許 陽(yáng)，楊 震，李春筍，李彥芹，梁志欣

解放軍總醫(yī)院 呼吸內(nèi)科，北京 100853

肺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白1(lung cancer metastasis related protein 1，LCMR1)基因是解放軍總醫(yī)院呼吸科實(shí)驗(yàn)室首先發(fā)現(xiàn)并克隆的一種功能基因[1]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，LCMR1基因與腫瘤密切相關(guān)，特別是在肺癌的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移中可能發(fā)揮著重要作用[1]。LCMR1基因功能和分子機(jī)制尚不十分明確，研究LCMR1基因在肺癌發(fā)生、發(fā)展中的作用和機(jī)制，探索有效的基因診斷與治療方法，對(duì)于延長(zhǎng)肺癌患者的生存期和提高肺癌患者的生活質(zhì)量具有十分重要的理論意義和臨床應(yīng)用價(jià)值。尋找新基因的相互作用蛋白，通過(guò)其相互作用蛋白的功能，推測(cè)新基因的功能，是新基因功能研究的重要手段之一。本實(shí)驗(yàn)采用酵母雙雜交技術(shù)初步篩選LCMR1相互作用蛋白，采用融合蛋白沉降技術(shù)和免疫共沉淀技術(shù)在體外和細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行驗(yàn)證，為L(zhǎng)CMR1基因功能研究提供線索和分子基礎(chǔ)。

材料和方法

1 質(zhì)粒 pGBKT7質(zhì)粒購(gòu)自美國(guó)Clontech公司，質(zhì)粒有卡那霉素的抗性基因，有酵母轉(zhuǎn)化標(biāo)記TRP1。pCL1質(zhì)粒(陽(yáng)性對(duì)照載體)購(gòu)自美國(guó)Clontech公司。pGBKT7-LCMR1質(zhì)粒、pCMV-Myc-LCMR1質(zhì)粒、pGEX-5T-LCMR1質(zhì)粒由本實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建。pCMVMyc載體購(gòu)自美國(guó)Clontech公司，pcDNA3.0-flag載體購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，pGEX-5T載體購(gòu)自美國(guó)Amersham公司。pcDNA3.0-flag-DEK質(zhì)粒由美國(guó)Michigan University的Marcovitz教授惠贈(zèng)。

2 菌株及細(xì)胞 AH109酵母菌株購(gòu)自美國(guó)Clontech公司，菌株含4個(gè)報(bào)告基因HIS3、LacZ、ADE2和MEL1及轉(zhuǎn)化標(biāo)記LEU2和TRP1。大腸埃希菌DH5α購(gòu)自北京天根生物公司；人肺癌95D細(xì)胞及人胚腎293細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存。

3 試 劑 TRIZOL購(gòu) 自 美 國(guó)Invitrogen公 司，MATCHMAKER試劑盒購(gòu)自美國(guó)Clontech公司，酵母轉(zhuǎn)化系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)Clontech公司。SuperFect轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自德國(guó)Qiagen公司，T4 DNA連接酶、質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自美國(guó)Promega公司；PCR試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa公司。GST結(jié)合樹脂購(gòu)自德國(guó)Novagen公司，TNT T7 Quick體外翻譯轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自美國(guó)Promega公司。[35S]-甲硫氨酸購(gòu)自北京亞輝公司。Flag抗體購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，Myc抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司，β-actin抗體購(gòu)自美國(guó)SantaCruz公司。

4 肺癌95D細(xì)胞雙鏈cDNA文庫(kù)片段的合成 采用TRIzol方法提取95D細(xì)胞總RNA，紫外分光光度儀檢測(cè)提取95D細(xì)胞總RNA的光密度值，鑒定RNA的純度。使用1%甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳鑒定總RNA的完整性。采用SMART技術(shù)，以肺癌95D細(xì)胞總RNA為模板進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，將95D細(xì)胞總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA的第一條鏈，通過(guò)長(zhǎng)距離PCR(LD-PCR)方法擴(kuò)增出雙鏈cDNA(ds cDNA)，將95D細(xì)胞cDNA片段與文庫(kù)載體相連，構(gòu)建95D細(xì)胞文庫(kù)。

