李 穎， 黎 立，李俊玲， 張俊忠， 王世立

(1. 山東中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，山東 濟南 250011;2. 天津市安定醫(yī)院，天津 300222；3. 濟南大學、山東省醫(yī)學科學院醫(yī)學與生命科學學院，山東 濟南 250022 ；4. 山東省醫(yī)學科學院山東省醫(yī)藥生物技術研究中心，山東 濟南 250062)

骨折固定的穩(wěn)定性決定了骨折端的力學環(huán)境，力學環(huán)境是影響骨折愈合的重要因素之一。骨折斷端絕對穩(wěn)定并不利于骨折愈合，而在應力下骨折端適度的微動既能促進骨折愈合，又能恢復關節(jié)功能[1]。但是，骨斷端的力學環(huán)境對骨折愈合產(chǎn)生影響的細胞和分子機制尚不清楚。在本課題組的前期研究[2]中，初步探索了在骨折愈合的早期，不同力學環(huán)境對間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells ，MSCs)在骨折斷端的募集所產(chǎn)生的不同影響，印證了不同力學環(huán)境對骨折愈合的影響是與其影響MSCs的募集有關的。為進一步研究力學環(huán)境影響骨折愈合的相關機制，本實驗以股骨骨折大鼠，以不同剛度系數(shù)的外固定架固定，進而使骨折端產(chǎn)生不同的力學環(huán)境，從MSCs分化的角度探索骨斷端的力學環(huán)境對骨折愈合產(chǎn)生的影響。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 SD大鼠，♂，SPF級，體質(zhì)量(280～300) g，購自山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司實驗動物中心，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(魯)2015-0017。

1.1.2試劑 RNase-free water(武漢博士德)，One-step SYBR RT-PCR試劑盒(TaKaRa)，TRIzol(Invitrogen)，Runx2兔抗大鼠一抗(Cell Signaling Technology)，Sox9兔抗大鼠一抗(Abcam)。

1.1.3儀器 TDL-40B臺式離心機(飛鴿)，WDW-5H生物力學測試機(濟南華興)，KD-T53全自動脫水機、KD-BL冷凍包埋臺、KD-BM石蠟包埋臺、KD-P攤片機(浙江金華科迪)，HM315切片機(Microm)。

1.2動物模型的構(gòu)建將大鼠隨機分為低剛度外固定架組、高剛度外固定架組以及對照組(安裝超高剛度外固定架)，麻醉大鼠用腹腔注射戊巴比妥鈉(30 mg·kg-1)，腹面朝上固定于手術臺，暴露股骨干，3組大鼠股骨分別安裝超高、高、低剛度外固定架。外固定架(Fig 1)由4枚鋼針和橫梁組成，鋼針的間距為5 mm，低、高、超高剛度固定架的鋼針直徑分別為0.5 mm、1.0 mm、1.2 mm。骨折區(qū)為小鋼鋸及剪刀制作的1 mm骨缺損，術后縫合肌肉、皮膚，并使大鼠自由活動。術后3 d內(nèi)，注射頭孢唑啉鈉(30 mg·kg-1)防止感染發(fā)生，給予每日常規(guī)消毒。實驗中所有大鼠均為右側(cè)股骨單側(cè)造模[2]。術后，對經(jīng)外固定架固定的股骨進行生物力學測試，超高、高、低剛度外固定架軸向剛度系數(shù)平均值分別為60.6 N/mm(SD=0.9)、18.2 N/mm(SD=0.3)、8.5 N/mm(SD=0.1)(n=6，剛度系數(shù)的含義為單位時間內(nèi)斷端軸向活動1 mm所需力的大小)，3組外固定架可對骨折區(qū)提供不同的力學環(huán)境。

Fig 1 Representative structure of fracturedfemur (right) with external fixator

1.3影像學觀察骨折愈合情況對照組、高、低剛度組動物分別于術后當天、術后14 d拍攝X線片，觀察股骨骨折愈合情況。

1.4組織學檢查觀察骨折愈合情況術后6周分別取對照組、高、低剛度組的患側(cè)股骨，對骨折的愈合情況做大體觀察，并予以組織病理學檢查，以觀察3組間愈合情況的差異。

1.5骨折斷端MSCs的數(shù)目測定術后2、4、6、10 d取骨折端組織，分離有核細胞，流式細胞術檢測CD29+CD90+細胞占有核細胞比例，并計算骨折端MSCs絕對數(shù)量[2]。

