胡　波，張曉剛，李德才

冠狀動脈粥樣硬化性心臟病(coronary heart disease，CHD)是一種多因素共同作用的冠狀動脈性心臟疾病，由于脂質代謝異常引起動脈內膜脂類物質的堆積進而誘發(fā)動脈粥樣病變[1-2]，近年來，冠心病的發(fā)病率呈上升的趨勢，并且在年齡上越來越趨向于年輕化[3]。炎癥反應是心臟疾病中的一項重要的機制，該反應會使動脈粥樣硬化斑塊趨于不穩(wěn)定，進而可能導致斑塊破裂，促進冠心病的發(fā)生發(fā)展[4-6]。該研究[7]顯示許多microRNA (miRNA)分子可以調控糖脂代謝、平滑肌細胞增殖以及血管炎癥反應，在冠心病的發(fā)病機制中扮演著關鍵性的作用。Jazbutyte et al[8]發(fā)現(xiàn)miR-22靶向骨誘導因子(mimecan/osteoglycine, OGN)，可促進心臟成纖維細胞的遷移，誘導心肌細胞衰老。NOD樣受體蛋白3(NLRP-3)炎性小體是一種影響組織損傷、代謝應激、感染和炎癥過程的復合體[9]。該研究旨在探討miR-22靶向調控NLRP3基因對冠心病內皮細胞炎癥損傷的影響，尋求一種新的方法來治療冠心病。

1　材料與方法

1.1實驗動物健康純種SD雄性大白鼠24只，體重(240±60) g，鼠齡3 ～4月，由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供，動物合格證編號：HNASLKJ20100330，飼養(yǎng)在帶不銹鋼蓋底的塑料籠內，每籠6只，自由飲水。室內溫度25 ℃，濕度65%，飲水為普通自來水，飼料和水均可由大鼠自行隨意攝取。飼養(yǎng)一周適應環(huán)境，以降低環(huán)境變更引起的應激反應。本次實驗通過綿陽四0四醫(yī)院倫理協(xié)會審核，同時動物實驗嚴格遵循《赫爾辛基宣言》。

1.2病理模型的構建及分組參照沈麗 等[10]的方法制備冠狀動脈粥樣硬化模型，適應性喂養(yǎng)一周后，正常組喂基礎飼料和普通自來水，AS組以高脂飼料(2%膽固醇、0.5%膽酸鈉、3%豬油、0.2%丙基硫氧嘧啶和94.3%的基礎飼料)喂養(yǎng)，在高脂飼料的基礎上加維生素D3粉劑(1.25×106U/kg飼料)喂養(yǎng)，實驗開始時于右下肢肌肉注射維生素D3粉針劑(3×106U/kg體重)，每隔30 d重復一次。正常組和AS組各12只。

1.3血脂和血鈣的檢測實驗3個月后，各組動物禁食過夜，在戊巴比妥鈉腹腔麻醉下，分離腹主動脈，在腎動脈分叉處下方，剪開腹主動脈，插入穿刺針，以注射器采集動脈血，3 000 r/min離心5 min，分離血漿，取1 ml檢測血脂和血鈣。使用Abbott Aeroset TM生物化學分析儀(美國亞培公司)檢測各組大鼠血漿總膽固醇(total cholesterol,TC)、三酰甘油(triglyceride,TG)、高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein cholesterol,HDLC)、低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein cholesterol,LDLC)和Ca2+的表達情況。實驗重復3次，數(shù)據(jù)取平均值。

