蘇燕青, 汪旭雯, 王穎崢, 宋百穎, 林 昱, 黃 鑫, 洪桂祝

(福建中醫(yī)藥大學(xué) 1. 藥學(xué)院、2. 康復(fù)技術(shù)工程研究中心,福建 福州 350122)

炎癥反應(yīng)是腦缺血/再灌注損傷的關(guān)鍵性機制[1]。白細胞是機體重要的炎性細胞之一，其黏附并穿越血管內(nèi)皮細胞向炎癥部位移行，成為炎癥的重要標志，黏附分子是白細胞和血管內(nèi)皮細胞表達的產(chǎn)生炎癥反應(yīng)的重要分子基礎(chǔ)。P-選擇素(P-selectin)作為細胞黏附分子家族成員之一，在炎癥發(fā)生時，主要功能是介導(dǎo)白細胞與血管內(nèi)皮細胞、白細胞與血小板之間的黏附，在炎癥早期過程中尤為關(guān)鍵。因此，尋找或合成具有影響P-selectin表達及功能的藥物，將為炎癥發(fā)病機制的揭示及治療提供新的手段。

紅景天苷(salidroside，Sal)是景天科紅景天的主要有效成分，具有保護各個器官免受自由基損傷、增強記憶、改善心血管系統(tǒng)功能、增強免疫、抗疲勞、耐缺氧等多種藥理作用[3]。課題組關(guān)于紅景天苷對腦缺血/再灌注的保護作用主要集中于體內(nèi)研究[3-5]。本實驗在體外模擬缺血/再灌注損傷模型，以人臍靜脈內(nèi)皮細胞(human umbilical vein endothelial cells, HUVECs)氧糖剝奪/復(fù)氧(oxygen-glucose deprivation/reoxygenation, OGD/R)損傷為模型，觀察紅景天苷對OGD/R誘導(dǎo)的 HUVEC損傷的保護作用及其對P-selectin表達的影響。

1 材料

1.1細胞株HUVEC由廈門大學(xué)國家傳染病診斷與疫苗工程技術(shù)研發(fā)中心提供。

1.2試劑紅景天苷(福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院生物醫(yī)藥研發(fā)中心，純度≥99%)；胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)、青霉素-鏈霉素雙抗溶液(penicillin-streptomycin, PS)、DMEM無糖培養(yǎng)基、 0.25%胰蛋白酶(Life Technologies)；DMEM高糖培養(yǎng)基、PBS緩沖溶液(Hyclone)；P-selectin抗體(Santa Cruz)；DAB-0031試劑盒、即用型免疫組化 EliVisionTMplus 試劑盒(福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司)；乳酸脫氫酶(lactic dehydrogenase,LDH)試劑盒、一氧化氮(nitric oxide,NO)試劑盒(南京建成生物技術(shù)有限公司)；MTT(Biosharp)；AnnexinV-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒(上海翊圣生物科技有限公司)。

1.3儀器三氣缺氧培養(yǎng)箱Galaxy 170R(New Brunswick)，CO2培養(yǎng)箱HERACELL 150i(Thermo Scientific)，光學(xué)顯微鏡ECLIPSE TS100-F(Nikon)，低速臺式離心機TDL-50B(上海安亭科學(xué)儀器廠)，多功能酶標儀Infinite M200 Pro(TECAN)，潔凈工作臺SW-CJ-1FD(蘇凈集團蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)，數(shù)碼顯微圖像分析軟件系統(tǒng)Motic Med 6.0(廈門麥克奧迪實業(yè)集團有限公司)，BD facscalibur流式細胞儀(碧迪醫(yī)療器械上海有限公司)。

2 方法

2.1HUVEC的培養(yǎng)HUVEC復(fù)蘇，常規(guī)方法培養(yǎng)于含10% FBS、1% PS的DMEM高糖培養(yǎng)基中，置于37℃、5% CO2及飽和濕度培養(yǎng)箱培養(yǎng)。當細胞長至約80%～90%時，胰酶消化，傳代培養(yǎng)。

2.2HUVEC細胞OGD/R模型的建立將正常培養(yǎng)(含10% FBS、1% PS DMEM高糖培養(yǎng)基)的HUVEC按每孔3×105鋪于6孔板，24 h后生長密度達到80%～85%，用移液槍吸去培養(yǎng)基，加入2 mL 1×PBS清洗1遍，吸掉PBS，換成DMEM無糖培養(yǎng)基(含1% FBS、1%PS)，置于缺氧培養(yǎng)箱(37℃、5.0% CO2、1.0% O2)培養(yǎng)，進行氧糖剝奪培養(yǎng)；氧糖剝奪后，棄去無糖培養(yǎng)基，置于含1% FBS、1% PS的DMEM高糖培養(yǎng)基，正常條件培養(yǎng)24 h。

