樊逸云，唐培宸，顧欣霞，張 鑫，孫 瑩，余伯成，張曉燕，葛曉群

(1. 揚州大學(xué)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室，江蘇 揚州 225001；2. 上海國寶企業(yè)發(fā)展中心，上海 201203)

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，其主要特征是中腦黑質(zhì)致密部(substantia nigra pars compacta，SNpc)多巴胺(dopamine，DA)能神經(jīng)元變性死亡，最終導(dǎo)致DA含量降低[1]。其發(fā)病機制十分復(fù)雜，與細胞凋亡關(guān)系密切[2]。目前，臨床治療的藥物主要緩解患者癥狀，難以從根本上抑制DA能神經(jīng)元的漸進性丟失[3]，因此，尋找能夠阻止PD病程的神經(jīng)保護劑意義重大。

蟲草素(cordycepin，Cor)是從蛹蟲草中分離的一種核苷類化合物，具有廣泛的藥理活性，然而，其對PD的影響報道甚少。Olatunji等[4]和本課題組[5-6]前期研究發(fā)現(xiàn)，Cor可抑制PD模型PC12細胞的損傷和凋亡。然而，Cor是通過何種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路介導(dǎo)了這一效應(yīng)，以及能否在動物體內(nèi)發(fā)揮對DA能神經(jīng)元的保護作用，目前尚未見該方面的研究報道。

多條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與介導(dǎo)了PD黑質(zhì)DA能神經(jīng)元的凋亡[7]，其中，絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPK)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路發(fā)揮了重要作用。體外研究發(fā)現(xiàn)，激活JNK通路可引起DA神經(jīng)元凋亡[8]，在PD患者腦組織中亦發(fā)現(xiàn)p38通路明顯活化[9]，中腦黑質(zhì)部有p-ERK1/2的積聚[10]。為此，本研究利用1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶(1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine，MPTP)制備PD小鼠模型，觀察Cor對中腦黑質(zhì)DA能神經(jīng)元及MAPK信號通路的影響，以進一步探討其神經(jīng)保護作用及機制，為探索PD治療新靶點提供依據(jù)，為Cor作為神經(jīng)保護劑的臨床應(yīng)用提供實驗基礎(chǔ)。

1 材料

1.1實驗動物50只C57BL/6小鼠，♂，體質(zhì)量(20±2)g，購于揚州大學(xué)實驗動物中心，實驗動物生產(chǎn)許可證：SCXK(蘇)2012-0004，使用許可證號：SYXK(蘇)2012-0029。小鼠飼養(yǎng)于溫度為(20±2)℃、相對濕度(60±10)% 的動物房，自由進食水，12 h/12 h光照周期。

1.2藥物與試劑蟲草素(純度99%，上海國寶企業(yè)發(fā)展中心)；MPTP(東京化成工業(yè)株式會社)；DA、二羥苯乙酸(DOPAC)和 高香草酸(HVA)標(biāo)準(zhǔn)品(美國Sigma公司)；TUNEL法細胞凋亡檢測試劑盒、HRP標(biāo)記的二抗(博士德生物工程有限公司)；抗TH、p-p38、p-ERK1/2抗體(美國Abcam公司)；抗JNK1/2和p-JNK1/2抗體(上海生工生物工程有限公司)；抗Bax、Bcl-2、Cleaved caspase-3、p38、ERK1/2、GAPDH抗體(萬類生物科技有限公司)；β-actin抗體(北京博奧森生物技術(shù)科技有限公司)。

1.3儀器大小鼠轉(zhuǎn)棒疲勞測試儀、曠場實驗箱、Super Maze+高通量動物行為實驗分析系統(tǒng)(上海欣軟信息科技有限公司)；Nikon80i正置顯微鏡(日本Nikon公司)；Multiskan FC型酶標(biāo)儀(美國Thermo公司)；5415R型冷凍離心機(德國Eppendorf公司)；電泳儀(美國Bio-Rad公司)；Tanon 5200全自動化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(上海天能科技有限公司)。

