胡利兵，王銀龍，朱友明

口腔癌的高發(fā)病率和死亡率已經(jīng)成為嚴(yán)重影響公共健康的疾病之一，口腔癌的復(fù)發(fā)率存在逐年上升的趨勢(shì)?？谇荒[瘤由于其發(fā)生部位、組織來源和腫瘤性質(zhì)復(fù)雜等特點(diǎn)，因此其治療手段也不盡相同。手術(shù)及放、化療等傳統(tǒng)治療方法可能影響面部容貌、語言功能和人類自身的免疫力等，因此迫切需要尋求更加有效的治療口腔腫瘤的方法，因此免疫治療、基因療法等新興治療方法的應(yīng)用逐漸成為口腔腫瘤治療研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。hace1是一種腫瘤抑制基因，具有抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，促使腫瘤細(xì)胞凋亡的作用。檢測(cè)hace1基因在口腔腫瘤中的表達(dá)，研究其對(duì)口腔腫瘤細(xì)胞增殖、遷移能力的影響，預(yù)測(cè)hace1的miRNA，并研究其hace1的關(guān)系，檢測(cè)miRNA-3129在口腔腫瘤中的表達(dá)，探討miR-3129和hace1是否可以作為口腔腫瘤檢測(cè)和治療的一個(gè)新靶點(diǎn)。

1　材料與方法

1.1主要實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1細(xì)胞腫瘤細(xì)胞株scc-3來源于江蘇省藥物研究所；病毒包裝所用293T細(xì)胞由中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)細(xì)胞生物學(xué)吳緬實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.2菌種和載體E.colidh5α菌株由安徽醫(yī)科大學(xué)省級(jí)口腔重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存；實(shí)驗(yàn)中用于敲低hace1基因的shhace1來源于中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)細(xì)胞生物學(xué)吳緬實(shí)驗(yàn)室(購自美國Sigma公司的人和鼠的shRNA庫)。實(shí)驗(yàn)用于慢病毒包裝系統(tǒng)的4質(zhì)粒(Plko.1、VSV-G、REV、GAG )包裝系統(tǒng)由中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)細(xì)胞生物學(xué)吳緬實(shí)驗(yàn)室提供，這4個(gè)質(zhì)粒中Plko.1為慢病毒表達(dá)載體，另外3個(gè)(VSV-G、REV、GAG)為慢病毒包裝載體。

1.1.3標(biāo)本組織來源15例實(shí)驗(yàn)標(biāo)本取自2014年5月～2015年5月經(jīng)安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院和安徽省口腔醫(yī)院頜面外科手術(shù)切除、病理證實(shí)的涎腺病變組織，對(duì)照標(biāo)本為瘤旁正常組織均來自相應(yīng)患者腫瘤安全邊緣10 mm以上的組織。所有患者除口腔腫瘤病變外，并無其他明顯的全身系統(tǒng)性疾病，且所有患者未經(jīng)放療、化療等其它手段治療。

1.1.4主要試劑DMEM培養(yǎng)基(高糖型)、鏈霉素和青霉素(美國Gibco公司)；胎牛血清(美國HyClone公司)；質(zhì)粒提取試劑盒(美國Axygen公司)；逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)試劑盒、實(shí)時(shí)定量反應(yīng)試劑盒(日本寶生物公司)；RNA抽提試劑TRIzol (上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；噻唑藍(lán)(MTT)、聚凝胺(polybrene)、嘌呤霉素(puromycin)(美國Sigma公司)；酵母提取物、瓊脂A、蛋白胨、氯化鈉、tris、甘氨酸等(上海生物工程有限公司)。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，加入鏈霉素和青霉素，置5% CO2、飽和濕度、37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)293T細(xì)胞和scc-3細(xì)胞株，據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)情況，2～3 d傳代一次，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2過表達(dá)hace1的構(gòu)建及目的基因擴(kuò)增Pubmed檢索人源性的hace1的CDS序列，DNAclub找出hace1CDS序列中存在的限制性酶切位點(diǎn)，設(shè)計(jì)出hace1基因的引物序列(F：5′-GCGAATTCATGGAGAGAGCGATGGAGCAACTC -3′，上游引物的酶切位點(diǎn)為EcoR Ⅰ，R：5′-GCACGCGTTTATGCCATTGTGTAACCATAGCT -3′，下游引物的酶切位點(diǎn)為Mlu1)，引物均由上海生物工程有限公司合成。以含有待擴(kuò)增序列的DNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，30 μl總體積包括：上游引物1 μl，下游引物1 μl，cDNA 1 μl，無菌蒸餾水12 μl，2×PfuPCRMasterMix 15 μl。在PCR擴(kuò)增儀上完成PCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件如下：95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃變性1 min，56 ℃退火1 min，72 ℃延伸3 min，共30個(gè)循環(huán)，再72 ℃延伸10 min，置4 ℃保溫。瓊脂糖凝膠電泳PCR反應(yīng)產(chǎn)物，紫外監(jiān)測(cè)儀觀察電泳結(jié)果，并回收目的條帶。

