曹　樂(lè)，方　曉，丁振飛，王　濤，黃　威，饒先亮，尹宗生

脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(adipose-derivedmesenchymal stem cells，ADSCs)具有較強(qiáng)的增殖能力和多向分化潛能，能夠滿(mǎn)足組織工程對(duì)細(xì)胞數(shù)量和種類(lèi)的要求，因而被認(rèn)為比較可靠的應(yīng)用于骨組織工程的種子細(xì)胞來(lái)源[1]。但單一的干細(xì)胞移植往往因干細(xì)胞生存所需微環(huán)境在體內(nèi)難以完全復(fù)制，結(jié)果導(dǎo)致移植效率較低。雖然人們?cè)缫颜J(rèn)識(shí)到血管化在骨形成和修復(fù)中的重要作用，但是成血管細(xì)胞能否促進(jìn)骨再生及其機(jī)制尚未完全明了。該研究通過(guò)特定的條件培養(yǎng)基培養(yǎng)種子細(xì)胞來(lái)部分模擬體內(nèi)多細(xì)胞之間相互作用的環(huán)境，從而在細(xì)胞水平探討具有成血管潛能的內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitor cells，EPCs)通過(guò)間接接觸對(duì)具有成骨潛能的ADSCs的增殖和成骨能力的生物學(xué)影響，為闡明血管化與骨形成之間的生物耦聯(lián)機(jī)制提供依據(jù)。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物80～100 g SPF級(jí)雌性SD 大鼠2只； 200～220 g SPF 級(jí)雌性SD大鼠4只，均購(gòu)自安徽省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.3大鼠骨髓源EPCs的分離與培養(yǎng)取1只80～100 g SD大鼠，10%水合氯醛腹腔注射麻醉后使用75% 酒精浸泡15 min，于超凈工作臺(tái)中分離大鼠下肢。剪去大鼠股骨及脛骨骨骺端，吸取F液(大鼠骨髓淋巴細(xì)胞分離液試劑盒)反復(fù)沖洗髓腔，沖出骨髓置于60 mm培養(yǎng)皿中吹打均勻，1 550 r/min 離心5 min后棄上清液，使用5 ml組織液(大鼠骨髓淋巴細(xì)胞分離液試劑盒)將上述骨髓組織重懸備用。將上述備用的組織液重懸的骨髓細(xì)胞緩慢加入5 ml淋巴細(xì)胞分離液上層，1 550 r/min離心20 min，可見(jiàn)骨髓細(xì)胞分層排列于淋巴細(xì)胞分離液中，小心吸取其中白色絮狀單核細(xì)胞層，使用EBM-2培養(yǎng)基重懸清洗2遍后，接種于預(yù)先包被纖維黏連蛋白(FN)(20 μg/ml)的6孔板中，放入恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，48 h后全量換液，以后每2 d半量換液1次。原代培養(yǎng)的EPCs融合成片后按1 ∶2傳代。

1.4大鼠ADSCs的分離與培養(yǎng)參考文獻(xiàn)[2]方法，取1只200～220 g SD大鼠， 10%水合氯醛麻醉后使用75% 酒精浸泡15 min，于超凈工作臺(tái)中分離大鼠腹股溝皮下脂肪，使用含1%雙抗的PBS清洗3次。將脂肪組織剪碎后加入雙倍體積的 0.1% Ⅰ型膠原酶溶液，混合均勻。將密封的離心管置于 37 ℃恒溫水浴鍋中緩慢震蕩消化60 min后，1 200 r/min離心20 min，去除上層油脂、未消化的脂肪組織及纖維結(jié)締組織等。磷酸鹽緩沖溶液(phosphate buffer saline，PBS)重懸細(xì)胞，200 μm濾網(wǎng)過(guò)濾后，以1 200 r/min離心10 min，去除上層液面漂浮的油脂，重復(fù)上述步驟至去凈懸浮油脂。使用含10%胎牛血清(fetal calf serum，F(xiàn)BS)的LG-DMEM 重懸細(xì)胞，接種于 T25培養(yǎng)瓶中，置于恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，以后每3 d換液1次。原代培養(yǎng)的細(xì)胞融合成片后按1 ∶3的比例傳代培養(yǎng)。 CCK-8法測(cè)量ADSCs生長(zhǎng)曲線(xiàn)。