1.4冠狀動脈內皮細胞的分離、培養(yǎng)及鑒定取近心端冠狀動脈，將取出的冠狀動脈放入盛有PBS和肝素的的器皿中浸泡5 min，防止血液凝固。無菌PBS沖洗3次，將其置于75%酒精中浸泡15 s，用眼科剪將動脈組織剪碎為1 mm3大小的組織塊，加入0.2% Ⅱ型膠原酶3 ml，37 ℃水浴消化6 min，再加入等體積0.25%胰酶，37 ℃水浴消化5 min。消化結束后，加入3 ml含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液終止消化。棄上清液，將所得細胞充懸于完全培養(yǎng)液，在37 ℃、5% CO2細胞孵育箱中孵育，6 h后換液，棄去未貼壁細胞，待細胞生長至80% 融合，吸棄原培養(yǎng)液，PBS沖洗3遍。向瓶內加入0.25% 胰蛋白酶-0.02% EDTA溶液，輕輕晃動培養(yǎng)瓶，使消化液流遍所有細胞表面。將培養(yǎng)瓶置于顯微鏡下觀察，待大部分細胞收縮變圓時，立即加入10%胎牛血清培養(yǎng)液終止消化。用移液器輕輕吹打使細胞脫壁。吸取細胞懸液并離心，用完全培養(yǎng)液重懸，混合均勻。調整到合適的密度后接種傳代。含置于37 ℃恒溫的5% CO2培養(yǎng)箱中孵育，每3 d換一次培養(yǎng)液。通過免疫細胞化學法，將細胞吹打，使用PBS洗滌，加入一抗孵育過夜。次日，PBS清洗3次，加入二抗，在37 ℃的條件下孵育30 min，DAB顯色，光鏡下觀察記錄。原代冠狀動脈內皮細胞在培養(yǎng)24 h后，在倒置顯微鏡下進行觀察。

1.5細胞轉染及分組待處理的大鼠冠狀動脈內皮細胞與0.25 mmol/L的同型半胱氨酸(homocysteine,HCY)共孵育24 h，造冠心病模型。針對有效促進大鼠miR-22基因表達的靶序列合成其過表達RNA的DNA Oligo，并制成雙鏈DNA。與Age I和EcoR I雙酶切后的Pgcsil-gfp載體連接、轉化、PCR法篩選陽性克隆，提取質粒，酶切并測序。合成miR-22的過表達物(miR-22 mimic)、抑制物(miR-22 inhibitor)及NLRP3基因失活(si NLRP3) ，利用脂質體進行包裝，待第3代冠狀動脈內皮細胞生長至80%時開始轉染，將脂質體一定比例稀釋后加入細胞培養(yǎng)基共培養(yǎng)24 h，構成空白對照組(不轉染的細胞)、陰性對照組(轉染不相干序列)、miR-22 mimic組(轉染miR-22的過表達物)、miR-22 inhibitor組(轉染miR-22的抑制物)、miR-22 inhibitor + si NLRP3組(轉染miR-22并失活NLRP3基因)。

1.6雙熒光素酶報告系統(tǒng)檢測采用生物信息學軟件http://www.microrna.org預測miR-22 與NLRP3的靶向關系及miR-22 與NLRP3 3’UTR 的結合位點。合成含miR-22結合位點的NLRP3 3’UTR啟動子區(qū)序列，構建NLRP3 3’UTR野生型(WT)質粒(NLRP3 3’UTR-WT)。并在該質?；A上，突變結合位點，構建NLRP3 3’UTR 突變型(MUT)質粒(NLRP3 3’UTR -MUT)。按購買的質粒提取試劑盒(美國Promega公司)的方法步驟進行。將對數(shù)生長的293T細胞接種于96 孔板中，在細胞密度約70 % 時，Lipofectamine 2000 轉染，將NLRP3-3′UTR-WT質粒和miR-22 mimic質?；靹蚝蠊厕D染于293T 細胞，同時設NLRP3-3 ′ UTR-WT+NC(NLRP3 3’UTR野生型質粒轉染無義對照序列)組、NLRP3-3′UT R-MUT+NC(NLRP3 3’UTR突變型質粒轉染無義對照序列)組和NLRP3-3′UT R-MUT+miR-22 mimic(NLRP3 3’UTR突變型質粒轉染miR-22 mimic質粒)組分別轉染于293T 細胞。培養(yǎng)箱培養(yǎng)6 h后，更換含10 % FBS培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，化學發(fā)光法檢測熒光素酶活性。實驗重復3次，數(shù)據(jù)取平均值。

