潛在研究?jī)r(jià)值，有必要深入研究。同時(shí)很多文獻(xiàn)證實(shí)，GSK-3β活性升高是產(chǎn)生NFT和SP的重要原因[6]。因此，有理由認(rèn)為通過(guò)降低GSK-3β活性可成為治療AD希望所在[10]，但目前尚無(wú)特效藥物，部分中藥卻有此作用[11]，有必要在更廣范圍內(nèi)尋找有效藥物。因此，我們構(gòu)建了過(guò)度激活GSK-3β的AD大鼠模型，利用PI3K特異性阻斷劑Wortmannin和蛋白激酶C (PKC) 特異性抑制劑 (GF-109203X, GFX)行側(cè)腦室注射，激活GSK-3β，并引起Tau蛋白異常過(guò)度磷酸化[8]，然后探討TTM能否通過(guò)這一途徑治療AD。

首先，水迷宮結(jié)果發(fā)現(xiàn)，注射WT+GFX導(dǎo)致大鼠空間認(rèn)知功能下降，記憶力減退，而該模型大鼠運(yùn)用低、中、高劑量TTM后，明顯改善了其空間認(rèn)知功能障礙和定向航行能力，此效應(yīng)具有劑量依賴性。該結(jié)果表明，TTM在行為學(xué)方面能有效改善AD大鼠認(rèn)知功能障礙。如前所述，GSK-3β活性升高是導(dǎo)致NFT和SP產(chǎn)生的重要原因，因此，我們首先通過(guò)WB檢測(cè)了GSK-3β活性情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠腦海馬內(nèi)GSK-3β的S9位點(diǎn)磷酸化水平(S9-GSK-3β)下調(diào)，而該位點(diǎn)磷酸化水平代表GSK-3β非活性狀態(tài)[6]，TTM逆轉(zhuǎn)了模型大鼠海馬內(nèi)GSK-3β的S9位點(diǎn)磷酸化水平。這一結(jié)果表明TTM能下調(diào)GSK-3β的活性。在GSK-3β信號(hào)通路中，其活性變化是由其上游激酶PKC、Akt和PI3K進(jìn)行負(fù)性調(diào)節(jié)。因此，我們又檢測(cè)了TTM用藥后該3個(gè)激酶活性，結(jié)果顯示，不同劑量的TTM均能上調(diào)注射了WT+GFX的大鼠腦海馬組織中PKC 和Akt活性。這一結(jié)果提示TTM是通過(guò)上調(diào)PKC和Akt活性，進(jìn)而抑制下游GSK-3β活性。由于Tau蛋白過(guò)度磷酸化在AD中是導(dǎo)致認(rèn)知功能障礙的重要因素，而過(guò)度磷酸化的Tau蛋白對(duì)NTFs數(shù)量和分布影響及認(rèn)知功能缺陷呈正相關(guān)[4-5]。因此，我們又研究了TTM能否通過(guò)改變GSK-3β活性，進(jìn)而下調(diào)模型鼠腦海馬Tau蛋白磷酸化水平。WB和IHC結(jié)果顯示，預(yù)先給予低、中、高劑量TTM后，即使側(cè)腦室注射WT+GFX，也能在腦海馬的Tau蛋白多個(gè)磷酸化位點(diǎn)不同程度地抑制其磷酸化水平，說(shuō)明TTM對(duì)Tau蛋白磷酸化具有防治作用。

Fig5EffectsofTTMonWT+GFXinducedNisslbodiesdecreasedinSDrat

A:Nissl’s staining results showed the number of Nissl’s bodies in neuron cells of hippocampus on hippocampal CA1 and CA3 was obviously fewer than those in control group, which could be markedly increased by TTM; B: Nissl’s staining results of the number of Nissl’s bodies had statistical significance.##P<0.01vscontrol (DMSO);*P<0.05,**P<0.01vsWT+GFX injection.