5 誘餌質(zhì)粒在酵母中的表達(dá)及誘餌質(zhì)粒自激活及毒性作用的檢測(cè) 將誘餌質(zhì)粒pGBKT7-LCMR1轉(zhuǎn)化入酵母菌AH109，從SD/-Trp平板上挑取1個(gè)生長(zhǎng)良好的菌落，提取酵母菌總蛋白，使用SDSPAGE電泳和Western blot檢測(cè)誘餌質(zhì)粒在酵母中的表達(dá)；依照小規(guī)模酵母轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)方法，將pGBKT7空載質(zhì)粒、pGBKT7-LCMR1質(zhì)粒及作為陽(yáng)性對(duì)照的pCL1質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化入感受態(tài)酵母菌AH109，三組轉(zhuǎn)化產(chǎn)物分別涂于培養(yǎng)板SD/-Trp/X-α-gal、培養(yǎng)板 SD/-Trp/-Ade/X-α-gal、培養(yǎng)板 SD/-Trp/-His/X-α-gal，30℃倒置培養(yǎng) 3 ～ 6 d，觀察克隆生長(zhǎng)及顯色情況，判斷質(zhì)粒是否存在自激活作用；分別將轉(zhuǎn)化pGBKT7-LCMR1質(zhì)粒的酵母菌和轉(zhuǎn)化pGBKT7空載質(zhì)粒的酵母菌接種于在50 ml SD/-Trp/Kan液體培養(yǎng)基中，30℃過(guò)夜培養(yǎng)，分別檢測(cè)二組的OD600值，檢測(cè)LCMR1對(duì)宿主菌是否有毒性。

6 誘餌質(zhì)粒及文庫(kù)共轉(zhuǎn)化酵母篩選陽(yáng)性克隆 將線性化質(zhì)粒pGADT7、pGBKT7-LCMR1質(zhì)粒及人肺癌95D細(xì)胞cDNA文庫(kù)片段共轉(zhuǎn)化酵母菌AH109，將轉(zhuǎn)化菌液按1∶10、1∶100、1∶1 000的比例稀釋，分別取少量不同稀釋濃度的酵母菌轉(zhuǎn)化菌液，涂布于SD/-Leu平板和SD/-Leu/-Trp平板上培養(yǎng)，計(jì)算文庫(kù)的共轉(zhuǎn)化率及重組率。將剩余的轉(zhuǎn)化菌均勻涂布于50塊150 mm的SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp培養(yǎng)板，30℃倒置培養(yǎng)3 ～ 8 d。以共轉(zhuǎn)pGBKT7-Lam及pGADT7-RecT為陰性對(duì)照組，共轉(zhuǎn)pGBKT7-53及pGADT7-RecT為陽(yáng)性對(duì)照組。

7 陽(yáng)性克隆的鑒定及生物學(xué)信息學(xué)分析 采用重復(fù)劃線培養(yǎng)方法去除假陽(yáng)性克隆。提取陽(yáng)性克隆酵母菌中的質(zhì)粒，將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸埃希菌DH-5α中，擴(kuò)增后提取文庫(kù)質(zhì)粒。將提取的陽(yáng)性文庫(kù)質(zhì)粒與pGBKT7-LCMR1質(zhì)粒共轉(zhuǎn)入酵母菌AH109，以共轉(zhuǎn)文庫(kù)質(zhì)粒和空載質(zhì)粒pGBKT7為陰性對(duì)照，回復(fù)驗(yàn)證文庫(kù)質(zhì)粒與誘餌質(zhì)粒的相互作用?；貜?fù)驗(yàn)證為陽(yáng)性的單個(gè)文庫(kù)質(zhì)粒，測(cè)序其插入片段，測(cè)序結(jié)果在NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行BLAST比對(duì)。

8 免疫共沉淀實(shí)驗(yàn) 在含有10% BCS的RPMI1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)人肺癌95D細(xì)胞，傳代至10 cm培養(yǎng)皿中。采用Superfect轉(zhuǎn)染試劑，將DEK質(zhì)粒(pcDNA3.0-flag-DEK)及LCMR1質(zhì)粒(pCMV-Myc-LCMR1)共轉(zhuǎn)染95D細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48 h后收獲細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白。將蛋白上清與2μg的抗體antimyc混合，在4℃環(huán)境下，輕緩搖動(dòng)孵育3 h，加入Protein A/G agarose珠子40μl，4℃環(huán)境下，輕緩搖動(dòng)孵育8 h，使抗體與Agarose偶聯(lián)。4℃離心并用裂解液洗脫珠子3次，加入2×SDS的上樣緩沖液，100℃條件下處理5 min，上樣于10%SDS-PAGE膠，電泳轉(zhuǎn)膜后，使用Flag抗體進(jìn)行Western blot實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)復(fù)合物中有無(wú)Flag-DEK。分別以單獨(dú)轉(zhuǎn)染LCMR1質(zhì)粒(pCMV-Myc-LCMR1)和單獨(dú)轉(zhuǎn)染DEK質(zhì)粒(pcDNA3.0-flag-DEK)作為實(shí)驗(yàn)對(duì)照組。

