王 可，胡澤兵，王藝璇，張麗君，曹新生，石 菲，張 舒

空軍軍醫(yī)大學(xué)航空航天生物動力學(xué)教研室，航空航天醫(yī)學(xué)教育部重點實驗室，陜西西安 710032

隨著我國載人航天事業(yè)逐漸向中長期航天飛行階段邁進(jìn)，航天失重環(huán)境引起的骨質(zhì)丟失問題日益受到人們關(guān)注。在航天飛行過程中，暴露于外太空失重環(huán)境下的航天員會出現(xiàn)骨密度減少、骨質(zhì)脫鈣、骨組織結(jié)構(gòu)改變和生物力學(xué)性能降低等情況，且隨著時間的延長以上癥狀持續(xù)加重[1-3]。骨骼是動態(tài)變化的器官，在生長、發(fā)育過程中，骨骼系統(tǒng)持續(xù)存在舊骨吸收、新骨生成的生理活動以維持骨骼在長度及質(zhì)量上的穩(wěn)定，即稱為骨自穩(wěn)態(tài)[4]。研究顯示，失重導(dǎo)致的骨質(zhì)丟失，成骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨形成功能障礙是主要原因，但失重性骨質(zhì)丟失的確切分子機(jī)制尚未完全闡明[5]。目前，對于非編碼RNA的研究正如火如荼地展開，其中miRNA在失重性骨丟失過程中的重要作用已被廣泛證實[6-9]。我們課題組前期研究也發(fā)現(xiàn)，模擬失重環(huán)境下miR-132-3p顯著上調(diào)，并通過抑制EP300影響Runx2的乙?；c蛋白活性從而對成骨分化起到負(fù)性調(diào)控作用，進(jìn)而引起骨質(zhì)丟失[10]。然而，長度＞200 bp的長鏈非編碼RNAs(long noncoding RNAs，lncRNAs)在失重性骨丟失中的作用卻未見報道。已有研究表明，lncRNAs可通過堿基互補配對原則與mRNA競爭性結(jié)合miRNA，從而抑制了miRNA對靶mRNA的調(diào)控作用[11]，進(jìn)而形成精確調(diào)控網(wǎng)絡(luò)發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。為了尋找可能在失重性骨丟失中發(fā)揮作用的lncRNAs，我們基于前期對于重力敏感miR-132-3p研究的基礎(chǔ)上，初步篩選出3條與miR-132-3p有結(jié)合位點并且具有重力敏感性的lncRNA NONMMUT010777、NONMMUT-016978和NONMMUT027831，證實其在誘導(dǎo)MC3T3-E1細(xì)胞分化過程中與miR-132-3p的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，并且miR-132-3p可調(diào)控lncRNANONMMUT010777表達(dá)，從而為lncRNAs在失重性骨丟失中的作用研究提供了依據(jù)。

材料和方法

1 材料 小鼠前成骨細(xì)胞系MC3T3-E1(購于ATCC細(xì)胞庫)，胎牛血清(四季青公司)，DMEM培養(yǎng)基、雙抗(Hyclone公司)，胰蛋白酶(Millipore公司)，miRNA-132-3p Mimic、Inhibitor及相關(guān)對照(廣州銳博生物科技有限公司)，RNAiso細(xì)胞裂解液、Mir-X miRNA First-Strand Synthesis Kit、Prime Script?RT reagent Kit和SYBR?Premix Ex TaqTM(日本TaKaRa公司)，PCR引物(上海生工生物工程股份有限公司)，2D-RWVs型回轉(zhuǎn)器(中國航天員科研訓(xùn)練中心)；qRT-PCR儀(美國Bio-Rad公司)。

2 細(xì)胞培養(yǎng) 將凍存的小鼠前成骨細(xì)胞MC3T3-E1細(xì)胞復(fù)蘇后，使用含有10%胎牛血清和1%雙抗的DMEM培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)，細(xì)胞置于37℃孵箱中，維持5% CO2濃度，每2 d換液1次。當(dāng)細(xì)胞的匯合度達(dá)到90%左右時，使用胰蛋白酶進(jìn)行傳代培養(yǎng)。選取3 ～ 6代呈對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行實驗。