1.7實時熒光定量PCR檢測miR-22、NLRP3、caspase-1mRNA的表達水平采用TRIzol(美國Invitrogen公司)的一步法對組織和細胞總RNA進行提取，并通過紫外分析技術及甲醛變性電泳檢測對獲得高質量RNA進行證實。取1 μg RNA，用AMV逆轉錄酶逆轉錄得到cDNA。PCR引物由美國Invitrogen公司設計和合成，以β-actin作為內參。PCR擴增條件為：94 ℃預變性5 min，94 ℃變性40 s，60 ℃退火40 s，72 ℃延伸1 min，40個循環(huán)，72 ℃再延伸10 min。產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠進行電泳，用OpticonMonitor 3軟件(美國BioRad公司)分析PCR結果。手動將閾值選定在各對數(shù)擴增曲線平行上升的最低點，獲得各反應管的Ct值，數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCt法進行分析，2-ΔΔCt表示實驗組與對照組目的基因表達的倍比關系，公式如下：ΔΔCt=[Ct(目的基因)-Ct(參照基因)]實驗組-[Ct(目的基因)-Ct(參照基因)]對照組。實驗重復3次，數(shù)據(jù)取平均值。

1.8Westernblot檢測NLRP3、caspase-1蛋白表達情況提取各組大鼠心肌組織和各組細胞蛋白，按BCA試劑盒(武漢博士德公司)說明書測定蛋白濃度，將提取的蛋白加入上樣緩沖液后在95 ℃煮10 min，每孔上樣30 μg，10%聚丙烯酰胺凝膠(武漢博士德公司)電泳分離蛋白，電泳電壓80 V轉120 V，濕轉，轉膜電壓 100 mV，時間 45～70 min，PVDF 轉膜，5% BSA室溫封閉1 h，加入兔抗鼠一抗NLRP3(1 ∶1 000稀釋)、caspase-1(1 ∶1 000稀釋)均購自美國Cell Signaling公司，抗鼠一抗β-actin(1 ∶3 000稀釋)購自美國BD公司，4 ℃過夜。TBST 漂洗3次，每次5 min，相應的羊抗兔二抗(上海妙通生物科技公司)室溫孵育 1 h，洗膜，洗3次，每次5 min，化學發(fā)光試劑顯影。β-actin作為內參。Bio-rad Gel Dol EZ 成像儀(GEL DOC EZ IMAGER，美國Bio-rad公司)顯影。目的條帶采用Image J軟件進行灰度值分析。實驗重復3次，數(shù)據(jù)取平均值。

1.9MTT法檢驗細胞活性將2～3代CMEC細胞懸液按一定濃度稀釋細胞數(shù)后以5×104每孔密度接種于96孔板中，每組設6個平行孔。待細胞達80%融合后，按上述實驗分組處理細胞，復氧結束后，再加入MTT液(美國Sigma公司)20 μl，置于37 ℃培養(yǎng)箱孵育4 h，棄MTT溶液，每孔加入二甲基亞砜(美國Sigma公司)150 μl，搖床振蕩10 min后于酶標儀490 nm波長處檢測每孔吸光度(OD)值。實驗重復3次，取平均OD值。細胞存活率=(試驗組OD值-空白組OD值)/空白組OD值。實驗重復3次，數(shù)據(jù)取平均值。

1.10Hochest33258染色檢驗細胞凋亡使用0.25%胰酶-0.02% EDTA消化處于對數(shù)生長期的細胞，離心后的細胞置于完全培養(yǎng)液中重懸，在24孔板中以500 μl(6×105/孔)密度接種于，37 ℃、5% CO2環(huán)境中孵育。待細胞貼壁融合后，取出蓋玻片，PBS洗3次，4%多聚甲醛固定15 min，然后PBS洗3次，每次5 min。Hochest 33258工作液25 ℃染色5 min，蒸餾水沖凈晾干。在倒置熒光顯微鏡下觀察，隨機選擇高倍鏡視野5個/組，固縮、濃集、細胞核變亮認為是凋亡細胞核，統(tǒng)計陽性細胞數(shù)。凋亡率等于陽性細胞數(shù)與總細胞數(shù)之比。實驗重復3次，數(shù)據(jù)取平均值。