2 方法

2.1實驗分組及給藥50只小鼠，隨機分為5組，每組10只。分別為：正常對照組、模型組(MPTP組)、Cor低、中、高劑量組(2.5、5.0、10.0 mg·kg-1)。Cor用生理鹽水溶解，給藥劑量由預(yù)實驗確定，灌胃給藥。MPTP(30 mg·kg-1)溶于生理鹽水，腹腔注射給藥[11]。對照組d 1～15灌胃生理鹽水，d 4～8注射生理鹽水；模型組d 1～15灌胃生理鹽水，d 4～8注射MPTP；Cor組d 1～15分別灌胃不同濃度Cor，d 4～8注射MPTP。末次給藥結(jié)束后，d 2進行小鼠行為學(xué)檢測。

2.2行為學(xué)檢測

2.2.1曠場實驗 實驗前2 h，將小鼠從動物飼養(yǎng)室移至行為學(xué)檢測實驗室，讓其適應(yīng)實驗室環(huán)境。實驗開始時，將動物放于50 cm×50 cm × 25 cm的曠場內(nèi)，讓其自由活動10 min，記錄小鼠的運動軌跡和運動距離。

2.2.2轉(zhuǎn)棒實驗 小鼠實驗前訓(xùn)練3 d，疲勞轉(zhuǎn)棒儀直徑為3 cm，每只小鼠每天訓(xùn)練300 s。正式實驗時轉(zhuǎn)速設(shè)定300 s內(nèi)，由4 r·min-1逐漸加速到40 r·min-1，記錄小鼠從轉(zhuǎn)軸上跌落的潛伏期。每只重復(fù)3次，每次間隔30 min，取平均值。

2.2.3爬桿實驗 木桿長50 cm，直徑1 cm，頂端固定有直徑2.5 cm的木球，木桿纏紗布以防打滑，記錄小鼠在球上停留的時間(T1),以及小鼠從小球底端爬到桿的底部所需要的時間(T2)。每只重復(fù)3次，每次間隔3 min，取平均值。

2.3HPLC-ECD法檢測紋狀體DA及其代謝產(chǎn)物含量行為學(xué)測定結(jié)束后，每組取6只小鼠，斷頭取腦，在冰上迅速取出同一側(cè)紋狀體稱重，每1 mg組織加10 μL勻漿液，超聲勻漿。于4℃、20 000 r·min-1離心20 min，取上清液，-80℃保存?zhèn)溆?。HPLC-ECD檢測紋狀體組織中DA、DOPAC、HVA的含量。

2.4免疫組織化學(xué)法檢測TH陽性細胞行為學(xué)測定結(jié)束后，每組取3只小鼠，麻醉后用4%多聚甲醛心臟灌流，斷頭取腦，放入4%的多聚甲醛中繼續(xù)固定，之后常規(guī)石蠟包埋。根據(jù)小鼠腦立體定位圖譜進行冠狀連續(xù)切片，片厚4 μm，切片分組收集。采用免疫組化SABC法，在光鏡下對SNpc區(qū)域觀察并拍照，每只小鼠重復(fù)觀察3張切片，用Image plus 6.0圖像分析軟件，選擇有清晰細胞輪廓帶有明顯核仁的神經(jīng)元進行計數(shù)，定量分析SNpc區(qū)域TH陽性細胞。

2.5TUNEL法檢測細胞凋亡采用TUNEL法，按試劑盒方法操作。光鏡下觀察SNpc區(qū)域，每只小鼠重復(fù)觀察3張切片，計數(shù)每張切片SNpc區(qū)5個高倍視野的陽性細胞，每只小鼠3張切片陽性細胞數(shù)的平均值為該只小鼠凋亡細胞數(shù)。