3 回轉(zhuǎn)器模擬失重 在超凈臺中將細(xì)胞傳代至回轉(zhuǎn)瓶，放入37℃孵箱常規(guī)培養(yǎng)。傳代6 ～ 8 h后細(xì)胞完全貼壁，用含有10%胎牛血清和1%雙抗的DMEM培養(yǎng)基灌滿回轉(zhuǎn)瓶，直立放于37℃孵箱培養(yǎng)過夜。第2天在超凈臺中完全排盡回轉(zhuǎn)瓶中的氣泡。回轉(zhuǎn)組安裝于2D回轉(zhuǎn)器上垂直回轉(zhuǎn)，回轉(zhuǎn)半徑為1.5 cm，轉(zhuǎn)速均為24 r/min；對照組置于37℃孵箱中常規(guī)培養(yǎng)?；剞D(zhuǎn)時間為48 h。測量72 h內(nèi)變化時加測24 h與72 h組?；剞D(zhuǎn)完成后根據(jù)后續(xù)實驗所需提取細(xì)胞樣本進(jìn)行檢測。

4 誘導(dǎo)成骨分化 MC3T3-E1細(xì)胞中加入成骨誘導(dǎo)液(含10%胎牛血清、1%雙抗、10 mmol/L β-甘油磷酸鈉、100 nmol/L地塞米松、50μg/ml維生素C的DMEM培養(yǎng)基)，誘導(dǎo)培養(yǎng)7 d后根據(jù)后續(xù)實驗所需提取細(xì)胞樣本進(jìn)行檢測。

5 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 采用Lipofectamine 2000脂質(zhì)體進(jìn)行轉(zhuǎn)染。首先將合成的miR-132-3p Mimic、Inhibitor干凍粉劑以DEPC水稀釋溶解，分裝備用(20μmol/L)。將細(xì)胞以適當(dāng)密度鋪6孔板，所用培養(yǎng)基更換為無雙抗的DMEM誘導(dǎo)培養(yǎng)基，當(dāng)其生長到約70%融合度時準(zhǔn)備進(jìn)行轉(zhuǎn)染。無血清Opti-MEM培養(yǎng)基 250μl中加入 Lipofectamine2000脂質(zhì)體 4μl。再次吸取無血清Opti-MEM培養(yǎng)基250μl分別加入各Mimic、Mimic-NC稀釋存儲液(4μl)及Inhibitor、Inhibitor-NC稀釋存儲液(10μl)，靜置5 min。然后將兩者混勻后再靜置20 ～ 30 min。最后將各組配好的轉(zhuǎn)染液體分別加入隨機(jī)分配標(biāo)記的6孔板中，再向每孔中加入1 500μl無血清、無雙抗的DMEM誘導(dǎo)培養(yǎng)基。6 ～ 8 h后換有血清、無雙抗的DMEM誘導(dǎo)培養(yǎng)基。24 h后提取細(xì)胞總RNA。

表1 引物序列Tab. 1 Primer sequences

6 實時熒光定量PCR 使用RNAiso Plus提取細(xì)胞總RNA，采用紫外分光光度計測定RNA濃度和純度，PCR擴(kuò)增采用SYBR Green熒光染料法，PCR引物序列見表1。miRNA檢測：采用Mir-X miRNA First-Strand Synthesis Kit合成cDNA。以合成的cDNA為模版，以U6為內(nèi)參擴(kuò)增miRNA。lncRNA檢測：采用PrimeScript?RT Master Mix reagent Kit合成cDNA。以合成的cDNA為模版，以GAPDH為內(nèi)參擴(kuò)增lncRNA。數(shù)據(jù)采用2-△△Ct法進(jìn)行相對定量分析。