1.6RT-qPCR檢測Runx2、OSX和Sox9的表達術后2、6、10、14 d，3組動物于各時間點取材5只大鼠骨折股骨的骨痂組織，并提取RNA，冰上配制10 μL RT-qPCR反應體系：5 μL 2×Buffer，0.6 μL Taq HS Mix，0.2 μL RTase Mix，上、下游引物各0.4 μL (10 μmol·L-1)，3.4 μL RNA、RNase free water。引物序列見Tab 1。實驗采用一步法對RT-qPCR反應進行擴增，檢測Runx2、OSX、Sox9的表達水平，每個樣品重復3次。擴增條件：42℃預變性5 min，95℃變性15 s，60℃退火20 s，65℃延伸15 s，共42個循環(huán)。最后72℃延伸10 min，5℃終止反應。根據(jù)RT-qPCR反應的CT值，由2-△△CT法，計算最終結(jié)果。

Tab1PrimersusedforRT-qPCR

GenePrimer sequenceProduct/bpRunx2F: 5'-TTCACAAATCCTCCCCAAG-3'124R: 5'-GGCGGTCAGAGAACAAACT-3'Sox9F: 5'-CAGACCAGTACCCGCATC-3'84R: 5'-TCTTCTCGCTCTCGTTCA-3'OSXF: 5'-ACAAGGCGGGCATCCA-3'193R: 5'-GCAAAGTCAGACGGGTAAG-TAG-3'GAPDHF: 5'-CATCCCAGAGCTGAACG-3'181R: 5'-CTGGTCCTCAGTGTAGCC-3'

1.7Westernblot法檢測Runx2和Sox9的表達蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測成骨、成軟骨相關蛋白Runx2和Sox9的表達，分別于術后2、6、10、14 d處死大鼠，取骨折斷端組織，液氮研磨， RIPA裂解液裂解，提取組織總蛋白，使用BCA法測定蛋白質(zhì)濃度。SDS-PAGE電泳分離蛋白，PVDF膜電轉(zhuǎn)移，含5%脫脂奶粉的TBST封閉，一抗(兔抗大鼠Runx2和Sox9)以及HRP標記的山羊抗兔IgG單克隆抗體過夜孵育。洗膜后，以LAS4000mini化學發(fā)光成像儀顯影。

2 結(jié)果

2.1影像學結(jié)果術后當天和2周對對照組、高、低剛度外固定架組攝X線片。Fig 2結(jié)果顯示，術后2周低剛度外固定架組骨痂量明顯多于高剛度外固定架組，高剛度組骨痂量明顯多于對照組。低剛度外固定架組骨折愈合速度較快。

2.2組織學觀察如Fig 3所示，術后6周，對照組、高剛度組新生骨痂鏈接骨折斷端，骨痂致密生長良好，骨細胞活躍；低剛度組大鼠組織學表現(xiàn)較為豐富，在股骨干增粗處均是新生骨，骨細胞較多且活躍，表現(xiàn)膜內(nèi)成骨；骨折端軟骨鏈接，軟骨成骨活躍，形成了明顯的肥大區(qū)和成骨區(qū)，在與正常骨組織接觸處形成了軟骨成骨的骨痂組織，骨折間隙有大量的軟骨細胞和纖維組織。

2.3骨折斷端MSCs的數(shù)目測定如Fig 4所示，術后2、4、6、10 d，高、低剛度組MSCs數(shù)量均明顯高于對照組(P<0.01，P<0.05)；術后2、4、6、10 d，低剛度組MSC數(shù)量明顯高于高剛度組(P<0.01，P<0.05)。

2.4RT-qPCR檢測Runx2、Osterix(OSX)及Sox9的表達如Fig 5所示，對照組和模型組Runx2 mRNA的表達隨時間變化均表現(xiàn)出增加趨勢。6、10、14 d時與對照組相比，模型組表達均明顯增加(P<0.05或P<0.01)；與高剛度組比較，低剛度組增加更為明顯(P<0.01)。OSX mRNA表達水平，對照組和模型組隨著愈合時間增加也呈現(xiàn)升高趨勢，術后6 d內(nèi)升高相對緩慢。2、6、10、14 d時，模型組與對照組比較增加明顯(P<0.05或P<0.01)；2、6 d時，兩模型組差異不明顯(P>0.05)；10 、 14 d時，與高剛度組相比，低剛度組增加更為明顯(10d，P<0.05；14d，P<0.01)。Sox9 mRNA表達水平，對照組和高剛度組10 d內(nèi)呈增加趨勢，14 d時有所下降，低剛度組則14 d內(nèi)持續(xù)升高。同一時間點，模型組與對照組相比均明顯增加(P<0.05或P<0.01)，而6、10、14d低剛度組明顯高于高剛度組(P<0.05或P<0.01)。