1.5免疫熒光檢測(cè)ADSCs和EPCs表面標(biāo)志物調(diào)整第3代ADSCs和第2代EPCs濃度為3×105/ml，按每孔0.5 ml接種于預(yù)先鋪好細(xì)胞爬片的24孔板中。待細(xì)胞貼壁后移除培養(yǎng)基，4%多聚甲醛固定后PBS浸洗3次，山羊血清封閉30 min。于ADSCs爬片上滴加稀釋好的兔抗大鼠CD90一抗，EPCs爬片加入稀釋好的兔抗大鼠CD133、VEGFR-2一抗，放入濕盒，4 ℃孵育過(guò)夜。第2天，PBST浸洗爬片3次后吸干爬片上多余液體，滴加稀釋好的熒光二抗，濕盒中20～37 ℃孵育1 h后，PBST浸洗爬片3次。滴加DAPI后避光孵育5 min后，對(duì)上述細(xì)胞爬片進(jìn)行核染，PBST洗去多余的DAPI后用含抗熒光淬滅劑的封片液封片，熒光顯微鏡下觀察采集圖像。

1.6ADSCs和EPCs的功能鑒定

1.6.1ADSCs成軟骨誘導(dǎo)分化第3代ADSCs生長(zhǎng)80%～90%融合后，使用成軟骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基培養(yǎng)3周，甲苯胺藍(lán)染色后鏡下觀察，以細(xì)胞被甲苯胺藍(lán)染成藍(lán)色為陽(yáng)性結(jié)果。

1.6.2ADSCs成骨誘導(dǎo)分化第3代ADSCs生長(zhǎng)至80%～90%融合時(shí)，用成骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基培養(yǎng)3周，茜素紅染色后鏡下觀察，以細(xì)胞基質(zhì)被茜素紅染成紅色為陽(yáng)性結(jié)果。

1.6.3ADSCs成脂誘導(dǎo)分化第3代ADSCs生長(zhǎng)至100%融合或者過(guò)融合后，使用成脂誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基A液培養(yǎng)3 d ，誘導(dǎo)3 d 后換為成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基B液，A液和B液交替作用3～5次。油紅O染色后鏡下觀察，以ADSCs 胞質(zhì)中可見(jiàn)有大小不等紅染的脂滴形成為陽(yáng)性結(jié)果。

1.6.4EPCs體外成血管能力參考文獻(xiàn)[3-4]方法，取96孔板，按每孔50 μl鋪被基底膠于皿底，胰酶消化第2代EPCs，制備濃度為2×104/ml的EPC細(xì)胞懸液接種于各孔，輕輕振蕩均勻，培養(yǎng)箱中孵育12 h。倒置顯微鏡觀察，以能形成管腔樣結(jié)構(gòu)為陽(yáng)性結(jié)果。

1.6.5EPCs吞噬功能參考文獻(xiàn)[4]方法，取融合度達(dá)80%的第2代EPCs，加入4 μg/ml的Dil-acLDL，培養(yǎng)箱中孵育4 h。PBS洗3次后多聚甲醛固定15 min，加入10 mg/L的FITC-UEA-1，孵育1 h。激光共聚焦顯微鏡下觀察并采集圖像。 Dil-acLDL和FITC-UEA-1雙染色陽(yáng)性細(xì)胞被認(rèn)為是正在分化的EPCs。

1.7制備內(nèi)皮祖細(xì)胞條件培養(yǎng)基(EPC-CM)取經(jīng)過(guò)鑒定的原代培養(yǎng)后1～2代的EPCs, 以每孔1×105個(gè)細(xì)胞接種至6孔板中，待細(xì)胞達(dá)到80%～90%融合后，換用不含F(xiàn)BS的LG-DMEM，于1%氧濃度培養(yǎng)48 h后收集舊培養(yǎng)基，3 000 r/min離心10 min，取上清液即為EPC條件培養(yǎng)基。重復(fù)制備，直至足量。經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾后，貯存于-80 ℃ 冰箱中備用。

