楊婉琪，賈少博，李栩琳，張 雨，周曉偉，岳正剛，朱承根，石建功，張建軍

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥物研究所藥理室，新藥作用機(jī)制研究和藥效評(píng)價(jià)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100050)

差向異構(gòu)體是指在含有2個(gè)或2個(gè)以上的四面體型手性中心的分子中，只有1個(gè)不對(duì)稱(chēng)原子構(gòu)型不同的非對(duì)映異構(gòu)體。差向異構(gòu)體之間呈現(xiàn)的生物活性往往存在一定的差異，如差向異構(gòu)體鉤藤堿和異鉤藤堿由于肝腸首過(guò)效應(yīng)的差異在降血壓作用上存在差異[1]。天麻作為一種中草藥，具有治療頭痛、偏頭痛、頭暈、癲癇、小兒抽搐、痙攣等傳統(tǒng)功效[2]。通過(guò)與本所植化室石建功研究員課題組合作, 從天麻中提取分離所得到具有強(qiáng)鎮(zhèn)靜催眠作用的有效成分N6-取代腺苷衍生物，本實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)發(fā)現(xiàn)其具有很強(qiáng)的鎮(zhèn)靜催眠作用[3-4]。以此作為先導(dǎo)化合物，經(jīng)結(jié)構(gòu)修飾得到差向異構(gòu)體YZG-330(R型)和YZG-331(S型)，結(jié)構(gòu)見(jiàn)Fig 1。中樞抑制類(lèi)藥物包括全身麻醉藥、鎮(zhèn)靜藥、鎮(zhèn)痛藥及抗驚厥藥。γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)是腦內(nèi)最重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，谷氨酸(glutamic acid，Glu)是GABA的合成底物，其含量與GABA密切相關(guān)[5]。本文對(duì)YZG-330和YZG-331 的中樞抑制活性進(jìn)行評(píng)價(jià)和比較, 初步研究了其對(duì)腦內(nèi)GABA和Glu的影響，探討兩者可能的作用機(jī)制，選擇效果更好的結(jié)構(gòu)，為其進(jìn)一步開(kāi)發(fā)成鎮(zhèn)靜類(lèi)藥物奠定基礎(chǔ)。

Fig 1 Chemical structure of YZG-330(A) and YZG-331(B)

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物ICR小鼠，♂，購(gòu)于北京斯貝福動(dòng)物技術(shù)有限公司，體質(zhì)量(20～22) g, 動(dòng)物生產(chǎn)許可證編號(hào)：SCXK(京)2016-0002。實(shí)驗(yàn)前，動(dòng)物適應(yīng)環(huán)境3 d以上，自由進(jìn)食和飲水，環(huán)境溫度保持在25 ℃。

1.2藥品與試劑差向異構(gòu)體YZG-330和YZG-331由北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥物研究所石建功教授課題組合成；地西泮片劑(批號(hào)20100903，北京益民藥業(yè)有限公司)，用0.1 g·L-1CMC-Na溶液配成相應(yīng)濃度，用CMC-Na溶液作為溶劑對(duì)照。GABA、Glu、戊巴比妥鈉均為Sigma公司產(chǎn)品；甲醇(色譜純)購(gòu)自北京化工廠；其他分析純?cè)噭┚?gòu)自北京化學(xué)試劑公司。

1.3儀器Super Maze動(dòng)物行為分析系統(tǒng)(XR-Xmaze)，購(gòu)于上海欣軟信息科技有限公司；離心機(jī)(3-18KS)，購(gòu)于德國(guó)SIGMA公司；高效液相色譜泵(LC-10A)，購(gòu)于日本島津公司；電化學(xué)檢測(cè)器(LC-4C)，購(gòu)于美國(guó)BAS公司；色譜柱 (Diamonsil?C18，150 mm×4.6 mm, 5 μm)，購(gòu)自北京迪馬科技有限公司；超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)(JY-96)，購(gòu)于寧波新芝生物科技股份有限公司；酶標(biāo)儀(MQX200), 購(gòu)于美國(guó)BioTek公司。

1.4自主活動(dòng)實(shí)驗(yàn)[6-7]♂ICR小鼠，分為8組，每組10只，分別為：溶劑對(duì)照組、地西泮組(5 mg·kg-1)、YZG-330組(0.125、0.5、2 mg·kg-1)、YZG-331組(1.25、5、20 mg·kg-1)。分別灌胃給予溶劑對(duì)照及化合物溶液15 min后，將待測(cè)小鼠放入不透明的單個(gè)方形自主活動(dòng)箱內(nèi)，活動(dòng)箱大小為50 cm×50 cm×40 cm，連續(xù)拍攝動(dòng)物在隨后10 min內(nèi)的活動(dòng)情況，分析統(tǒng)計(jì)其自主活動(dòng)的路程。