7 統(tǒng)計學(xué)方法 全部數(shù)據(jù)采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，實驗數(shù)據(jù)以-x±s表示。先對數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性分析和方差齊性檢驗。兩樣本間比較采用獨立樣本t檢驗；多樣本組間兩兩比較分析采用單因素方差分析(One-way ANOVA)；樣本不同時間點多次測量的結(jié)果比較分析采用重復(fù)測量方差分析(Repeated-Measures ANOVA)，組間兩兩比較采用Bonferroni檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 生物信息學(xué)預(yù)測與miR-132-3p有結(jié)合位點的6條lncRNAs 基于課題組前期研究[10]，為了進(jìn)一步尋找miR-132-3p靶向的lncRNAs，我們使用miRanda預(yù)測出了6條與miR-132-3p有結(jié)合位點的 lncRNAs(表 2)。

2 模擬失重致MC3T3-E1細(xì)胞lncRNAs表達(dá)下調(diào)為了篩選對重力變化敏感的lncRNAs，我們將MC3T3-E1細(xì)胞放入2D回轉(zhuǎn)器模擬失重條件培養(yǎng)48 h，采用qRT-PCR技術(shù)檢測lncRNAs的表達(dá)。結(jié)果顯示模擬失重組與對照組相比，lncRNA NONMMUT010777(P＜0.05)、NONMMUT016978(P＜0.05)和NONMMUT027831(P＜0.01)的表達(dá)顯著下調(diào)，而另3條lncRNAs表達(dá)未出現(xiàn)顯著變化(圖1)。

表2 miRanda預(yù)測與miR-132-3p有結(jié)合位點的lncRNAsTab. 2 Six candidate lncRNAs targeted by miR-132-3p screened out by miRanda

圖1 模擬失重后MC3T3-E1細(xì)胞lncRNAs的表達(dá)變化(aP＜0.05，bP＜0.01， vs 對照組)Fig. 1 Expression levels of lncRNAs in MC3T3-E1 cells cultured in simulated microgravity (aP＜0.05， bP＜0.01, vs control group)

3 模擬失重72 h內(nèi)MC3T3-E1細(xì)胞lncRNAs的表達(dá)變化 為進(jìn)一步了解重力敏感l(wèi)ncRNAs在模擬失重環(huán)境下的變化特點，我們采用qRT-PCR方法檢測了MC3T3-E1細(xì)胞中l(wèi)ncRNA NONMMUT 010777、NONMMUT016978和 NONMMUT027831在模擬失重72 h內(nèi)的表達(dá)變化。結(jié)果顯示，與對照組相比，lncRNAs在模擬失重24 h后即出現(xiàn)顯著下調(diào)，且顯著下調(diào)變化至少可持續(xù)至72 h(P＜0.01或P＜ 0.05)。 表 明 lncRNA NONMMUT010777、NONMMUT016978和NONM-MUT027831在模擬失重處理72 h內(nèi)呈穩(wěn)定下調(diào)趨勢(圖2)。

圖2 模擬失重72 h內(nèi)MC3T3-E1細(xì)胞中重力敏感l(wèi)ncRNAs的表達(dá)變化(aP＜0.05， bP＜0.01， vs 對照組)Fig. 2 Expression levels of microgravity-sensitive lncRNAs in MC3T3-E1 cells cultured in simulated microgravity for 24, 48 and 72 h (aP＜0.05， bP＜0.01, vs control group)

4 誘導(dǎo)培養(yǎng)MC3T3-E1細(xì)胞后miR-132-3p與lncRNAs表達(dá)呈負(fù)相關(guān) 前期研究已充分證實了miR-132-3p在模擬失重環(huán)境下對成骨分化的抑制作用[10]，為了進(jìn)一步探討miR-132-3p靶向的重力敏感l(wèi)ncRNAs在成骨分化過程中與miR-132-3p表達(dá)的相關(guān)性，我們向MC3T3-E1細(xì)胞中加入成骨誘導(dǎo)液誘導(dǎo)培養(yǎng)7 d，然后采用qRT-PCR方法檢測lncRNAs和miR-132-3p的表達(dá)變化。結(jié)果顯示，與對照組相比，誘導(dǎo)分化后miR-132-3p表達(dá)顯著下調(diào)，而lncRNA NONMMUT010777(P＜0.01)、NONMMUT016978(P＜0.01)和NONMMUT-027831(P＜0.05)表達(dá)均顯著上調(diào)(圖3)。結(jié)果顯示誘導(dǎo)分化過程中miR-132-3p與其靶向的重力敏感l(wèi)ncRNAs的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，提示miR-132-3p可能調(diào)控lncRNAs的表達(dá)。