9 GST與GST-LCMR1融合蛋白的表達(dá)和純化分別將pGEX-5T(GST載體)與pGEX-5T-LCMR1(GST-LCMR1融合載體)轉(zhuǎn)化到DH-5α感受態(tài)細(xì)菌，取適量菌液涂布于LB/Amp+平板，37℃倒置培養(yǎng)過(guò)夜。加入終濃度為0.6 mmol/L的IPTG，于20℃誘導(dǎo)4 h，取5 ml菌液，離心后棄上清，加入適量PBS液懸浮細(xì)胞，離心后棄上清。加入1/10菌液體積的RIPA裂解緩沖液，冰上裂解30 min，用超聲裂解儀破碎細(xì)菌，離心后取上清，部分上清上樣于SDS-PAGE凝膠，電泳轉(zhuǎn)膜后進(jìn)行免疫印跡檢測(cè)GST與GST-LCMR1表達(dá)情況。將剩余細(xì)菌裂解蛋白上清與GST瓊脂糖珠混合后室溫(30℃)晃動(dòng)培育1 h，裂解液洗脫雜蛋白，使用Western blot檢測(cè)GST蛋白及GST-LCMR1融合蛋白純化情況。

10 DEK蛋白及DEK功能區(qū)蛋白體外轉(zhuǎn)錄翻譯以DEK質(zhì)粒DNA為模板，采用PCR法分別擴(kuò)增DEK功能區(qū)N端和C端編碼片段，酶切后分別將兩個(gè)擴(kuò)增片段連接至空載體pcDNA3.0-flag，構(gòu)建pcDNA3.0-flag-DEK(N端)功能區(qū)質(zhì)粒及pcDNA3.0-flag-DEK(C端)功能區(qū)質(zhì)粒。提取DEK質(zhì)粒，DEK(N端)功能區(qū)質(zhì)粒及DEK(C端)功能區(qū)質(zhì)粒。采用TNT T7 Quick體外翻譯轉(zhuǎn)錄試劑盒，在體外將3種質(zhì)粒DNA分別轉(zhuǎn)錄翻譯成DEK蛋白，DEK的N端功能區(qū)蛋白和DEK的C端功能區(qū)蛋白，并用35S標(biāo)記蛋白。

11 GST pull down實(shí)驗(yàn) 取25μl 35S標(biāo)記的DEK全長(zhǎng)蛋白分別與100μl GST蛋白(對(duì)照組)及100μl GST-LCMR1融合蛋白(實(shí)驗(yàn)組)混合，室溫(30℃)孵育1 h，離心后棄上清，使用裂解液反復(fù)清洗混合物。試管內(nèi)加入20μl SDS-PAGE上樣緩沖液，煮沸5 min，冷卻到室溫后，取上清上樣到10% SDS-PAGE凝膠，加樣進(jìn)行電泳。干膠后壓片，放射自顯影技術(shù)鑒定LCMR1與DEK是否有相互作用。將35S標(biāo)記的DEK的N端功能區(qū)蛋白、DEK的C端功能區(qū)蛋白分別與GST、GST-LCMR1融合蛋白進(jìn)行Pull down實(shí)驗(yàn)，研究LCMR1與DEK相互作用區(qū)域。

結(jié) 果

1 肺癌95D細(xì)胞總RNA及ds cDNA文庫(kù)片段鑒定人肺癌95D細(xì)胞總RNA的濃度為0.95μg/μl，OD260/OD280值 為 1.88，OD260/OD230的 值 為 2.47，RNA有較好純度。1%甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳顯示RNA完整性較好，提取的總RNA可用于cDNA文庫(kù)的構(gòu)建。1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果顯示，雙鏈cDNA PCR產(chǎn)物(圖1第2條泳道)有一條彌散條帶，為250 ～ 6 000 bp，符合構(gòu)建文庫(kù)的要求。