1.5協(xié)同閾上劑量戊巴比妥鈉誘導(dǎo)小鼠翻正反射消失實(shí)驗(yàn)[8]♂ICR小鼠，分為8組，每組8只，分別為：溶劑對(duì)照組、地西泮組(5 mg·kg-1)、YZG-330組(0.125、0.5、2 mg·kg-1)、YZG-331組(5、10、20 mg·kg-1)。分別灌胃給予溶劑對(duì)照、地西泮或YZG化合物，15 min后，腹腔注射閾上劑量戊巴比妥鈉 (38 mg·kg-1)，入睡指標(biāo)為翻正反射消失1 min以上，小鼠的入睡潛伏期為從注射藥物開(kāi)始至小鼠翻正反射消失的時(shí)間，小鼠的睡眠持續(xù)時(shí)間為小鼠翻正反射消失至恢復(fù)的時(shí)間。

1.6協(xié)同閾上劑量戊巴比妥鈉誘導(dǎo)小鼠翻正反射再消失實(shí)驗(yàn)♂ICR小鼠，分為8組，分別為:溶劑對(duì)照組、地西泮組(2 mg·kg-1)、YZG-330組(0.125、0.5、2 mg·kg-1)、YZG-331組(5、10、20 mg·kg-1)。腹腔注射戊巴比妥鈉溶液(38 mg·kg-1)，入睡指標(biāo)為翻正反射消失1 min以上，待動(dòng)物翻正反射恢復(fù)，立刻灌胃給予溶劑對(duì)照或各組待測(cè)化合物，觀察動(dòng)物行為，記錄翻正反射再次消失的數(shù)量，計(jì)算各組動(dòng)物的翻正反射再消失率。

1.7高效液相-電化學(xué)法(HPLC-ECD)檢測(cè)化合物YZGs對(duì)腦組織內(nèi)GABA和Glu含量的影響[9]♂ICR小鼠隨機(jī)分為3組，溶劑對(duì)照組、YZG-330(2 mg·kg-1)組、YZG-331(40 mg·kg-1)組，每組10只。灌胃給予CMC-Na溶液或化合物YZG-331后，將其置于安靜環(huán)境中，給藥15 min后脫頸椎取腦，冰上分離大腦皮層和下丘腦，稱(chēng)重。組織中按1 ∶10(W/V)的比例加入預(yù)冷的0.6 mol·L-1高氯酸溶液，利用超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)制備勻漿，4℃、10 000×g離心20 min。取上清液與其1/2體積的緩沖溶液(檸檬酸鉀20 mmol·L-1、EDTA·2Na 2 mmol·L-1、磷酸氫二鉀300 mmol·L-1)混合均勻，4℃、10 000×g離心20 min。取上清液，按1 ∶2的比例加入OPA衍生化試劑，冰上反應(yīng)2 min后進(jìn)樣檢測(cè)。根據(jù)混合標(biāo)準(zhǔn)品，計(jì)算組織內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)的含量，得到Y(jié)ZG化合物相對(duì)于溶劑對(duì)照組引起的含量變化率。檢測(cè)條件：流速1.2 mL·min-1；檢測(cè)靈敏度500 nA；電化學(xué)檢測(cè)器工作站電壓0.6 V。

2 結(jié)果

2.1YZG-330及YZG-331對(duì)小鼠的自主活動(dòng)有抑制作用如Fig 2所示，灌胃給藥后15～25 min內(nèi)，與溶劑對(duì)照組相比，地西泮(5 mg·kg-1)對(duì)小鼠自主活動(dòng)的抑制率為39.0% (P<0.01)；YZG-330 (0.125、0.5、2 mg·kg-1)對(duì)小鼠自主活動(dòng)的抑制率分別為29.4% (P<0.05)、57.0% (P<0.01)和76.5% (P<0.01)；YZG-331 (1.25、5、20 mg·kg-1)對(duì)小鼠自主活動(dòng)的抑制率分別為25.3% (P<0.05)、40.2% (P<0.01) 和71.8% (P<0.01)，均有較明顯的量效關(guān)系。YZG-330和YZG-331抑制自主活動(dòng)的等效劑量相差十倍左右，YZG-330對(duì)自主活動(dòng)的抑制作用強(qiáng)于YZG-331。