1.8CCK-8法檢測(cè)不同濃度EPC-CM培養(yǎng)的ADSCs增殖活性取第2代ADSCs，用含10% FBS的LG-DMEM培養(yǎng)基制備細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為 2×104/ml，按每孔100 μl接種于96孔培養(yǎng)板內(nèi)，培養(yǎng)24 h后，吸除原培養(yǎng)基后，以含1%的FBS生長(zhǎng)培養(yǎng)基饑餓處理24 h后，加入含1%FBS的不同濃度EPC-CM 100 μl，分別為對(duì)照組(使用LG-DMEM培養(yǎng))、50%EPC-CM組(使用50% EPC-CM+50%LG-DMEM培養(yǎng))和100%EPC-CM組(使用100%EPC-CM培養(yǎng))，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，每孔加入含10% CCK-8的LG-DMEM 100 μl， 37 ℃反應(yīng)4 h，酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm波長(zhǎng)處的吸光度(absorbance， A)值，表示各組ADSCs增殖活性。各組設(shè)與實(shí)驗(yàn)平行不加細(xì)胞只加培養(yǎng)液的空白對(duì)照，以空白孔A值調(diào)零后比色。以后每天重復(fù)上述CCK-8增殖實(shí)驗(yàn)，共檢測(cè)7 d 。上述細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.9定性分析堿性磷酸酶(alkalinephosphatase,ALP)及鈣結(jié)節(jié)取第2代ADSCs，用含10% FBS的LG-DMEM培養(yǎng)基制備細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為5×104/ml，按每孔1種于24孔培養(yǎng)板內(nèi)，培養(yǎng)24 h后，吸去培養(yǎng)基。將24孔板中細(xì)胞按EPC-CM濃度分為3組：對(duì)照組、50% EPC-CM組和100%EPC-CM組。每組加入0.5 ml成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基和0.5 ml不同濃度的EPC條件培養(yǎng)基。參考文獻(xiàn)[5]方法，在培養(yǎng)第14天及第21天分別進(jìn)行ALP及鈣結(jié)節(jié)的定性檢測(cè)。使用(BCIP/NBT)ALP顯色試劑盒進(jìn)行ALP染色，倒置顯微鏡下觀察并采集圖像。使用茜素紅染料對(duì)鈣結(jié)節(jié)進(jìn)行染色，倒置顯微鏡下觀察并采集圖像。

1.10定量分析ALP及鈣離子含量按上述分組，每組選取24孔板中6孔進(jìn)行定量分析。在培養(yǎng)第14天、21天進(jìn)行鈣離子定量分析，進(jìn)行定量分析之前48 h換液，茜素紅染色后，每組加入1%氯化十六烷基吡啶400 μl，室溫反應(yīng)10 min后，酶標(biāo)儀檢測(cè)560 nm波長(zhǎng)處的A值，以A值表示各組中鈣離子含量。最后以空白孔A值調(diào)零比色。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。進(jìn)行ALP定量檢測(cè)前，首先PBS沖洗細(xì)胞2次，0.1% Triton-X100裂解細(xì)胞后收集裂解液，12 000 r/min離心10 min后取上清液按ALP檢測(cè)試劑盒指示進(jìn)一步行ALP定量檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次, ALP活性以U/L表示。二喹啉甲酸(BCA)法測(cè)定各組細(xì)胞總蛋白濃度作為參照。

2　結(jié)果

2.1EPCs的培養(yǎng)和鑒定EPCs約72 h后可見(jiàn)細(xì)胞貼壁，5 d后可見(jiàn)長(zhǎng)梭形細(xì)胞集落形成，8～10 d可見(jiàn)細(xì)胞達(dá)到80%～90%融合，細(xì)胞集落呈典型“鋪路石”狀(圖1A)。第二代EPCs免疫熒光鑒定結(jié)果顯示：VEGER-2陽(yáng)性(圖1B、1C)， CD133陽(yáng)性(圖1D)。在鋪被基質(zhì)膠的96孔板中可形成“管腔樣”結(jié)構(gòu) (圖2A)，且能夠攝取乙?；兔芏戎鞍?圖2C)和荊豆凝集素-1(圖2D)，表明目的細(xì)胞為EPCs。

2.2ADSCs的培養(yǎng)和鑒定ADSCs于48 h貼壁，原代細(xì)胞形態(tài)不均一，呈成纖維細(xì)胞樣的長(zhǎng)梭形(圖3A)。培養(yǎng)48 h后可見(jiàn)集落形成；培養(yǎng)約7 d時(shí)細(xì)胞鋪滿(mǎn)，經(jīng)傳代培養(yǎng)后形態(tài)逐漸均一呈“旋渦”(圖3B)。CCK-8檢測(cè)ADSCs增殖曲線(xiàn)與文獻(xiàn)[6]報(bào)道的ADSCs生長(zhǎng)趨勢(shì)一致。第二代ADSCs免疫熒光鑒定顯示：CD90陽(yáng)性(圖3C、3D)。經(jīng)誘導(dǎo)分化培養(yǎng)后能向成骨、成脂及成軟骨方向分化(圖4)。表明目的細(xì)胞為ADSCs。