2 誘餌質(zhì)粒pGBKT7-LCMR1轉(zhuǎn)化酵母菌及其融合蛋白表達(dá) 誘餌質(zhì)粒pGBKT7-LCMR1轉(zhuǎn)化酵母菌后，使用Western blot檢測(cè)酵母菌總蛋白，結(jié)果顯示分子量40 kU處有一條蛋白條帶，與LCMR1融合蛋白分子量大小一致，表明pGBKT7-LCMR1融合蛋白在酵母中成功表達(dá)。

3 pGBKT7-LCMR1質(zhì)粒的自激活檢測(cè)與宿主毒性檢測(cè) 轉(zhuǎn)化pCL1質(zhì)粒(陽(yáng)性對(duì)照組)的酵母菌在平板SD/-Leu/X-α-Gal上長(zhǎng)出3 mm藍(lán)色菌落，轉(zhuǎn)化pGBKT7空載(陰性對(duì)照組)的酵母菌和轉(zhuǎn)化pGBKT7-LCMR1質(zhì)粒(實(shí)驗(yàn)組)的酵母菌在SD/-Trp/X-α-gal培養(yǎng)平板上長(zhǎng)出約3 mm的白色菌落，在SD/-Trp/-Ade/X-α-gal及SD/-Trp/-His/X-α-gal培養(yǎng)板上無(wú)菌落生長(zhǎng)。以上結(jié)果證明，pGBKT7-LCMR1誘餌質(zhì)粒和空載pGBKT7質(zhì)粒均未發(fā)生自激活作用。轉(zhuǎn)化pGBKT7空載質(zhì)粒的酵母菌和轉(zhuǎn)化pGBKT7-LCMR1質(zhì)粒的酵母菌的OD600值，分別為1.057和1.098。兩者的生長(zhǎng)速率無(wú)明顯區(qū)別，表明誘餌質(zhì)粒pGBKT7-LCMR1對(duì)宿主酵母菌無(wú)毒性作用。

4 陽(yáng)性克隆的初篩與鑒定 以營(yíng)養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基(SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade)篩選共轉(zhuǎn)化pGBKT7-LCMR1質(zhì)粒、pGADT7-Rec質(zhì)粒及95D細(xì)胞cDNA文庫(kù)片段的AH109酵母菌陽(yáng)性克隆，共獲得20個(gè)陽(yáng)性候選克隆。計(jì)算文庫(kù)重組效率為1.2×106(＞1×106)，共轉(zhuǎn)化效率為6×105(＞5×105)，達(dá)到實(shí)驗(yàn)要求的標(biāo)準(zhǔn)。經(jīng)重復(fù)劃線驗(yàn)證和回復(fù)法驗(yàn)證去除假陽(yáng)性克隆，最終獲得6個(gè)陽(yáng)性克隆與LCMR1存在相互作用。陽(yáng)性克隆質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果與NCBI的BLAST數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，得到6個(gè)基因編碼蛋白(DEK、RPL29、GNG5、CCAR1、LGMN及G3BP1)與LCMR1存在相互作用。選取其中與腫瘤關(guān)系最為密切的DEK蛋白進(jìn)行后續(xù)驗(yàn)證。

5 免疫共沉淀實(shí)驗(yàn) 將pCMV-Myc-LCMR1質(zhì)粒及pcDNA3.0-flag-DEK質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染人胚腎293細(xì)胞，使用抗體Myc行免疫共沉淀，使用抗體Flag行Western blot實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組檢測(cè)到了DEK的存在(圖2)，陰性對(duì)照組沒有檢測(cè)到DEK。將上述實(shí)驗(yàn)以相同條件重復(fù)進(jìn)行3次，得到相同結(jié)果。實(shí)驗(yàn)表明LCMR1蛋白與DEK蛋白可以特異結(jié)合，兩種蛋白在細(xì)胞內(nèi)有相互作用。

6 GST蛋白及GST-LCMR1融合蛋白的表達(dá)與純化 使用12.5%SDS-PAGE檢測(cè)蛋白GST及融合蛋白GST-LCMR1在大腸埃希菌中表達(dá)后經(jīng)瓊脂糖珠純化情況，結(jié)果顯示(圖3)在第3條泳道26 kU大小處有單一的蛋白條帶，與蛋白GST分子量大小一致。在第2條泳道47 kU大小處有單一的蛋白條帶，與GST-LCMR1蛋白分子量大小一致。提示GST蛋白及GST-LCMR1融合蛋白表達(dá)及純化成功。