1.2.3質(zhì)粒的擴(kuò)增和提取將設(shè)計(jì)的限制性內(nèi)切酶37 ℃水浴酶切表達(dá)載體和對(duì)應(yīng)DNA片段，瓊脂糖凝膠電泳酶切產(chǎn)物并回收，并同載體在T4連接酶下連接1 h，再轉(zhuǎn)入感受態(tài)大腸桿菌dh5α，24 h后手抽酶切驗(yàn)證，使含有hace1片段載體的大腸桿菌dh5α菌株通過測(cè)序獲得。

1.2.4shhace1病毒的包裝及感染在6孔板中的hek 293T細(xì)胞中轉(zhuǎn)染2 μg Plko.1空載或Plko.1-hace1、2 μg pGAG 、2 μg pREV和1 μg pVSVG，先在純DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)6 h，再更換含有20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，含有病毒的培養(yǎng)基上清收集后，用0.45 μm PVDF濾頭 (Millipore)過濾上清液。scc-3細(xì)胞分別感染過濾后含有病毒的培養(yǎng)基上清液，同時(shí)加入 4 μg/ml polybrene (美國Sigma公司)，37 ℃孵育24 h，再更換含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h,同時(shí)加入5 μg/ml puromycin 篩選細(xì)胞。

1.2.5劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力取處于慢病毒感染的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的scc-3細(xì)胞，5×105個(gè)/每孔，6孔板中均勻接種，分正常對(duì)照組、hace1過表達(dá)組和shhace1轉(zhuǎn)染組，均勻劃出2條劃痕待24 h長(zhǎng)至90%后，此時(shí)作為0 h時(shí)間點(diǎn)，hochest染色細(xì)胞，在熒光顯微鏡下0、24、48 h時(shí)分別觀察細(xì)胞遷移情況，并進(jìn)行拍照、比較。

1.2.6MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖能力按對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的scc-3細(xì)胞，分為正常對(duì)照組、hace1過表達(dá)組和shhace1轉(zhuǎn)染組，96孔板按2 000個(gè)/每孔均勻接種，加入體積200 μl/每孔培養(yǎng)基培養(yǎng)，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，待細(xì)胞貼壁后，按時(shí)間梯度加入藥物，加入20 μl MTT溶液(終濃度為5 g/L),37 ℃孵育4 h，吸走上清液，加入DMSO 150 μl/每孔，震蕩10 min，在酶聯(lián)免疫監(jiān)測(cè)儀上測(cè)定各孔吸收值，并繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

1.2.7實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶連反應(yīng)(real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction, QRT-PCR)檢測(cè)hace1 mRNA的表達(dá)水平，cDNA合成和總RNA提?。喝?00 mg涎腺腫瘤組織剪碎，TRIzol(日本TaKaRa公司)法獲取組織總RNA。再進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄(試劑盒購自日本TaKaRa公司)獲得cDNA，置-20 ℃保存?zhèn)溆谩RT-PCR檢測(cè)hace1 mRNA 的相對(duì)表達(dá)水平，設(shè)計(jì)合成經(jīng)GenBank檢索的內(nèi)參β-actin的引物和hace1。擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性1 min，94 ℃變性1 min，56 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，共30個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)反應(yīng)產(chǎn)物，在紫外燈下觀察電泳后的電泳條帶并拍照。