1.11ELISA檢測白介素(interleukin,IL)-1β、IL-6、IL-10和IL-18水平0.25%胰酶-0.02%EDTA消化對數(shù)生長期細胞，離心后的細胞用完全培養(yǎng)液重懸，以500 μl(6×105/孔)密度接種于24孔板，37 ℃、5% CO2環(huán)境中孵育。待細胞貼壁融合后，收集細胞上清液。上清液保存于-20 ℃的環(huán)境中，按照ELISA試劑盒說明書檢測細胞上清中的IL-1β、IL-6、IL-10和IL-18的濃度。實驗重復3次，數(shù)據(jù)取平均值。

2　結果

2.1大鼠的血脂和血鈣的濃度變化檢測大鼠的血脂和血鈣的濃度結果顯示：與正常組大鼠比較，AS組大鼠血清TC、TG、LDLC水平均明顯升高(P<0.05)，HDLC差異無統(tǒng)計學意義。與正常組比較，AS組大鼠血清中Ca2+濃度明顯升高(P<0.05)。見表1。

2.2大鼠心肌組織中miR-22和NLRP3、caspase-1mRNA表達水平經(jīng)實時熒光定量PCR法檢測大鼠心肌組織中miR-22水平和NLRP3、caspase-1 mRNA表達情況，兩組大鼠miR-22水平和NLRP3、caspase-1 mRNA表達水平存在顯著差異(t=26.84、64.01、50.59，P<0.05)。 與正常組比較AS組大鼠心肌組織中miR-22水平顯著下調，而NLRP3和caspase-1 mRNA表達水平顯著上調(P<0.05)。見圖1。

圖1　大鼠心肌組織中miR-22和NLRP3、caspase-1 mRNA表達水平

2.3大鼠心肌組織中NLRP3、caspase-1蛋白表達水平Western blot法檢測各組大鼠心肌組織中NLRP3、caspase-1 蛋白表達水平，各組間NLRP3、caspase-1 蛋白表達水平差異有統(tǒng)計學意義(t=120.70、50.21，P<0.05)。與正常組比較，AS組的NLRP3、caspase-1 蛋白表達顯著上調，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖2。

表1　各組大鼠血清血脂和血鈣水平

與正常組比較：*P<0.05

圖2　大鼠心肌組織蛋白表達水平

2.4雙熒光素酶報告系統(tǒng)檢測生物信息學軟件http://www.microrna.org預測miR-22 與NLRP3有靶向關系(圖3A)。293T細胞內共轉染NLRP3-3′UTR-WT質粒和miR-22模擬物質粒，結果顯示，野生型中，與NLRP3-3′UTR-WT+NC組比較， NLRP3-3′UTR-WT+ miR-22 mimic組熒光素酶活性顯著降低(t=5.26，P<0.05)。而突變型中，與NLRP3-3′UTR-MUT+NC組比較，共轉染NLRP3-3′UTR-MUT+miR-22 mimic質粒后，熒光素酶活性差異無統(tǒng)計學意義(圖3B)。

2.5冠狀動脈內皮細胞形態(tài)觀察及鑒定原代CMECs培養(yǎng)24 h后，倒置顯微鏡下進行觀察，可見細胞呈單層鵝卵石狀生長，小而短梭形，胞體具有較好的折光度。貼壁細胞數(shù)量隨著細胞培養(yǎng)天數(shù)增加越來越多，細胞開始伸展并呈梭形貼壁生長。培養(yǎng)至5～7 d時，細胞呈多角形或梭形(圖4)。傳代細胞3～4 h后可生長至融合狀態(tài)，細胞形態(tài)與原代培養(yǎng)細胞相同，呈現(xiàn)典型“鋪路石樣結構”。 同時免疫細胞化學法顯示內皮細胞的特異分子標志CD34、CD105、Tie-2因子呈強陽性，CD31、vW因子呈陽性。