2.6Westernblot法檢測相關(guān)蛋白的表達6只小鼠取出紋狀體后，分離黑質(zhì)組織，取其中3只小鼠的黑質(zhì)組織,按比例加入新鮮配制的RIPA裂解液進行勻漿，4℃、10 000 r·min-1離心15 min，收集上清于-80℃保存?zhèn)溆?。BCA法進行蛋白含量測定。以30 μg蛋白進行SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)印，封閉，加入一抗(Bcl-2、Bax、Cleaved caspase-3、p38、p-p38、ERK 1/2、p-ERK 1/2、JNK 1/2、p-JNK 1/2)4℃過夜。TBST洗膜后，加入二抗4℃孵育4 h，洗膜后用ECL法顯影，使用Image J軟件進行灰度分析。

3 結(jié)果

3.1Cor對PD小鼠運動功能的影響

3.1.1曠場實驗 曠場實驗是目前評價小鼠運動功能和精神狀態(tài)最常用的方法之一。與對照組相比，模型組小鼠的運動總路程明顯減少(P<0.01)；與模型組相比，除低劑量外，中、高劑量Cor預(yù)處理后，小鼠的運動總路程均明顯增加(P<0.01)，自發(fā)活動能力得以改善(Fig 1A)。

3.1.2轉(zhuǎn)棒實驗 轉(zhuǎn)棒實驗主要用來觀察小鼠的肌張力和平衡協(xié)調(diào)能力。與對照組相比，模型組小鼠在滾筒上滯留的時間明顯縮短(P<0.01)，且出現(xiàn)肌肉無力、不喜運動等現(xiàn)象，說明小鼠運動平衡功能受損嚴重；與模型組相比，Cor組小鼠的滯留時間有延長的趨勢，中、高劑量Cor組效果明顯(P<0.01)，一定程度提高了小鼠的肌張力及運動平衡能力(Fig 1B)。

3.1.3爬桿實驗 爬桿實驗是常用的評價MPTP模型小鼠動作遲緩的方法，爬桿動作需要姿勢調(diào)整及平衡協(xié)調(diào)能力的共同參與。模型組小鼠在球上停留的時間(T1)和爬完全桿的時間(T2)均較對照組明顯延長(P<0.01)。與模型組相比，不同劑量Cor干預(yù)后，T1均明顯縮短(P<0.01)，T2與T1結(jié)果趨勢相似，除Cor低劑量組差異無顯著性，其余組均明顯縮短(P<0.05，P<0.01)，改善了小鼠運動遲緩，提高了身體協(xié)調(diào)性(Fig 1C)。

Fig 1 Effects of cordycepin on motor functions of

A: The movement distance of mice in the open-field; B: The retention time of mice on the rotating rod; C: Pole test of mice.**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vsMPTP

3.2Cor對PD小鼠紋狀體DA及其代謝產(chǎn)物含量的影響與對照組比較，模型組小鼠紋狀體內(nèi)DA含量明顯降低(P<0.01)，其代謝產(chǎn)物DOPAC、HVA含量也出現(xiàn)明顯下降(P<0.01)。與模型組比較，各Cor組小鼠紋狀體內(nèi)DA、DOPAC、HVA含量均明顯升高(P<0.05，P<0.01)，見Tab 1。

Tab 1 Effects of cordycepin on DA and its metabolitesin striatum of MPTP-induced mice n=6)

**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vsMPTP.

3.3Cor對PD小鼠黑質(zhì)TH陽性細胞數(shù)的影響對照組小鼠SNpc區(qū)可見大量排列整齊的TH免疫陽性神經(jīng)元，細胞飽滿，呈梭形或錐體形，軸突和樹突交織的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)清晰完整。與對照組相比，模型組小鼠SNpc區(qū)TH免疫陽性細胞明顯減少(P<0.01)，神經(jīng)元胞體皺縮，軸突和樹突丟失嚴重；與模型組相比，Cor低、中、高劑量組小鼠SNpc區(qū)TH免疫陽性細胞丟失程度均明顯減輕(P<0.01)，其中Cor低劑量組神經(jīng)元皺縮情況有所改善，但軸突和樹突丟失依然明顯，Cor中、高劑量組神經(jīng)元胞體較為飽滿，軸突和樹突的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)損傷不明顯，以Cor高劑量組最為清晰完整(Fig 2、Tab 2)。