2　結(jié)果

2.1hace1在口腔腫瘤組織中的表達(dá)hace1作為一個(gè)腫瘤抑制基因在很多癌癥組織發(fā)現(xiàn)了低表達(dá)，但是其與口腔腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)系一直沒有相關(guān)報(bào)道，通過QRT-PCR方法對(duì)比分析收集的15組口腔腫瘤組織及瘤旁正常組織的hace1 mRNA表達(dá)水平，其中12組中口腔腫瘤組織的hace1的mRNA表達(dá)水平較瘤旁正常組織低，另外3組中hace1沒有發(fā)現(xiàn)大的變化(圖1)。比較得出，hace1的表達(dá)水平在口腔腫瘤組織中相較正常組織呈減少趨勢(shì)，推斷hace1可能與口腔腫瘤的發(fā)生相關(guān)。

2.2hace1對(duì)口腔腫瘤細(xì)胞遷移和增殖的影響分別計(jì)數(shù)對(duì)照組和hace1過表達(dá)組的scc3細(xì)胞，轉(zhuǎn)同樣的細(xì)胞入12孔板，待細(xì)胞完全貼壁后，通過劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)兩組scc-3細(xì)胞的遷移速度，結(jié)果表明當(dāng)在scc3細(xì)胞中敲低hace1的表達(dá)，shhace1組細(xì)胞的遷移速度較對(duì)照組明顯加快(圖2)，實(shí)驗(yàn)表明，hace1基因能抑制口腔腫瘤細(xì)胞的遷移，同樣通過MTT試驗(yàn)，比較敲低對(duì)照組與hace1敲低組細(xì)胞的增殖情況顯示，當(dāng)在scc3細(xì)胞中敲低hace1的表達(dá)，shhace1組細(xì)胞的增殖速度較對(duì)照組明顯加快(圖3)，矩形圖表示成功敲低了hace1的表達(dá)(圖4)，表明hace1基因能抑制口腔腫瘤細(xì)胞的增殖，以上說明抑癌基因hace1在口腔腫瘤的發(fā)展過程中起著重要的作用。

圖1　QRT-PCR法分析口腔腫瘤組織及瘤旁正常組織的hace1 mRNA表達(dá)水平

圖2　劃痕試驗(yàn)比較敲低對(duì)照組與hace1敲低組細(xì)胞的遷移情況

2.3miR-3129調(diào)節(jié)hace1miRNA表達(dá)水平的分析hace1在口腔腫瘤中表達(dá)水平較低，是何種原因?qū)е耯ace1的表達(dá)水平降低，通過生物信息學(xué)的方法，在targetscan 上對(duì)hace1的潛在miRNA進(jìn)行預(yù)測(cè)顯示，miR-3129潛在靶向hace1 3′-UTR 23位

圖3　MTT試驗(yàn)比較敲低對(duì)照組與hace1敲低組細(xì)胞的增殖情況

圖4　QRT-PCR檢測(cè)敲低對(duì)照組與hace1敲低組hace1 mRNA的表達(dá)水平

～30位的之間的堿基(圖5)。通過luciferase試驗(yàn)證實(shí)miR-3129的確靶向hace1 3′-UTR 23位～30位的之間的堿基(圖6)，當(dāng)在scc3細(xì)胞系中轉(zhuǎn)入miR-3129 mimics，顯示hace1的mRNA表達(dá)水平發(fā)生下調(diào)(圖7)，而在scc3細(xì)胞系中轉(zhuǎn)入miR-3129 inhibiter，顯示hace1的mRNA表達(dá)水平發(fā)生上升(圖8)，說明miR-3129通過靶向hace1 3′-UTR調(diào)控hace1的表達(dá)水平。

圖5　miR-3129潛在靶向hace1 3′-UTR 23位～30位的之間的堿基

圖6　luciferase試驗(yàn)證實(shí)miR-3129靶向>hace1 3′-UTR23位-30位的之間的堿基

1：Psi-victor；2：Psi-hace1 3′-UTR；3：Psi-hace1 3′-UTR-mut

圖7　QRT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)入miR對(duì)照或miR-3129 mimics時(shí)hace1 mRNA的表達(dá)水平

A：miR-3129的表達(dá)水平；B：hace1 mRNA的表達(dá)水平；1：miR對(duì)照；2：miR-3129 mimics

圖8　QRT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)入miR對(duì)照和miR-3129 inhibiter時(shí)hace1 mRNA的表達(dá)水平