2.3MTT法檢測HUVEC存活率確定最佳造模時間點HUVEC以每孔1×104密度接種于96孔培養(yǎng)板中，分為正常組(Ctrl)、模型組(OGD/R)、紅景天苷給藥組(Sal 10 μmol·L-1)，分別進行12、16、20 h的造模，缺氧時間達到后，Sal組換成含有10 μmol·L-1紅景天苷的DMEM高糖培養(yǎng)基(1% FBS、1% PS)，繼續(xù)于37℃、5% CO2正常培養(yǎng)箱復(fù)氧24 h。加10 μL MTT(5 g·L-1)，孵育4 h，棄去MTT及培養(yǎng)基，每孔加入200 μL的二甲基亞砜，振蕩10 min，酶標儀在490 nm測定吸光度(A)，計算細胞存活率：細胞存活率=(A實驗組/A對照組)×100%。

2.4細胞培養(yǎng)液中LDH外漏量測定探索最佳給藥濃度取對數(shù)生長期的HUVEC，以每孔1×104密度接種于96孔培養(yǎng)板中，分為正常對照組、OGD/R組、不同濃度紅景天苷組(Sal 0.01、0.1、1、10、100 μmol·L-1)，進行OGD 16 h后，Sal組分別給予紅景天苷繼續(xù)于37℃、5% CO2正常培養(yǎng)箱復(fù)氧24 h。取各組細胞培養(yǎng)液于1.5 mL離心管中，根據(jù)LDH試劑盒說明書操作方法檢測LDH活性，計算公式如下：LDH活性/U·L-1=(測定孔OD值-對照孔OD值)/(標準孔OD值-空白孔OD值)×標準濃度(0.2 mmol·L-1)×稀釋倍數(shù)×1 000。

2.5細胞培養(yǎng)液中NO含量的測定確定最佳給藥濃度取對數(shù)生長期的HUVEC，以每孔1×104密度接種于96孔培養(yǎng)板中，分為正常對照組、OGD/R組、不同濃度紅景天苷組(Sal 0.1、1、5、10 μmol·L-1)，進行OGD 16 h后，Sal組分別給予紅景天苷繼續(xù)于37℃、5% CO2正常培養(yǎng)箱復(fù)氧24 h。收集各組細胞培養(yǎng)液，按照測試盒說明書，采用硝酸還原酶法檢測胞內(nèi)NO的含量，計算公式如下：NO含量/μmol·L-1=(測定孔OD值-空白孔OD值)/(標準孔OD值-空白孔OD值)×標準品濃度(100 μmol·L-1)×稀釋倍數(shù)。

2.6OGD/R對HUVEC形態(tài)的影響取對數(shù)生長期的HUVEC，以每孔3×105接種于6孔培養(yǎng)板，分為正常對照組、OGD/R組、Sal組(10 μmol·L-1)，融合后進行16 h氧糖剝奪，復(fù)氧時Sal組給予含Sal 10 μmol·L-1的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h。在倒置顯微鏡下分別觀察各組HUVEC的細胞生長情況。

2.7AnnexinV/PI法檢測HUVEC凋亡細胞分組及給藥方法同“2.6”，培養(yǎng)結(jié)束后，收集各組細胞，按照測試盒說明書操作，使用流式細胞儀檢測HUVEC凋亡情況。

2.8免疫組化法測定P-selectin蛋白表達水平將已爬好的玻片用PBS浸洗3次；4%多聚甲醛常溫固定20 min；PBS洗3次，滴加5% BSA，室溫封閉1 h，滴加50～100 μL稀釋后的一抗(1 ∶100)，4℃孵育過夜；PBS洗3次，甩干，滴加適量二抗，室溫孵育1 h；PBS沖洗5次，甩干，滴加適量DAB溶液，10～30 s后迅速用PBS蕩洗干凈，滴加Mayer’s蘇木精，復(fù)染1.5～2 min，自來水中返藍5 min，中性樹膠封片。每張切片200倍鏡下選5個視野，運用數(shù)碼顯微圖像分析軟件系統(tǒng)Motic Med 6.0測量P-selectin的灰度值(灰度值是反映透光密度的定量指標，其與P-selectin的表達量呈負相關(guān)，即灰度值越高，P-selectin蛋白表達量越少)。

3 結(jié)果

3.1最佳造模時間點的確定如Fig 1所示，與正常組相比，HUVEC在OGD 16、20 h細胞活力均明顯降低(P<0.01)；與OGD/R組比較，Sal組細胞活力在16 h增高(P<0.05)。因此，確定HUVEC細胞OGD模型的最佳造模時間點為16 h。