圖1　EPCs形態(tài)學(xué)鑒定　×100

A:EPCs原代培養(yǎng)7 d；B：DAPI細(xì)胞核染陽(yáng)性；C：FITC標(biāo)記的VEGFR-2染色陽(yáng)性；D：TRITC標(biāo)記的CD133染色陽(yáng)性

圖2　EPCs的功能鑒定

A：EPCs具有成血管能力×100；B：DAPI細(xì)胞核染陽(yáng)性×200；C：攝取乙?；兔芏戎鞍啄芰?陽(yáng)性)×200；D：結(jié)合FITC-UEA-1能力(陽(yáng)性)×200

2.3ADSCs的增殖活性CCK-8法檢測(cè)ADSCs增殖能力：生長(zhǎng)培養(yǎng)基培養(yǎng)ADSCs可見(jiàn)ADSCs增殖曲線(xiàn)與文獻(xiàn)報(bào)道一致(圖5A)。隨著EPCs條件培養(yǎng)基濃度的增加，ADSCs的增殖活性逐漸增加。ADSCs培養(yǎng)7 d 時(shí)間內(nèi)可見(jiàn)3組ADSCs增殖趨勢(shì)相一致(圖5B)。50%EPC-CM組和100%EPC-CM組的ADSCs在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的增殖活性均高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1)。且除外第3天，100%EPC-CM組的ADSC在各時(shí)間點(diǎn)的增殖活性高于50%EPC-CM組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖5C、表1。

圖3　ADSCs形態(tài)學(xué)鑒定　×100A:ADSCs原代培養(yǎng)5 d；B：第二代ADSCs；C：DAPI細(xì)胞核染陽(yáng)性；D：FITC標(biāo)記的CD90染色陽(yáng)性

圖4　ADSCs的功能鑒定　×100

A：ADSCs成脂誘導(dǎo)分化后油紅O染色陽(yáng)性；B：ADSCs成軟骨誘導(dǎo)分化后甲苯胺藍(lán)染色陽(yáng)性；C：ADSCs成骨誘導(dǎo)分化后茜素紅染色陽(yáng)性

表1　3組中ADSCs 1～7 d的吸光度值與統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)F值

2.4ALP和鈣離子的定性檢測(cè)ADSCs培養(yǎng)14 d及21 d后，ALP染色可見(jiàn)細(xì)胞內(nèi)藍(lán)黑色顆粒物，且隨著時(shí)間和EPC-CM濃度的增加，各組中染色均可見(jiàn)藍(lán)紫色顆粒物，見(jiàn)圖6。隨著誘導(dǎo)培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，各組中茜素紅染色均可見(jiàn)紅染的鈣結(jié)節(jié)，見(jiàn)圖7。

2.5ALP和鈣離子的定量檢測(cè)ALP活性檢測(cè)：ADSCs誘導(dǎo)培養(yǎng)14 d 后， 50%EPC-CM組中ALP活性與對(duì)照組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而100%EPC-CM組中ALP活性顯著高于對(duì)照組和50%EPC-CM組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=42.085、56.400，P<0.01)。誘導(dǎo)培養(yǎng)21 d 后，50%EPC-CM組與100%EPC-CM組ALP活性均高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=11.211、18.304，P<0.01)，且100% EPC-CM組ALP活性高于50%EPC-CM組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=5.981，P<0.05)，見(jiàn)圖8。鈣離子定量檢測(cè)(A560檢測(cè))：誘導(dǎo)培養(yǎng)14 d 時(shí)，50%EPC-CM組和100%EPC-CM組的鈣離子含量均高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=420.346、3 685.101，P<0.01)；誘導(dǎo)培養(yǎng)21 d 時(shí)，50% EPC-CM組和100% EPC-CM組的鈣離子含量均高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=91.933、174.840，P<0.01)。見(jiàn)圖9。

圖5　ADSCs增殖曲線(xiàn)

A：ADSCs于生長(zhǎng)培養(yǎng)基中增殖曲線(xiàn)；B：三組ADSCs生長(zhǎng)曲線(xiàn)；C：三組ADSCs增殖速率柱狀圖；與對(duì)照組比較：*P<0.05；與50%EPC-CM組比較：#P<0.05