Fig 2 X ray on postoperative 0 day and 2 weeks after operation A, B, C: Sham group, high stiffness and low stiffness external fixator group on postoperative 0 day; D, E, F: Sham group, high stiffness and low stiffness external fixator group of 2 weeks after operation.

Fig 3 The pathological slices of callus tissues 6 weeks after operation(HE staining,×40)A: Sham group; B: High stiffness group; C: Low stiffness group

Fig 4 Number of MSCs in fracture bone end(n=4)

*P<0.05,**P<0.01vssham group;#P<0.05,##P<0.01vshigh stiffness group

2.5Westernblot檢測相關蛋白表達情況低剛度組Runx2 蛋白表達水平如Fig 6所示， 2～14 d Runx2的表達呈現(xiàn)增加趨勢，與RT-qPCR結(jié)果相一致。隨著時間增加，各時間點對照組和模型組均有增加趨勢(Fig 7)。2 d時，對照組表達量較低，高、低剛度組表達相對較多(P<0.05)；6 d時，低剛度組表達增加明顯(P<0.01 vs 對照，P<0.05vs高剛度組)；10 d時，低剛度組較其他兩組表達增加且差異明顯(P<0.05)；14 d時，模型組比對照組表達明顯增加(低剛度組P<0.01，高剛度組P<0.05)，低剛度組與高剛度組相比增加亦較明顯(P<0.05)。

Sox9 蛋白表達水平如Fig 8所示，低剛度組14 d內(nèi)呈現(xiàn)增加趨勢，高剛度組10 d內(nèi)表達遞增，14 d時有所下降。如Fig 9所示，2 d時，與其余兩組相比，低剛度組的表達較高(P<0.05)；6 d時，低剛度組與對照組相比較，增加明顯(P<0.01)，與高剛度組相比較，亦明顯較高(P<0.05)；10 d時，模型組對比對照組均表達較高，差異有顯著性(P<0.05)；14 d時，高剛度組相較于對照組表達較高(P<0.05)，低剛度組表達比高剛度組更高(P<0.01)。

Fig 5 Expression of Runx2(A), OSX(B), Sox9(C) in different groups(n=5)

*P<0.05,**P<0.01vssham group;#P<0.05,##P<0.01vshigh stiffness group

3 討論

骨折端力學環(huán)境是影響骨折愈合重要因素之一。固定器剛度與肢體應力是影響骨折端力學環(huán)境最大的可變因素。因此量變固定器剛度與調(diào)節(jié)肢體應力都會影響骨折端的力學環(huán)境，而依靠動物體內(nèi)環(huán)境產(chǎn)生力學刺激的方法，其優(yōu)勢在于能真實地模擬骨折時體內(nèi)的力學環(huán)境。在研究定量應力影響骨折愈合的體內(nèi)實驗研究中，采用精準量變固定器剛度的間接方法的研究結(jié)果比調(diào)節(jié)大鼠肢體應力的結(jié)果可能更可靠、更準確。研究報道，大鼠行走時骨斷端所受應力大小是可測的[2]，本實驗中所選用的大鼠股骨骨折模型，能夠根據(jù)大鼠行走時其股骨上的應力數(shù)據(jù)值，進一步結(jié)合文獻[2]有關微動大小、軸向壓力值與骨折愈合的關系，更好地還原人骨折手術時骨折斷端的微動狀態(tài)。骨折愈合早期，骨折端所處力學環(huán)境的不同，會給骨折愈合的進度及預后帶來不同的影響。我們發(fā)現(xiàn)，股骨骨折大鼠斷端處于強度較高的力學固定時，2周后影像學檢查發(fā)現(xiàn)，患處股骨生成的骨痂量明顯少于處于低固定強度的骨折股骨；同時，先前研究[2]在骨折愈合早期，在低剛度組骨折斷端募集的MSCs的數(shù)量，要遠大于骨折斷端給予高剛度固定者。這也驗證了低剛度組的力學環(huán)境下，動物骨折斷端存在的微動效應促進了骨痂的生長，促進了骨修復的速度，而不同的力學環(huán)境影響對骨折早期的愈合作用與骨斷端MSCs的募集緊密相關的。