圖3　miR-22 與NLRP3的靶向關系驗證

A：在線軟件預測靶向關系圖；B：熒光素酶活性實驗驗證結果；與NLRP3-3′UTR-WT中的NC組比較：*P<0.05

圖4　CMECs形態(tài)觀察　×200

2.6各組細胞中miR-22和NLRP3、caspase-1mRNA表達水平實時熒光定量PCR結果顯示：與空白對照組比較，miR-22 mimic組miR-22水平顯著上升，NLRP3、caspase-1的mRNA表達水平顯著下降；而miR-22 inhibitor組的miR-22水平顯著下降，NLRP3、caspase-1的mRNA表達水平顯著上升，差異有統(tǒng)計學意義(F=86.53、258.10、440.60，P<0.05)?？瞻讓φ战M、陰性對照組和miR-22 inhibitor+si NLRP3組各指標差異無統(tǒng)計學意義。見圖5。

圖5　各組細胞實時熒光定量PCR檢測結果

與空白對照組比較：*P<0.05；與miR-22 mimic組比較：#P<0.05

2.7各組細胞中NLRP3、caspase-1蛋白表達水平Western blot法檢測各組細胞中NLRP3、caspase-1 蛋白表達水平，結果顯示：與空白對照組比較，miR-22 mimic組NLRP3、caspase-1的蛋白表達水平顯著下降；而miR-22 inhibitor組的NLRP3、caspase-1的蛋白表達水平顯著上升，差異有統(tǒng)計學意義(F=125.50、41.75,P<0.05)?？瞻讓φ战M、陰性對照組和miR-22 inhibitor+si NLRP3組各指標差異無統(tǒng)計學意義。見圖6。

2.8各組細胞活性MTT法檢測各組內皮細胞活性，結果顯示：空白對照組和陰性對照組細胞活性差異無統(tǒng)計學意義。與空白對照組比較，miR-22 mimic細胞活性顯著升高；miR-22 inhibitor組細胞活性則顯著降低(P<0.05)?？瞻讓φ战M、陰性對照組和miR-22 inhibitor + si NLRP3組細胞活性差異無統(tǒng)計學意義。見圖7。

2.9Hochest33258染色結果Hochest 33258染色結果顯示：細胞進行冠心病應激后，出現(xiàn)細胞核不完整，核固縮，染色質濃集和凋亡小體等典型的凋亡特征。空白對照組和陰性對照組比較細胞凋亡情況差異無統(tǒng)計學意義。與空白對照組比較，miR-22 mimic組細胞核不完整的細胞明顯減少，細胞凋亡率明顯下降；而miR-22 inhibitor組細胞出現(xiàn)大量凋亡細胞，細胞核不完整的細胞明顯增加，細胞凋亡率明顯上升(P<0.05)。miR-22 inhibitor+si NLRP3組的凋亡率與空白對照組和陰性對照組差異無統(tǒng)計學意義。見圖8。

圖6　各組細胞蛋白條帶圖和各組蛋白表達水平

1：空白對照組；2：陰性對照組；3：miR-22 mimic組；4：miR-22 inhibitor組；5：miR-22 inhibitor + si NLRP3組；與空白對照組比較：*P<0.05；與miR-22 mimic組比較：#P<0.05

圖7　MTT法檢測各組內皮細胞的細胞活性

1：空白對照組；2：陰性對照組；3：miR-22 mimic組；4：miR-22 inhibitor組；5：miR-22 inhibitor + si NLRP3組；與空白對照組比較：*P<0.05；與miR-22 mimic組比較：#P<0.05

2.10細胞炎癥因子表達水平經(jīng)ELISA法檢驗表明：與空白對照組和陰性對照組比較，miR-22 mimic組IL-1β、IL-6和IL-18分泌量明顯降低，IL-10分泌顯著升高；而miR-22 inhibitor組IL-1β、IL-6和IL-18分泌量明顯增加，而IL-10分泌顯著下調(P<0.05)?？瞻讓φ战M和陰性對照組及miR-22 inhibitor + si NLRP3組之間比較，IL-1β、IL-6、IL-10和IL-18分泌量差異無統(tǒng)計學意義。見表2。