3　討論

髓芯減壓和間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells, MSCs)移植對(duì)于早期股骨頭壞死的治療是可選的方案。但部分患者術(shù)后未能達(dá)到理想效果[7]。影響手術(shù)成敗的因素包括股骨頭壞死灶的大小，壞死的病因，以及移植所用的MSCs的活性[7-8]。有研究[9]表明激素性股骨頭壞死和酒精性股骨頭壞死的患者，其骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow derived mesenchymal stem cells ,BMSCs)的成骨活性大大降低，這可能是導(dǎo)致手術(shù)失敗的原因之一。為了應(yīng)對(duì)手術(shù)失敗的風(fēng)險(xiǎn)，尋找其他來(lái)源的MSCs就顯得非常重要。Wyles et al[1]已經(jīng)證實(shí)，人來(lái)源的ADSCs在體外的增殖活性和成骨能力均高于BMSCs。Strioga et al[6]報(bào)道這可能是因?yàn)锳DSCs來(lái)源于脂肪，在人體中更類(lèi)似于生理緩沖區(qū)，BMSCs則需要不斷適應(yīng)身體動(dòng)態(tài)環(huán)境的刺激。且相比較與BMSCs，ADSCs具有多向分化能力，而且只需要極小的創(chuàng)口下即可在人體的脂肪組織中獲取，其體外擴(kuò)增速度遠(yuǎn)高于BMSCs，是組織工程可以選用的優(yōu)良種子細(xì)胞。

盡管MSCs和EPCs之間的直接和間接相互作用機(jī)制仍未能完全闡述清楚，但是Kim et al[10]已經(jīng)證實(shí)了骨髓來(lái)源的細(xì)胞能夠表達(dá)和分泌血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)等數(shù)種細(xì)胞因子，而VEGF能夠促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖和成骨分化能力[11]。ALP是一種細(xì)胞成骨的早期標(biāo)志物，Zhao et al[12]已經(jīng)證實(shí)在EPCs和MSCs直接共培養(yǎng)的情況下ALP活性會(huì)出現(xiàn)明顯增加，但難以確定這種作用是否只存在于兩種細(xì)胞直接接觸的情況下，以及細(xì)胞分泌的VEGF等細(xì)胞因子對(duì)這種促進(jìn)作用是否具有影響。體外環(huán)境與體內(nèi)環(huán)境不同，體外環(huán)境在可控范圍內(nèi)可以避免大部分的其他細(xì)胞和分泌蛋白的干擾，體外環(huán)境也更容易控制，能夠真實(shí)地反映實(shí)驗(yàn)因素產(chǎn)生的影響，所以本實(shí)驗(yàn)采用在體外分離培養(yǎng)兩種細(xì)胞，通過(guò)制作EPCs的條件培養(yǎng)基培養(yǎng)MSCs，以研究EPCs分泌的細(xì)胞因子對(duì)于MSCs的增殖與分化是否仍存在影響。

在骨的發(fā)育、修復(fù)、重構(gòu)等過(guò)程中，快速的血管化可以供應(yīng)給骨質(zhì)內(nèi)部細(xì)胞足夠的營(yíng)養(yǎng)、氧氣并幫助其運(yùn)送代謝廢物。同時(shí)在組織工程中血管還可以幫助運(yùn)送降解的支架，促進(jìn)新骨的形成。Kaigler et al[13]將內(nèi)皮細(xì)胞分別培養(yǎng)于3種不同的培養(yǎng)基中，包括單一的生長(zhǎng)培養(yǎng)基、加入了VEGF的生長(zhǎng)培養(yǎng)基和加入了BMSCs條件培養(yǎng)基的生長(zhǎng)培養(yǎng)基。其中后兩種培養(yǎng)基中培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞其血管生發(fā)速度大大提升。這個(gè)實(shí)驗(yàn)證實(shí)了將成血管細(xì)胞與組織工程的種子細(xì)胞一起移植，能夠大大的促進(jìn)移植材料的血管化速度。

本實(shí)驗(yàn)雖證實(shí)了EPCs條件培養(yǎng)基可促進(jìn)ADSCs的增殖和分化，且隨著條件培養(yǎng)基濃度的增加，這種影響也逐漸增強(qiáng)，但并未完全闡明條件培養(yǎng)基中何種細(xì)胞因子通過(guò)何種方式發(fā)揮作用，且未能盡述其中的細(xì)胞因子是否具有協(xié)同作用或拮抗作用。且體內(nèi)環(huán)境與體外環(huán)境存在較大差異，兩種細(xì)胞在活體內(nèi)的相互作用方式及相互影響的作用機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。

圖6　ALP定性鑒定　ALP染色×100

圖7　鈣結(jié)節(jié)定性鑒定　茜素紅染色×100

圖8　ADSCs經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)后ALP定量檢測(cè)

與對(duì)照組相比：*P<0.05；與50% EPC-CM組相比：#P<0.05

圖9　鈣離子含量定量檢測(cè)

參考文獻(xiàn)