Fig 1 Effect of salidroside on activity of HUVECs after OGD/R

##P<0.01vsnormal control;*P<0.05vsOGD/R

3.2紅景天苷對OGD/R后HUVEC中LDH活力的影響如Fig 2所示，OGD/R組細胞LDH漏出率明顯增加(P<0.01)；與OGD/R組比較，Sal組(1、10、100 μmol·L-1)細胞培養(yǎng)液LDH漏出率明顯降低(P<0.05)，說明紅景天苷能減少HUVEC細胞OGD/R損傷模型LDH的釋放，且10 μmol·L-1的濃度效果最好(P<0.01)。

Fig 2 Effect of salidroside on LDH activity of HUVECs after OGD/R

##P<0.01vscontrol;*P<0.05,**P<0.01vsOGD/R

3.3紅景天苷對OGD/R后HUVEC中NO含量的影響如Fig 3所示，與對照組相比，OGD/R組細胞NO含量增加(P<0.01)；與OGD/R組比較，Sal組細胞NO含量降低(P<0.05)，且隨著給藥濃度的增加，NO的含量降低越明顯，在10 μmol·L-1濃度時NO的含量最低。說明紅景天苷能降低HUVEC細胞OGD/R損傷模型NO的含量，并確定Sal 10 μmol·L-1為最佳給藥濃度。

3.4紅景天苷對OGD/R后HUVEC形態(tài)的影響如Fig 4所示，正常培養(yǎng)的HUVEC核清晰，呈圓形或橢圓形，核分裂像多見，核仁、胞質(zhì)豐富，內(nèi)含小顆粒；HUVEC在OGD/R處理后，細胞形態(tài)發(fā)生明顯改變，表現(xiàn)為細胞排列紊亂，明顯梭形化或變?yōu)椴灰?guī)則形，細胞折光率低，胞體皺縮，核仁、胞質(zhì)貧乏，大多數(shù)細胞胞質(zhì)有暗色顆粒；而給藥組經(jīng)10 μmol·L-1紅景天苷處理后，細胞形態(tài)有所改善，細胞不再暗沉，細胞梭形化或不規(guī)則形狀減少，核仁、胞質(zhì)較豐富。

Fig 3 Effect of salidroside on NO content of HUVECs after OGD/R

##P<0.01vscontrol;*P<0.05,**P<0.01vsOGD/R

3.5紅景天苷對HUVEC凋亡的影響如Fig 5所示，與對照組相比，OGD/R組細胞凋亡率升高(P<0.01)；與OGD/R組比較，Sal組(10 μmol·L-1)細胞凋亡率降低(P<0.05)。說明紅景天苷能降低HUVEC細胞OGD/R損傷模型的凋亡率。

3.6紅景天苷對HUVEC中P-selectin蛋白表達的影響如Fig 6所示，正常狀態(tài)下，HUVEC表達P-selectin較弱，主要分布于核膜周圍；在OGD/R處理后，P-selectin的陽性表達明顯增多，廣泛分布于核膜、胞質(zhì)及胞膜周圍，與對照組相比差異有顯著性(P<0.01)；與OGD/R組比較，給予10 μmol·L-1Sal后，細胞P-selectin表達量降低(P<0.01)。說明紅景天苷能降低HUVEC細胞OGD/R損傷模型P-selectin蛋白表達水平。

Fig 4 Effect of salidroside on morphology of HUVECs after OGD/R (×200)A: Control group; B: OGD/R group; C: Sal 10 μmol·L-1 group.

Fig 5 Effect of salidroside on apoptosis of HUVEC after OGD/R

A: Control group; B: OGD/R group; C: Sal 10 μmol·L-1group; D: Statistical results.##P<0.01vscontrol;*P<0.05vsOGD/R.

Fig 6 Effect of salidroside on expression ofp-selectin in HUVECs after OGD/R

A: Control group; B: OGD/R group; C: Sal 10 μmol·L-1group; D: Statistical results.##P<0.01vscontrol;**P<0.01vsOGD/R. Grey level is a quantitative index reflecting light transmission density, which is negatively correlated with the amount of P-selectin expression.