圖8　各組細胞的凋亡染色圖檢測　×200

A：空白對照組；B：陰性對照組；C：miR-22 mimic組；D：miR-22 inhibitor組；E：miR-22 inhibitor + si NLRP3組；與空白對照組比較：*P<0.05；與miR-22 mimic組比較：#P<0.05

表2　各組細胞炎癥因子表達水平

與空白對照組比較：*P<0.05；與miR-22 mimic組比較：#P<0.05

3　討論

據(jù)2010全球疾病負擔報告分析，冠心病是當今影響全球死亡病例與入院治療人群的主要原因之一。本研究顯示miR-22通過靶向抑制NLRP3基因，減少冠心病大鼠心肌微血管內皮細胞凋亡及下調促炎癥因子IL-1β、IL-6和IL-18的表達，從而發(fā)揮對大鼠心肌微血管內皮細胞的保護作用。

首先，本實驗結果顯示，與正常組比較，AS組大鼠心肌組織中miR-22水平顯著下調，而NLRP3和caspase-1表達水平顯著上調。NLRP3炎性體是目前結構和功能最為明確的炎性體之一，也是NLR家族的重要成員之一，主要由NLRP3、caspase-1和凋亡相關微粒蛋白(ASC)組成。NLRP3炎性體在動物動脈粥樣硬化(AS)斑塊中被激活，并且在冠心病患者主動脈中存在著過度表達，其表達水平與冠心病的嚴重程度相關[11]。經(jīng)過雙熒光素梅檢測報告驗證，NLRP3是miR-22的靶向基因。與空白對照組比較，miR-22 mimic組NLRP3、caspase-1的表達水平顯著下降，而miR-22 inhibitor組的NLRP3、caspase-1的表達水平顯著上升。本研究結果顯示miR-22過表達可增強冠心病大鼠心肌微血管內皮細胞活力，并使細胞凋亡率下降。因此，miR-22可靶向抑制NLRP3減少冠心病大鼠心肌微血管內皮細胞凋亡。

與此同時，NLRP3炎癥小體在冠狀動脈粥樣硬化炎癥機制中發(fā)揮重要作用，被激活的NLRP3炎癥小體，誘發(fā)caspase-1活化，進而促進白介素1β前體(pro-IL-1β)及pro-IL-18的成熟和分泌[12]。動脈硬化過程中，磷酸鈣結晶體激活caspase-1，巨噬細胞中釋放炎性因子IL-1β和IL-1α，促進動脈粥樣硬化斑塊形成[13]。與本研究結果一致，本研究顯示miR-22 mimic組的IL-1β、IL-6和IL-18炎癥因子表達水平下調。目前所知的IL-1家族一共包括了11個成員，IL-1α、IL-1β、IL-1 receptor agonist (IL-Ra)、IL-18、IL-1F5、IL-1F6、IL-1F7、IL-1F8、IL-1F9、IL-1F10與IL-33[14]。IL-1β通過結合IL-1受體1，是重要的炎癥信號之一[15]。由此，可得出結論，miR-22通過靶向抑制NLRP3基因下調促炎癥因子IL-1β、IL-6和IL-18的表達，減輕細胞炎癥損傷。

綜上，本研究顯示miR-22通過靶向抑制NLRP3基因，減少冠心病大鼠心肌微血管內皮細胞凋亡，下調促炎癥因子IL-1β、IL-6和IL-18的表達，從而保護大鼠心肌微血管內皮細胞，減少內皮細胞炎癥損傷。這一發(fā)現(xiàn)或許會為冠心病的臨床治療提供一個新的研究方向。然而，該發(fā)現(xiàn)尚未得到臨床數(shù)據(jù)的支持，因此接下來將進一步研究miR-22應用于冠心病的臨床治療的作用與分子機制。