A：miR-3129的表達(dá)水平；B：hace1 mRNA的表達(dá)水平；1：miR對(duì)照；2：miR-3129 inhibiter

2.4miR-3129在口腔腫瘤組織中的表達(dá)miR-3129作為一個(gè)miRNA與腫瘤之間的關(guān)系至今鮮有報(bào)道，其在口腔腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮什么樣的作用，通過對(duì)收集的15組口腔腫瘤組織及瘤旁正常組織的miR-3129進(jìn)行QRT-PCR對(duì)比分析，其中12組中口腔腫瘤組織的miR-3129的mRNA表達(dá)水平較瘤旁正常組織高，另外3組中miR-3129沒有發(fā)現(xiàn)大的變化(圖9)。比較得出，miR-3129的表達(dá)水平在口腔腫瘤組織中相較于正常組織呈增加趨勢(shì)，且在口腔腫瘤組織及瘤旁正常組織中miR-3129與hace1表達(dá)呈負(fù)相關(guān)性，推斷miR-3129可能與口腔腫瘤的發(fā)生相關(guān)。miR-3129可能通過抑制hace1促進(jìn)口腔腫瘤的發(fā)生與發(fā)展。

3　討論

基因治療通過對(duì)腫瘤細(xì)胞中途變得原癌基因和抑癌基因的靶向，能有效地治療腫瘤，腫瘤基因治療著非常重要的臨床意義，其次通過了解各組織器官中那些基因的突變更易導(dǎo)致該部位腫瘤的發(fā)生，因此在腫瘤的診斷方面也能提供較好的依據(jù)。目前對(duì)于口腔腫瘤的原癌基因和抑癌基因主要集中于研究C-myc、ras、c-erbB(原癌基因)和p53、APC、p16、Rb(抑癌基因)等基因[1]。hace1作為一個(gè)腫瘤抑制基因與口腔腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)系一直沒有相關(guān)報(bào)道，但是已在大多數(shù)腫瘤中發(fā)現(xiàn)了hace1的突變和失活，提示hace1可能在口腔腫瘤的發(fā)展中也起著重要的作用。

hace1是E3泛素接酶HECT家族成員之一,其為位于6q21染色體上的潛在腫瘤抑制基因[2],其功能缺失在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要的作用。有研究[3]表明hace1泛素化修飾自噬受體OPTN，泛素化修飾后的OPTN能被自噬蛋白p62所識(shí)別，并形成大的自噬受體復(fù)合物，增加細(xì)胞內(nèi)通過自噬途徑降解氧化損傷的蛋白量，抑制細(xì)胞增殖，該通路通過激活細(xì)胞自噬并抑制腫瘤。另有報(bào)道[4]顯示，hace1能泛素化降解Rac1抑制腫瘤的生長(zhǎng)，在hace1表達(dá)缺失或突變的細(xì)胞中，Rac1的活性會(huì)被激活或是進(jìn)一步加強(qiáng)，抑制了腫瘤細(xì)胞的凋亡，同時(shí)會(huì)促進(jìn)腫瘤的進(jìn)一步生長(zhǎng)或發(fā)生侵潤(rùn)和轉(zhuǎn)移。多項(xiàng)研究[5]表明hace1在多數(shù)惡性腫瘤中表達(dá)下調(diào)和突變，如在臨床乳腺癌中hace1表達(dá)缺失是最常見的突變形式，其蛋白失活在乳腺癌的發(fā)展過程中起著關(guān)鍵的作用。Sakata et al[6]分析26例腎母細(xì)胞瘤患者中發(fā)現(xiàn)，約77%的腫瘤樣本中幾乎檢測(cè)不到hace1的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)。hace1的表達(dá)水平在肝癌中表達(dá)降低，在直腸癌、肝癌和胃癌中都發(fā)現(xiàn)了hace1基因的甲基化，研究[7]顯示hace1基因的甲基化與腫瘤的大小，是否淋巴轉(zhuǎn)移存在直接相關(guān)性。