突觸是傳遞信息的重要組織結(jié)構(gòu)，突觸互相交叉形成大腦信息網(wǎng)絡(luò)，突觸蛋白的表達(dá)對(duì)學(xué)習(xí)記憶有密切聯(lián)系。有研究表明，AD患者腦海馬中突觸相關(guān)蛋白明顯減少[12]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠腦海馬突觸相關(guān)蛋白Synapsin-1、Synaptophysin和GluR-1表達(dá)明顯減少，而TTM用藥組的Synapsin-1、Synaptophysin和GluR-1蛋白表達(dá)比模型組明顯增加，提示TTM能恢復(fù)或保護(hù)突觸結(jié)構(gòu)與功能從而改善學(xué)習(xí)記憶能力。

在細(xì)胞質(zhì)中有特別的細(xì)胞器—尼氏小體。尼氏小體又稱核蛋白體，是合成蛋白質(zhì)的場(chǎng)所。當(dāng)神經(jīng)元受損時(shí)，尼氏小體會(huì)減少甚至消失，這種病理改變是可逆的[13]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，各劑量TTM均能恢復(fù)或保護(hù)尼氏小體，其中又以中、高劑量組為甚，提示TTM能通過(guò)作用于尼氏小體來(lái)修復(fù)或改善大鼠海馬受損的神經(jīng)元。

Fig 6 Effects of TTM on WT+GFX induced dendritic spines decreased in SD rat

A: Golgi staining results showed that the number of apical dendrites and radical dendrites on hippocampal CA1 and DG was obviously less than that in blank group, which could be markedly increased by TTM; B: Golgi staining results of the number of apical dendrites and radical dendrites had statistical significance; C: Golgi staining results showed the length axons and dendritic branches on hippocampal DG was obviously shorter and less than that in blank group, and TTM markedly lengthed axons and increased dendritic branch; D: Golgi staining results of the length axons and dendritic branches had statistical significance; E, F and G: Golgi staining results showed the dendritic spine density in hippocampus on hippocampal CA1 was apparently less than in blank group, the mushroom and slender (thin) dendritic spines density on hippocampus CA1 and DG was apparently less than in blank group, which could be dramatically increased by TTM; H: Golgi staining results of the dendritic spines density and the mushroom and slender (thin) dendritic spines density had statistical significance;##P<0.01vscontrol(DMSO);*P<0.05,**P<0.01vsWT+GFX injection.

樹突是由胞體發(fā)出，由一支發(fā)叉分出多支，表面伸出許多小突起稱為小棘，在AD患者大腦海馬中樹突分支和樹突棘均減少，導(dǎo)致接受刺激減少，引起學(xué)習(xí)記憶功能障礙[14]。在本實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)，AD大鼠海馬中CA1和DG區(qū)運(yùn)用中、高劑量TTM后，其樹突復(fù)雜性明顯增高，說(shuō)明TTM能促進(jìn)樹突發(fā)育。小棘又分成很多類型，有瘦長(zhǎng)型、蘑菇型、豆芽型等，一般把蘑菇型稱為記憶性小棘，瘦長(zhǎng)型稱為學(xué)習(xí)型小棘[15]，目前廣泛認(rèn)為蘑菇型小棘對(duì)學(xué)習(xí)記憶有較大的促進(jìn)作用，有研究發(fā)現(xiàn)，瘦長(zhǎng)型小棘對(duì)學(xué)習(xí)記憶的促進(jìn)作用比蘑菇型更有效、更穩(wěn)定[15]。本實(shí)驗(yàn)Golgi染色結(jié)果顯示中、高劑量TTM明顯增加CA1和DG區(qū)樹突棘數(shù)量，中劑量組瘦長(zhǎng)型樹突小棘增加更明顯，而高劑量組蘑菇型增加更明顯，可能不同劑量的藥物對(duì)不同類型的小棘影響各異，但均能改善樹突可塑性。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)眾多結(jié)果提示，TTM對(duì)GSK-3β誘導(dǎo)的AD模型大鼠腦海馬組織中Tau蛋白磷酸化、神經(jīng)發(fā)育及突觸相關(guān)蛋白表達(dá)等方面均有明顯的防治作用，同時(shí)還可促進(jìn)海馬組織內(nèi)樹突發(fā)育的復(fù)雜性和尼氏體修復(fù)，最終達(dá)到改善AD模型大鼠學(xué)習(xí)記憶功能。這些發(fā)現(xiàn)為AD治療提供一種新的藥物選擇，也可為TTM的開發(fā)利用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和基礎(chǔ)資料。

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