Fig 6 Expression of Runx2 in low stiffness group(n=5)

*P<0.05vs2 d;##P<0.01vs6 d ;△△P<0.01vs10d

Fig 7 Expression of Runx2 at different time points(n=5)

A: 2 d; B: 6 d; C: 10 d; D: 14 d.*P<0.05,**P<0.01vssham group;#P<0.05vslow stiffness group

Fig 8 Expression of Sox9 in low stiffness group(A) andhigh stiffness group(B) (n=5)

*P<0.05vs2 d;##P<0.01vs6 d;△△P<0.01vs10 d

研究顯示[4-5]，Runx2、OSX是MSCs向成骨分化過程中極為重要的2個轉(zhuǎn)錄因子。其中，Runx2對于MSCs成骨分化屬于控制基因[6]，OSX在Runx2的下游對MSCs的成骨分化過程進行調(diào)控[7-8]。Sox9是MSCs向軟骨細胞系轉(zhuǎn)化的主控轉(zhuǎn)錄因子，對于軟骨細胞譜系的生成及軟骨特異性蛋白的表達是必不可少的[9]。所以，Runx2、OSX、Sox9的表達水平可以作為MSCs分化方向的直接參考[10]。在本實驗中，RT-qPCR結(jié)果顯示，在術后14 d內(nèi)對照組及高、低固定剛度組大鼠，骨折斷端組織中Runx2的表達隨愈合時間延長而遞增；6 d內(nèi)OSX表達較少，10～14 d亦呈升高趨勢。同一時間點3組間進行比較發(fā)現(xiàn)，減弱固定強度，即增加骨斷端微動，Runx2、OSX表達量上升。Sox9的表達在對照組及高剛度組中 ，2～10 d遞增，14 d略減少；而低剛度組則在14 d內(nèi)呈現(xiàn)遞增趨勢。Western blot結(jié)果顯示，Runx2的表達隨愈合時間增加，3組均逐漸增多。術后同一時間點，模型組的表達均高于對照組，且低剛度組的表達高于高剛度組。與RT-qPCR結(jié)果基本相一致。Sox9的表達亦與RT-qPCR結(jié)果相一致，即對照組和高剛度組術后10 d內(nèi)呈升高趨勢，14 d時略有所下降，而低剛度組則在術后14 d內(nèi)一直隨愈合時間增加而升高。

Fig 9 Expression of Sox9 at different time points(n=5)

A: 2 d; B: 6 d; C: 10 d; D: 14 d.*P<0.05,**P<0.01vssham group;#P<0.05,##P<0.01vslow stiffness group

隨著固定強度減弱，骨折斷端微動增多，成骨和成軟骨基因Runx2、OSX的表達都較固定強度高者更為活躍，證明微動促進了骨折斷端MSCs的成骨分化；而Sox9的表達水平的升高，證明微動加速了骨折股骨軟骨內(nèi)骨化的進度，激動了MSCs向軟骨細胞系的分化。成骨細胞和軟骨細胞的共同增殖及積累，在愈合進度上表現(xiàn)為骨結(jié)痂的大量生成。

綜合RT-qPCR和Western blot的結(jié)果，可以看出，表明成骨和成軟骨基因、蛋白的表達均存在固定剛度的差異，低剛度固定高于高剛度固定。在愈合進度上，大鼠骨折愈合早期，高剛度組10 d后成軟骨表達減少，低剛度組表達仍增多，說明固定剛度低使得骨折處愈合速度加快，但另一方面，如若固定剛度過低可能會導致軟骨細胞向成骨轉(zhuǎn)化這一過程有所延遲，最終可能導致軟骨鏈接的發(fā)生。這也在一定程度上解釋了本實驗中對低剛度組骨痂進行組織學檢查，其結(jié)果出現(xiàn)軟骨連接，而高剛度組6周后已完成骨性鏈接的原因。

綜上，本研究從力學環(huán)境對骨斷端MSCs分化的角度解釋了骨斷端力學環(huán)境對骨折愈合的影響——適量的量變應力促進骨折的愈合，這對臨床上通過控制調(diào)節(jié)肢體應力促進骨折二期愈合、避免骨折并發(fā)癥的發(fā)生提供了一定理論依據(jù)。

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