7 DEK蛋白、DEK的N端功能區(qū)蛋白及DEK的C端功能區(qū)蛋白的體外轉(zhuǎn)錄翻譯 體外轉(zhuǎn)錄翻譯DEK蛋白、DEK的N端功能區(qū)蛋白及DEK的C端功能區(qū)蛋白，并用放射性35S標(biāo)記蛋白。運(yùn)用放射性自顯影的方法進(jìn)行檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示DEK蛋白、DEK的N端功能區(qū)蛋白及DEK的C端功能區(qū)蛋白成功表達(dá)，蛋白的分子量及表達(dá)量符合實(shí)驗(yàn)要求。

8 LCMR1蛋白與DEK蛋白的GST pull-down實(shí)驗(yàn)在GST-LCMR1與DEK共同孵育的實(shí)驗(yàn)組，觀察到一條特異性蛋白條帶(圖4A右)，與陽(yáng)性對(duì)照組DEK蛋白大小一致，提示混合物中有DEK。陰性對(duì)照組沒有觀察到相應(yīng)條帶。實(shí)驗(yàn)表明LCMR1與DEK可以在體外特異性結(jié)合。在GST-LCMR1蛋白與DEK的N端功能區(qū)蛋白共同孵育的實(shí)驗(yàn)組，觀察到一條特異性蛋白條帶(圖4B右)，與陽(yáng)性對(duì)照組DEK的N端功能區(qū)蛋白大小一致，提示混合物中有DEK的N端功能區(qū)蛋白。陰性對(duì)照組沒有觀察到相應(yīng)條帶。實(shí)驗(yàn)證實(shí)LCMR1和DEK的N端功能區(qū)蛋白可以在體外特異性結(jié)合。在GSTLCMR1蛋白與DEK的C端功能區(qū)蛋白共同孵育的實(shí)驗(yàn)組(圖4C右)，沒有觀察到與陽(yáng)性對(duì)照組DEK的C端功能區(qū)蛋白大小一致的蛋白條帶，提示混合物中沒有DEK的C端功能區(qū)蛋白。實(shí)驗(yàn)證實(shí)LCMR1蛋白和DEK的C端功能區(qū)蛋白在體外沒有特異性結(jié)合。

圖1 肺癌95D細(xì)胞雙鏈cDNA瓊脂糖凝膠電泳圖1：Marker； 2：肺癌95D細(xì)胞雙鏈cDNAFig. 1 Lung cancer 95D cell doublestranded cDNA agarose gel electrophoresis result1: Marker; 2: Lung cancer 95D cell double-stranded cDNA

圖2 免疫共沉淀方法驗(yàn)證LCMR1與DEK在細(xì)胞內(nèi)的相互作用Fig. 2 The interaction of LCMR1 and DEK in vivo examined by CO-IP assay

圖3 蛋白GST及蛋白GSTLCMR1的表達(dá)及純化結(jié)果1: Marker; 2: GSTLCMR1; 3: GSTFig. 3 Purification of protein GST and protein GST-LCMR11: Marker; 2: GSTLCMR1; 3: GST

圖4 LCMR1蛋白與DEK蛋白的GST pull-down實(shí)驗(yàn)放射自顯影圖A: LCMR1蛋白和DEK全長(zhǎng)蛋白的體外相互作用； B:LCMR1蛋白和DEK的N端功能區(qū)蛋白體外相互作用； C:LCMR1蛋白和DEK的C端功能區(qū)蛋白體外相互作用Fig. 4 Direct interaction of LCMR1 and DEK in vitro examined by GST pull-down assayA: The interaction between LCMR1 and DEK; B: The interaction between LCMR1 and N-terminal constructs of DEK; C: The interaction between LCMR1 and C-terminal constructs of DEK

討 論

隨著環(huán)境污染的加重以及吸煙人口的增加，原發(fā)性支氣管肺癌(簡(jiǎn)稱肺癌)的發(fā)病率逐年上升[2-3]。肺癌發(fā)生、發(fā)展的相關(guān)機(jī)制，成為了肺癌研究的重要課題。大量研究證實(shí)，肺癌的發(fā)生和發(fā)展是多基因參與的復(fù)雜過(guò)程[4-5]。肺癌相關(guān)基因的發(fā)現(xiàn)為肺癌研究奠定了基礎(chǔ)，然而目前這些基因還并不能完全闡明肺癌的機(jī)制。因此，進(jìn)一步尋找肺癌發(fā)病過(guò)程中起關(guān)鍵作用的基因，并對(duì)其功能進(jìn)行系統(tǒng)研究，對(duì)于揭示肺癌發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制意義重大。