Tab 2 Effects of cordycepin on TH-immunoreactivecells and TUNEL-immunoreactive cells in SNpc of

**P<0.01vscontrol;##P<0.01vsMPTP

3.4Cor對PD小鼠黑質(zhì)DA神經(jīng)元凋亡的影響對照組僅見極少量的TUNEL染色陽性細胞，而模型組可見大量棕黃色TUNEL染色陽性細胞，細胞核皺縮，形態(tài)不規(guī)則。Cor干預(yù)后，各組TUNEL染色陽性細胞較模型組均明顯減少(P<0.01)，見Fig 3、Tab 2。

3.5Cor對凋亡相關(guān)蛋白表達的影響如Fig 4所示，與對照組相比，MPTP模型小鼠SN中Bax和Cleaved caspase-3蛋白表達明顯增加，Bcl-2蛋白表達和Bcl-2/Bax比值明顯降低，且差異均具有顯著性(P<0.01)；Cor干預(yù)后可以逆轉(zhuǎn)上述現(xiàn)象，Bax和Cleaved caspase-3蛋白表達降低，Bcl-2蛋白表達和Bcl-2/Bax比值均升高，其中Cor中、高劑量組作用明顯(P<0.01)。

Fig 2 Effects of cordycepin on TH-immunoreactive cells in SNpc of MPTP-induced mice (×100)

A: Control group; B: 30 mg·kg-1MPTP group; C: 2.5 mg·kg-1Cor+MPTP group; D: 5.0 mg·kg-1Cor +MPTP group; E: 10.0 mg·kg-1Cor+MPTP group.

Fig 3 Effects of cordycepin on apoptosis in SNpc of MPTP-induced mice (×400)

A: Control group; B: 30 mg·kg-1MPTP group; C: 2.5 mg·kg-1Cor +MPTP group; D: 5.0 mg·kg-1Cor +MPTP group; E: 10.0 mg·kg-1Cor+MPTP group.

3.6Cor對MAPK通路蛋白表達的影響如Fig 5所示，各組間p38、ERK1/2、JNK1/2蛋白表達均無明顯變化。與對照組相比，模型組小鼠黑質(zhì)中p-p38、p-ERK1/2及p-JNK1/2蛋白表達均明顯增加(P<0.01)；與模型組相比，除Cor低劑量組p-p38和p-JNK表達無明顯差異外，其他各組p-p38、p-ERK1/2、p-JNK1/2蛋白表達均明顯減少(P<0.05，P<0.01)。

4 討論

PD患者的臨床癥狀以運動功能障礙為主，其原因是中腦SNpc區(qū)DA能神經(jīng)元變性死亡，導(dǎo)致紋狀體DA含量下降所致。本研究應(yīng)用MPTP成功地模擬了上述變化，并觀察到Cor能改善模型小鼠自主活動減少、運動遲緩和平衡協(xié)調(diào)能力下降的現(xiàn)象。同時，檢測到小鼠SNpc區(qū)TH免疫陽性神經(jīng)元丟失程度明顯減輕，紋狀體DA、DOPAC、HVA含量明顯升高。有研究發(fā)現(xiàn)，爬桿實驗結(jié)果與小鼠紋狀體DA濃度高度相關(guān)[12]，這在本實驗中也得到證實。上述結(jié)果表明Cor能夠抑制MPTP-PD小鼠DA能神經(jīng)元損傷，顯示了較好的神經(jīng)保護作用。這一結(jié)果目前尚未見文獻報道。