5 miR-132-3p可調(diào)控lncRNAs的表達(dá) 為了驗證誘導(dǎo)分化過程中miR-132-3p對其靶向的重力敏感l(wèi)ncRNAs的調(diào)控作用，我們向誘導(dǎo)分化的MC3T3-E1細(xì)胞中轉(zhuǎn)染了miR-132-3p的Mimic或Inhibitor，并采用qRT-PCR方法檢測了轉(zhuǎn)染后miR-132-3p的表達(dá)水平以驗證轉(zhuǎn)染效果，然后檢測lncRNAs的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染24 h后，mimic-132組的miR-132-3p表達(dá)量較對照組升高了約150倍(P＜0.01)，而inhibitor-132組表達(dá)量較對照組下降了約70%(P＜0.01)。過表達(dá)或抑制miR-132-3p后，在3條重力敏感的lncRNAs中，NONMMUT010777的表達(dá)顯著下調(diào)或上調(diào)(P＜0.01)，而NONMMUT016978和NONMMUT027831的表達(dá)無顯著改變(圖4)。提示在誘導(dǎo)分化過程中miR-132-3p可調(diào)控lncRNA NONMMUT010777的表達(dá)。

圖3 誘導(dǎo)分化后MC3T3-E1中miR-132-3p和lncRNAs的表達(dá)變化(aP＜0.05， bP＜0.01, vs 對照組)Fig. 3 Expression levels of lncRNAs and miR-132-3p in MC3T3-E1 cells under osteogenic induction (aP＜0.05， bP＜0.01, vs control group)

討 論

圖4 miR-132-3p轉(zhuǎn)染效果以及miR-132-3p對lncRNAs表達(dá)水平的影響(aP＜0.05， bP＜0.01, vs 對照組)Fig. 4 Transfection effects of miR-132-3p and expression levels of lncRNAs in MC3T3-E1 cells transfected with mimics, inhibitors and negative control(aP＜0.05， bP＜0.01, vs control group)

為了篩選miR-132-3p靶向的具有重力敏感性的lncRNAs，本實驗使用miRanda預(yù)測出了6條與miR-132-3p有結(jié)合位點的lncRNAs，并使用2D回轉(zhuǎn)器處理MC3T3-E1細(xì)胞模擬失重效應(yīng)，發(fā)現(xiàn)6條lncRNAs中有3條表達(dá)下調(diào)，并進(jìn)一步證實了這3條lncRNAs在模擬失重處理72 h內(nèi)穩(wěn)定下調(diào)。此外，為了進(jìn)一步探討miR-132-3p靶向的重力敏感l(wèi)ncRNAs在成骨分化過程中與miR-132-3p表達(dá)的相關(guān)性，我們使用成骨誘導(dǎo)液誘導(dǎo)MC3T3-E1細(xì)胞分化7d后，miR-132-3p表達(dá)下調(diào)，3條重力敏感l(wèi)ncRNAs表達(dá)上調(diào)。此外向誘導(dǎo)分化的MC3T3-E1細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-132-3p Mimic和Inhibitor，發(fā)現(xiàn)在3條重力敏感l(wèi)ncRNAs中，NONMMUT010777出現(xiàn)明顯表達(dá)下調(diào)或上調(diào)，而另外兩條未出現(xiàn)明顯表達(dá)變化。結(jié)果提示miR-132-3p靶向的重力敏感l(wèi)ncRNAs在誘導(dǎo)MC3T3-E1細(xì)胞分化過程中與miR-132-3p的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，并且miR-132-3p可調(diào)控lncRNANONMMUT010777表達(dá)。