圖9　QRT-PCR分析口腔腫瘤組織及瘤旁正常組織的miR-3129 RNA表達(dá)水平

miRNA是一類內(nèi)生的，由內(nèi)源基因編碼的長(zhǎng)度在18～24個(gè)短序列核苷酸的小RNA分子，miRNA使一類短鏈非編碼RNA，其不能翻譯成蛋白質(zhì)，但是其在生命體中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用，其主要通過基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，影響蛋白質(zhì)的正常表達(dá)發(fā)揮功能，參與到細(xì)胞分化、生長(zhǎng)、增殖、衰老和調(diào)亡等多種生命活動(dòng)[8]。研究[9]顯示 miRNA-221、miRNA-222的低表達(dá)可上調(diào)TIMP3表達(dá)，從而使乳腺癌細(xì)胞系MCF-7的增殖和遷移能力得到抑制。miRNA-27a/b可促進(jìn)腫瘤血管的生成，并誘導(dǎo)腫瘤轉(zhuǎn)移的發(fā)生。研究[10]通過檢測(cè)485例腸癌患者中miRNA-135b的表達(dá)水平顯示，miRNA-135b在腫瘤中的表達(dá)水平較正常組織約4倍，并且miRNA-135b表達(dá)水平最高的患者存活時(shí)間最短。另有研究[11]顯示miR-34a決定了腫瘤干細(xì)胞是進(jìn)行自我更新還是向分化方向發(fā)展，miR-34a通過減少Notch信號(hào)，促進(jìn)細(xì)胞分化。近年來國內(nèi)對(duì)于miRNA的研究也取得了重要的進(jìn)步，研究[12]表明miR-621抑制fbxo11的表達(dá)，使得乳腺癌對(duì)于化療更加敏感，研究指出miR-621可作為乳腺癌潛在的治療靶標(biāo)。

本次實(shí)驗(yàn)對(duì)收集的15組口腔腫瘤組織及瘤旁正常組織的hace1 mRNA表達(dá)水平進(jìn)行QRT-PCR檢測(cè)，其中12組中hace1的mRNA表達(dá)水平口腔腫瘤組織較瘤旁正常組織低，另外3組中hace1未發(fā)現(xiàn)多大的變化?？傻贸觯谇荒[瘤組織中hace1的表達(dá)水平相較于正常組織呈減少趨勢(shì)，推斷hace1可能與口腔腫瘤的發(fā)生相關(guān)。另外通過QRT-PCR方法對(duì)比分析收集的15組口腔腫瘤組織及瘤旁正常組織的miR-3129，其中12組中miR-3129的mRNA表達(dá)水平口腔腫瘤組織較瘤旁正常組織高，其余3組中miR-3129未發(fā)現(xiàn)多大的變化。可得出，口腔腫瘤組織中miR-3129的表達(dá)水平相較于正常組織呈增加趨勢(shì)，且miR-3129與hace1表達(dá)在口腔腫瘤組織及瘤旁正常組織中呈負(fù)相關(guān)性，推斷miR-3129可能與口腔腫瘤的發(fā)生相關(guān)。miR-3129可能通過抑制hace1促進(jìn)口腔腫瘤的發(fā)生與發(fā)展。

通過生物信息學(xué)的方法預(yù)測(cè)hace1的潛在miRNA顯示，miR-3129潛在靶向hace1 3′-UTR 23位～30位的之間的堿基。且通過luciferase試驗(yàn)得以證實(shí)，當(dāng)把miR-3129 mimics轉(zhuǎn)入到scc3細(xì)胞系中，顯示 hace1的mRNA表達(dá)水平發(fā)生下調(diào)，而把miR-3129 inhibiter轉(zhuǎn)入到scc3細(xì)胞系中，顯示hace1的mRNA表達(dá)水平發(fā)生上升，說明miR-3129是通過靶向hace1 3′-UTR來調(diào)控hace1的表達(dá)水平。本課題研究顯示hace1在口腔腫瘤中低表達(dá)，并抑制口腔腫瘤的遷移去增殖，miRNA-3129可靶向hace1 3′UTR，并調(diào)節(jié)hace1表達(dá)水平，miRNA-3129在口腔腫瘤中高表達(dá)，與hace1表達(dá)成負(fù)相關(guān)性，可能通過靶向hace1促進(jìn)口腔腫瘤生長(zhǎng)，提示miR-3129和hace1可能作為口腔腫瘤檢測(cè)和治療的一個(gè)新靶點(diǎn)。