PD的發(fā)病與細胞凋亡關(guān)系密切。在我們前期的體外實驗中，通過Hoechst 33258核染色、Annexin V-FITC/PI雙染和電鏡實驗發(fā)現(xiàn)，Cor可以抑制魚藤酮(rotenone，Rot)誘導(dǎo)的PC12細胞凋亡[5]。本實驗顯示，模型組小鼠黑質(zhì)區(qū)出現(xiàn)大量TUNEL染色陽性細胞，Cor可以明顯減少其陽性細胞數(shù)量，提示Cor在體內(nèi)、體外均可抑制DA能神經(jīng)元凋亡。細胞凋亡過程受到一系列凋亡蛋白的控制，其中Bcl-2家族和caspase家族最具代表性。Bcl-2家族中抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax是細胞凋亡的主要作用蛋白，Bcl-2/Bax比率直接決定了細胞的存亡。caspase-3是caspase家族中最重要的凋亡執(zhí)行者之一，它的活化能夠啟動凋亡級聯(lián)反應(yīng)。本實驗顯示，Cor可以逆轉(zhuǎn)MPTP引起的Bcl-2表達降低，Bax表達增加和caspase-3的活化，提高Bcl-2/Bax比值，發(fā)揮抗凋亡作用。

在哺乳動物體內(nèi)，MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與了細胞增殖、分化、凋亡和應(yīng)激等病理生理過程，主要包括由p38、ERK、JNK介導(dǎo)的3條途徑。本研究發(fā)現(xiàn)，MPTP可以使小鼠黑質(zhì)中p-p38、p-ERK1/2、p-JNK1/2蛋白表達明顯增加。Cor預(yù)處理后抑制了MPTP導(dǎo)致的p38、ERK1/2、JNK1/2蛋白的磷酸化，使其表達明顯減少。既往研究表明，JNK信號通路參與了線粒體介導(dǎo)的細胞凋亡，促進線粒體釋放細胞色素C到胞質(zhì)，激活caspase級聯(lián)反應(yīng)[8]，誘導(dǎo)DA能神經(jīng)元凋亡。另一方面，p38活化后能通過Fas受體途徑介導(dǎo)凋亡[13]。我們在Rot誘導(dǎo)的PC12細胞中發(fā)現(xiàn)，Cor能夠明顯提高線粒體膜電位，減少細胞色素C向胞質(zhì)的釋放，并能下調(diào)Fas蛋白的表達[13]，推測Cor可能是通過抑制p38和JNK1/2的磷酸化，經(jīng)內(nèi)源性和外源性途徑抑制細胞凋亡的。自由基能夠激活ERK1/2，誘發(fā)下游細胞信號分子Bax的表達[14]，并且可以啟動caspase-3活化，導(dǎo)致DA能神經(jīng)元變性丟失[15]。體外研究發(fā)現(xiàn)，Cor能提高PD細胞內(nèi)超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶等抗氧化酶活性，降低細胞內(nèi)活性氧和丙二醛水平[4,6]，據(jù)此推測Cor可能通過清除自由基，減弱氧化應(yīng)激反應(yīng)而抑制ERK1/2的激活，最終減少DA能神經(jīng)元凋亡。當(dāng)然，本研究只是初步結(jié)果，還有待進一步實驗證實。氧化應(yīng)激誘導(dǎo)神經(jīng)細胞凋亡的分子機制十分復(fù)雜，其調(diào)控途徑還包括NF-κB通路、p53通路、PI3K/Akt通路、Nrf2通路等信號通路，Cor是否參與了這些信號通路的調(diào)控，還有待進一步研究。

Fig 4 Effects of cordycepin on protein expressions of apoptosisrelated proteins in SN of MPTP-induced n=3)

**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vsMPTP

Fig 5 Effects of cordycepin on protein expressions ofMAPK signal in SN of MPTP-induced mice n=3)

**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vsMPTP

綜上所述，Cor對MPTP誘導(dǎo)的小鼠DA能神經(jīng)元損傷具有保護作用，其機制可能是通過抑制MAPK的磷酸化水平，下調(diào)Bax表達，上調(diào)Bcl-2表達，以及抑制caspase-3活化，最終抑制DA能神經(jīng)元凋亡。

(致謝：本實驗在揚州大學(xué)醫(yī)學(xué)院大型實驗儀器平臺和藥學(xué)實驗中心完成，感謝課題組全體老師和同學(xué)給予的指導(dǎo)和幫助，同時也感謝南京醫(yī)科大學(xué)江蘇省神經(jīng)退行性疾病重點實驗室為DA含量測定提供的幫助和支持)

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