2.2YZG-330及YZG-331對(duì)戊巴比妥鈉誘導(dǎo)的小鼠睡眠有延長(zhǎng)作用如Fig 3所示，溶劑對(duì)照組腹腔注射給予戊巴比妥鈉(38 mg·kg-1)后的入睡潛伏期及睡眠時(shí)間分別為(9.1±0.67) min和(51.3±3.2)min。與溶劑對(duì)照組相比，地西泮能夠明顯縮短入睡潛伏期，并能明顯延長(zhǎng)睡眠持續(xù)時(shí)間?；衔颵ZG-330 (0.125、0.5、2 mg·kg-1) 對(duì)入睡潛伏期的縮短率分別為30.7% (P<0.05)、53.0% (P<0.01)、52.5% (P<0.01)；化合物YZG-331(5、10、20 mg·kg-1)對(duì)入睡潛伏期的縮短率分別為45.3% (P<0.01)、50.0% (P<0.01)、56.3% (P<0.01)。YZG-330 (0.125、0.5、2 mg·kg-1) 對(duì)于睡眠持續(xù)時(shí)間的延長(zhǎng)作用表現(xiàn)明顯，延長(zhǎng)率分別為46.9% (P<0.01)、96.7% (P<0.01)、234.6% (P<0.01)；YZG-331 (5、10、20 mg·kg-1)對(duì)睡眠時(shí)間的延長(zhǎng)率分別為8.6%、37.4% (P<0.01)、73.0% (P<0.01)。YZG化合物對(duì)睡眠潛伏期的縮短均無(wú)劑量依賴(lài)性，在劑量相差十倍時(shí)縮短率相近；對(duì)睡眠時(shí)間的延長(zhǎng)YZG-330 (2 mg·kg-1)明顯強(qiáng)于YZG-331 (20 mg·kg-1)。

Fig 2 Effects of YZG-330 and YZG-331 on spontaneouslocomotor activities in n=10)

Mice were orally administered with YZG-330, YZG-331, vehicle or diazepam, and the ambulatory distance was calculated for 10 min.*P<0.05,**P<0.01vsvehicle group.

2.3YZG-330及YZG-331促進(jìn)戊巴比妥鈉誘導(dǎo)睡眠小鼠覺(jué)醒后的再入睡由于戊巴比妥鈉經(jīng)肝藥酶代謝，若YZG化合物對(duì)肝藥酶有抑制作用，戊巴比妥鈉引起的睡眠時(shí)間會(huì)延長(zhǎng)。為排除這種可能性，我們進(jìn)行了覺(jué)醒后再入睡實(shí)驗(yàn)。如Tab 1所示，小鼠經(jīng)戊巴比妥鈉誘導(dǎo)的翻正反射消失，待翻正反射恢復(fù)后，灌胃給予溶劑對(duì)照，小鼠再入睡率為0，灌胃給予地西泮(2 mg ·kg-1)可使87% (P<0.01)的小鼠再入睡，灌胃給予YZG-330 (0.125、0.5、2 mg·kg-1)分別可使25%、50%、62.5% (P<0.05)的小鼠再次入睡，灌胃給予YZG-331 (5、10、20 mg·kg-1)分別可使25%、75% (P<0.01)、87.5% (P<0.01)的小鼠再次翻正反射消失。結(jié)果表明，這兩個(gè)受試物本身具有鎮(zhèn)靜催眠作用，不通過(guò)抑制肝藥酶活性延長(zhǎng)睡眠時(shí)間，YZG-330的起效劑量遠(yuǎn)低于YZG-331。

Fig 3 Effects of YZG-330 and YZG-331 ononset(A) and duration(B) of sleeping in sodiumpentobarbital-treated n=10)

The sleep latency and sleeping time were assessed after administration of diazepam (5 mg·kg-1), YZG-330 (0.125, 0.5, 2 mg·kg-1) and YZG-331 (5, 10, 20 mg·kg-1).*P<0.05，**P<0.01vsvehicle group, tested by one way ANOVA.

Tab 1 Effects of YZG-330 and YZG-331 on sleep re-onset in micetreated by sodium pentobarbital (38 mg·kg-1, n=10)

*P<0.05,**P<0.01vsvehicle group

2.4YZG-330及YZG-331對(duì)小鼠腦內(nèi)GABA和Glu水平的影響氨基酸類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)GABA是腦內(nèi)主要的抑制性遞質(zhì)，Glu是GABA的前體物質(zhì)。HPLC-ECD法測(cè)得的Glu和GABA水平如Fig 4所示，與溶劑對(duì)照組相比，YZG-330(2 mg·kg-1)對(duì)下丘腦和皮層中GABA和Glu水平無(wú)明顯影響。YZG-331 (40 mg·kg-1)可明顯升高下丘腦和皮層中GABA含量,升高率分別為17.6%和19.5%。

Fig 4 Effects of YZGs on concentrations of GABA(A) andGlu(B) in different mouse brain n=10)

Mice were injected with YZG-330 (2 mg·kg-1) or YZG-331 (40 mg·kg-1), and brain tissue homogenate was prepared after 15 min treatment. The neurotransmitters contents were measured by HPLC-ECD with OPA pre-column derivatization.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.