肺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白1是解放軍總醫(yī)院呼吸科實(shí)驗(yàn)室利用差異顯示聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)，從具有高轉(zhuǎn)移性的人肺癌細(xì)胞株95D細(xì)胞中克隆出的新基因[1]。LCMR1(GenBank登錄號(hào)AY148462)位于人類染色體11q12.1，分子量約為19 kU。近年來(lái)有研究發(fā)現(xiàn)LCMR1可能與膀胱癌及結(jié)腸癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[6]，Aga?sse等[7]利用大規(guī)模RNAi篩選方式研究發(fā)現(xiàn)，LCMR1作為重要調(diào)控因子參與了Tspan8介導(dǎo)的黑色素瘤侵襲過(guò)程。呼吸科實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)，LCMR1在非小細(xì)胞肺癌中過(guò)表達(dá)，LCMR1表達(dá)與肺癌臨床分期顯著相關(guān)[1]。利用RNA干擾技術(shù)抑制LCMR1表達(dá)能夠促進(jìn)肺癌細(xì)胞凋亡[8]。盡管本課題組前期對(duì)LCMR1進(jìn)行了一些初步研究，但目前其生物學(xué)功能仍不十分明確，研究LCMR1基因在肺癌發(fā)生、發(fā)展中的功能和作用機(jī)制，對(duì)探索有效的基因診斷與治療方法意義重大。

研究新基因功能的重要手段之一是尋找新基因編碼蛋白的相互作用蛋白。本研究首先開展酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)，應(yīng)用Clontech公司的MATCHMAKER試劑盒構(gòu)建人肺癌95D細(xì)胞cDNA文庫(kù)。將LCMR1誘餌質(zhì)粒和文庫(kù)質(zhì)粒同時(shí)共轉(zhuǎn)化入酵母宿主菌，初步篩選出6種蛋白與LCMR1存在相互作用，分別為DEK、RPL29、GNG5、CCAR1、LGMN及G3BP1。為進(jìn)一步探討LCMR1在肺癌中的作用，我們選擇初篩結(jié)果中與腫瘤密切相關(guān)的DEK基因開展后續(xù)研究。鑒于酵母雙雜交結(jié)果假陽(yáng)性率較高，我們使用免疫共沉淀技術(shù)(Co-Immunoprecipitation，Co-IP)及融合蛋白沉降(GST pull-down)技術(shù)對(duì)酵母雙雜交初篩結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，確認(rèn)DEK與LCMR1在細(xì)胞內(nèi)和體外均有相互作用。

DEK是一種原癌基因，眾多研究發(fā)現(xiàn)DEK在多種腫瘤中均有過(guò)表達(dá)現(xiàn)象[9-10]。DEK的過(guò)表達(dá)與肺癌的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)[11-12]，臨床分析發(fā)現(xiàn)非小細(xì)胞性肺癌患者的DEK陽(yáng)性表達(dá)率為47.9% ～67.2%[13]。對(duì)DEK功能機(jī)制研究提示DEK蛋白是P53蛋白的負(fù)調(diào)節(jié)蛋白，DEK通過(guò)p53通路參與調(diào)控腫瘤的發(fā)生[14-15]。DEK能降低促凋亡基因p53的蛋白穩(wěn)定性，抑制p53基因轉(zhuǎn)錄活性，降低Caspase-3活性[15]。DEK與AP-2α具有相互調(diào)節(jié)作用[16-17]，DEK與AP-2α協(xié)同增強(qiáng)EGFR家族成員HER2(erbB2，NEU)的基因表達(dá)[18]。

DEK基因編碼蛋白包含有兩個(gè)結(jié)構(gòu)功能區(qū)域：N端功能區(qū)(位于68-226氨基酸)及C端功能區(qū)(位于309-375氨基酸)[19]。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步將DEK按功能區(qū)截段，使用GST pull-down明確蛋白LCMR1與蛋白DEK的N端功能區(qū)在體外發(fā)生特異性結(jié)合。

本實(shí)驗(yàn)證實(shí)，蛋白LCMR1與蛋白DEK的相互作用通過(guò)與DEK的N端功能區(qū)結(jié)合得以實(shí)現(xiàn)，DEK的N端功能區(qū)與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。LCMR1與DEK相互作用在細(xì)胞凋亡中的確切作用及分子機(jī)制，兩者相互作用對(duì)下游凋亡基因有何調(diào)控，有待后續(xù)研究揭示。

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