4 討論

炎癥反應(yīng)在腦缺血/再灌注損傷中起著重要作用[1]，炎癥產(chǎn)生的重要過程包括白細胞在血管中的流動、募集、黏附和滲出，而炎癥發(fā)生的重要標志則是以血管反應(yīng)為核心的白細胞滲出[6-7]。炎癥反應(yīng)發(fā)生的最初現(xiàn)象是白細胞與內(nèi)皮細胞的黏附，白細胞在內(nèi)皮細胞的黏附和滲出，導(dǎo)致了組織的破壞與清除，進而產(chǎn)生炎癥。血管內(nèi)皮細胞是機體重要的內(nèi)分泌及靶器官，在維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。有研究表明，作為高活性分子和其他損傷因子作用的重要靶點，內(nèi)皮細胞的損傷活化在缺血/再灌注損傷病理演變過程中起到關(guān)鍵作用[8-9]。選擇素(selectin)為一類可與特定構(gòu)型糖基結(jié)合的單鏈跨膜受體，主要分布在細胞表面，屬于膜蛋白，是參與炎癥反應(yīng)的重要分子，主要在血管系統(tǒng)中起作用[10]。P-selectin主要分布于血小板-α顆粒和內(nèi)皮細胞的Webel-Palade小體中，在巨核細胞、活化血小板和活化的內(nèi)皮細胞上表達，并通過識別其相應(yīng)配體，介導(dǎo)白細胞在內(nèi)皮細胞上的滾動，作為內(nèi)皮細胞和血小板活化的標志，能對炎癥作出早、晚兩期反應(yīng)，其在炎癥過程的早期甚為重要。P-selectin還能刺激單核細胞表達組織因子，從而啟動外源性凝血機制，加重急性炎癥反應(yīng)[11]。

本研究通過對HUVEC體外OGD/R，建立了細胞氧糖剝奪模型，以此模擬體內(nèi)血管內(nèi)皮細胞缺血/再灌注損傷引起腦缺血的病理過程。顯微鏡下觀察，OGD/R處理后，細胞排列紊亂，折光性下降，貼壁功能下降，部分細胞裂解成碎片，最后死亡；給予Sal保護后，細胞不再暗沉，細胞折光性增強，細胞碎片減少。Annexin V/PI檢測結(jié)果表明，紅景天苷組HUVEC凋亡率降低，表明紅景天苷能夠明顯減輕OGD/R引起的HUVEC損傷。LDH是一種細胞內(nèi)標志酶，存在于各種組織細胞的胞質(zhì)中。LDH在正常細胞中釋放較少，但細胞缺糖缺氧時，細胞膜通透性增加，大量的LDH釋放，且LDH釋放量與細胞損傷程度呈正比，故其釋放量的多少可作為反映細胞損傷程度的重要生化指標[12]。本研究測定細胞培養(yǎng)液中LDH 活性來觀察細胞的損傷程度，發(fā)現(xiàn)在造模16 h后，OGD/R組細胞培養(yǎng)液中LDH活性明顯升高，而Sal組LDH降低，提示該時間點Sal可減輕OGD引起的細胞損傷。NO是生物體內(nèi)重要的信使分子和效應(yīng)分子，具有神經(jīng)介導(dǎo)和調(diào)節(jié)的功能，可通過介導(dǎo)興奮性氨基酸毒性、誘導(dǎo)自由基生成、損傷線粒體和DNA、引發(fā)血腦屏障開放等機制，產(chǎn)生神經(jīng)細胞毒性作用，與氧化損傷密切相關(guān)[13]。本研究結(jié)果顯示，缺氧缺糖后HUVEC中NO含量明顯增加，而Sal可濃度依賴性地降低NO含量，提示Sal能夠通過抗氧化作用，發(fā)揮其對OGD損傷細胞的保護作用。本研究還通過免疫組化法觀察了P-selectin的蛋白表達水平，結(jié)果顯示，正常狀態(tài)下HUVEC表達P-selectin較弱，主要分布于核膜周圍，在OGD/R處理后P-selectin的陽性表達明顯增多，廣泛分布于核膜、胞質(zhì)及胞膜周圍。提示在OGD/R作用下，P-selectin在胞膜的大量表達促進了白細胞的黏附作用，并隨著血管通透性增加，通過黏附、浸潤、游走等一系列過程侵入到組織間隙，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)。而經(jīng)過紅景天苷處理后，P-selectin的表達明顯下降。

綜上所述，Sal可改善HUVEC細胞OGD/R引起的形態(tài)變化，且能增加細胞存活率，減少LDH釋放量、降低NO含量、降低P-selectin的表達，表明Sal對OGD/R造成的HUVEC損傷具有保護作用，其機制可能與紅景天苷能夠降低P-selectin的表達，進一步降低血管通透性，減少白細胞黏附并穿越血管內(nèi)皮細胞向炎癥部位移行，從而抑制炎癥反應(yīng)有關(guān)。

(致謝：本實驗在福建中醫(yī)藥大學(xué)藥理學(xué)實驗室完成，感謝各位老師和同學(xué)的幫助與支持。)

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