骨骼是動態(tài)變化的器官，其依賴成骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨形成和破骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨吸收功能維持穩(wěn)態(tài)[12]。而重力和機(jī)械力對于維持骨骼的正常形態(tài)和結(jié)構(gòu)至關(guān)重要[1]。重力是一種以場力的形式作用于骨的力，是維持骨的正常生理功能狀態(tài)的重要力學(xué)刺激[5]。在航天失重環(huán)境下，骨鈣以平均每個月1% ～ 2%的速率丟失，且沒有自限性，這成為制約人類長時程航行的主要醫(yī)學(xué)問題[13]。然而，失重性骨質(zhì)丟失的發(fā)生機(jī)制尚未闡明。但有研究表明，破骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨吸收和成骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨形成的平衡紊亂，是引起失重性骨質(zhì)丟失的主要原因[14]。

LncRNAs是在真核生物中新發(fā)現(xiàn)的一類長度＞200 nt、沒有長閱讀框架，但往往具有mRNA結(jié)構(gòu)特征(5'帽式結(jié)構(gòu)和polyA尾巴)的RNA[15]。LncRNAs可通過順式作用直接調(diào)控鄰近基因表達(dá)和反式作用調(diào)控遠(yuǎn)距離基因表達(dá)的方式[16]，在成骨分化過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用[17-19]。在lncRNAs眾多的作用機(jī)制中，其作為ceRNA和miRNAs相互調(diào)控進(jìn)而發(fā)揮生物學(xué)功能日益受到關(guān)注[20]。一方面，lncRNAs可作為海綿或誘餌，通過堿基互補配對原則與miRNAs結(jié)合，或促進(jìn)miRNAs的降解；另一方面，miRNAs可誘導(dǎo)lncRNAs降解，或只是單純結(jié)合，而不降解lncRNAs[21-25]。為了篩選miR-132-3p靶向的具有重力敏感性的lncRNAs，本實驗通過生物信息學(xué)預(yù)測的方法，找出了與miR-132-3p有結(jié)合位點的lncRNAs。進(jìn)一步實驗表明，有3條lncRNAs具有重力敏感性，且在誘導(dǎo)MC3T3-E1細(xì)胞成骨分化過程中表達(dá)上調(diào)。然而，向MC3T3-E1細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-132-3p Mimic或Inhibitor后，只有l(wèi)ncRNANONMMUT010777表達(dá)相應(yīng)下調(diào)或上調(diào)，提示miR-132-3p可能通過誘導(dǎo)其降解的方式發(fā)揮生物學(xué)功能。而lncRNA NONMMUT016978和NONMMUT-027831未出現(xiàn)明顯表達(dá)變化，我們推測miR-132-3p可能是通過單純結(jié)合lncRNAs，從而減少了靶mRNA與miR-132-3p結(jié)合的方式來發(fā)揮生物學(xué)功能。然而，這些miR-132-3p靶向的重力敏感l(wèi)ncRNAs在失重性骨丟失發(fā)生過程中的調(diào)控作用仍需通過功能實驗來證實，如模擬失重環(huán)境下過表達(dá)lncRNAs后對成骨細(xì)胞分化功能的影響；而miR-132-3p與lncRNAs的靶向結(jié)合關(guān)系也需要熒光素酶報告基因、RNA免疫共沉淀、RNA pull-down等實驗的進(jìn)一步驗證。

相較于miRNA研究的廣泛性和系統(tǒng)性，長鏈非編碼RNA的研究則略顯滯后，人們對其功能及機(jī)制的認(rèn)識尚不完善。雖然lncRNAs在各種骨骼疾病發(fā)生發(fā)展過程中的重要作用已被證實[26]，但其在失重性骨丟失領(lǐng)域中的研究卻鮮有報道。我們課題組在前期miRNA研究的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步開展了lncRNAs的研究。本研究初步篩選出了3條miR-132-3p靶向的具有重力敏感性的lncRNAs，并證實其可在誘導(dǎo)MC3T3-E1細(xì)胞分化過程中與miR-132-3p的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，且miR-132-3p可調(diào)控lncRNA NONMMUT010777表達(dá)，這為我們對lncRNAs的后續(xù)功能和機(jī)制研究提供了依據(jù)。我們相信，隨著lncRNAs對失重性骨質(zhì)丟失研究的不斷深入，未來可能通過靶向干預(yù)lncRNAs的表達(dá)來抑制失重性骨質(zhì)丟失的發(fā)生，進(jìn)而為人類的長時程航行保駕護(hù)航。

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