3 討論

自主活動(dòng)實(shí)驗(yàn)常用來(lái)評(píng)價(jià)藥物對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)影響，是神經(jīng)藥理學(xué)研究中常用的方法之一。動(dòng)物的自主活動(dòng)參數(shù)常用來(lái)反映中樞神經(jīng)系統(tǒng)的功能狀態(tài)，興奮時(shí)自主活動(dòng)距離增加，抑制時(shí)活動(dòng)距離減少[10-11]。為了評(píng)價(jià)YZG-330和YZG-331對(duì)小鼠的鎮(zhèn)靜作用，我們記錄分析了小鼠的自主活動(dòng)，結(jié)果顯示，YZG-330和YZG-331均能明顯的抑制小鼠的自主活動(dòng)，這兩種化合物均具有中樞抑制作用，YZG-330 (2 mg·kg-1)與YZG-331 (20 mg·kg-1)對(duì)自主活動(dòng)的抑制率相近。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，差向異構(gòu)體YZG-330和YZG-331均能夠明顯延長(zhǎng)閾上劑量戊巴比妥鈉誘導(dǎo)的睡眠持續(xù)時(shí)間。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，深度的中樞抑制會(huì)使動(dòng)物失去清醒，同時(shí)伴有肌張力消失和翻正反射消失，翻正反射消失超過(guò)1 min 即為睡眠[9]。協(xié)同閾上劑量戊巴比妥鈉實(shí)驗(yàn)常用于評(píng)價(jià)具有中樞抑制作用的化合物，入睡潛伏期為小鼠翻正反射消失的潛伏期，睡眠時(shí)間為翻正反射消失持續(xù)時(shí)間。由于戊巴比妥鈉經(jīng)肝藥酶代謝，因此對(duì)肝藥酶有抑制作用的化合物可通過(guò)抑制戊巴比妥鈉的代謝，使翻正反射持續(xù)時(shí)間延長(zhǎng)。當(dāng)動(dòng)物被閾上劑量戊巴比妥鈉誘導(dǎo)出現(xiàn)的翻正消失恢復(fù)后，能夠使動(dòng)物翻正反射再次消失1 min以上的化合物，被認(rèn)為有中樞抑制作用。為排除YZG化合物因抑制戊巴比妥鈉代謝而使協(xié)同睡眠時(shí)間延長(zhǎng)的可能，我們進(jìn)行了協(xié)同再入睡實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，YZG-330 和YZG-331均有中樞抑制作用。

GABA是腦內(nèi)最重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)。下丘腦腹外側(cè)視前區(qū)(ventrolateral preoptic area, VLPO)是睡眠調(diào)節(jié)的關(guān)鍵區(qū)域之一，含有的抑制性GABA能神經(jīng)元可產(chǎn)生抑制性神經(jīng)遞質(zhì)GABA[12]。VLPO區(qū)的GABA能神經(jīng)元最終投射到大腦皮層[13-14]，Glu是GABA的合成底物，其含量與GABA密切相關(guān)。因此，我們選取重要的抑制性中樞下丘腦和主要投射區(qū)域大腦皮層對(duì)GABA和Glu含量進(jìn)行測(cè)定。在分別灌胃給予小鼠YZG-330和YZG-331后，對(duì)其神經(jīng)遞質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這兩種化合物引起的皮層和下丘腦的GABA、Glu變化并不完全一致。YZG-331 (40 mg·kg-1)可以引起小鼠下丘腦和皮層中GABA的明顯上升，這可能是該化合物引起中樞抑制作用的原因之一。YZG-330 (2 mg·kg-1)對(duì)GABA和Glu的含量均無(wú)明顯影響。提示差向異構(gòu)體YZGs產(chǎn)生中樞抑制作用的機(jī)制可能存在一定的差異。由于神經(jīng)遞質(zhì)代謝過(guò)程較為復(fù)雜，涉及到多種酶和轉(zhuǎn)運(yùn)體，因此，YZG-330及YZG-331對(duì)氨基酸類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)的影響，以及該影響是否與其中樞抑制作用相關(guān)，還需要進(jìn)行大量的后續(xù)研究。

綜上所述，差向異構(gòu)體YZG-330和YZG-331均具有強(qiáng)效的中樞抑制作用，YZG-330的抑制作用強(qiáng)于YZG-331。其對(duì)腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)GABA和Glu的影響既存在相似點(diǎn)，也存在差異，具體引起中樞抑制作用的機(jī)制可能存在差異，仍需進(jìn)一步探討。

(致謝：本實(shí)驗(yàn)在中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所張建軍課題組實(shí)驗(yàn)室完成。感謝本所石建功研究員提供YZG化合物，感謝劉偉、朱宏亮、于鳳婷、方金玉在行為學(xué)實(shí)驗(yàn)中的幫助。)

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