王詩卉，羅秋玲，劉佳，劉立明，陳修來

1 江南大學 食品科學與技術國家重點實驗室，江蘇 無錫 214122

2 江南大學 工業(yè)生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫 214122

3 江南大學 糧食發(fā)酵工藝與技術國家工程實驗室，江蘇 無錫 214122

3-羥基丁酮 (Acetoin) 具有特殊的奶油香氣，天然存在于可可、干酪、香蕉、葡萄、玉米等許多食品中，是一種廣泛使用的食品級香料[1]。同時，3-羥基丁酮作為一種重要的四碳平臺化合物，被美國能源部列為30種優(yōu)先開發(fā)利用的平臺化合物之一[2]，具有高附加值，可廣泛應用于手性藥物和化學中間體的合成[3]。

目前，3-羥基丁酮的生產(chǎn)方法主要有化學合成、酶轉化和微生物發(fā)酵法[4]。相較于其他方法，微生物發(fā)酵法具有高效、穩(wěn)定、低碳等明顯優(yōu)勢，能實現(xiàn)大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)，從而逐漸成為人們關注的焦點。Zhang等篩得一株高產(chǎn) 3-羥基丁酮的多粘類芽孢桿菌，通過連續(xù)性統(tǒng)計學實驗對發(fā)酵培養(yǎng)基成分進行優(yōu)化，并利用兩階段攪拌轉速控制策略得到3-羥基丁酮55.3 g/L[5]。Sun等經(jīng)過發(fā)酵優(yōu)化，采用兩階段溶氧控制策略，使得一株粘質沙雷氏菌的3-羥基丁酮產(chǎn)量達到75.2 g/L[6]。Li等通過代謝工程改造，弱化一株地衣芽孢桿菌的 2,3-丁二醇脫氫酶，并利用三階段攪拌轉速控制及pH控制的發(fā)酵策略得到3-羥基丁酮78.79 g/L，為目前報道以微生物發(fā)酵法生產(chǎn) 3-羥基丁酮的最高產(chǎn)量[7]。但是上述發(fā)酵法生產(chǎn)3-羥基丁酮的研究主要集中于發(fā)酵工藝的優(yōu)化，大部分產(chǎn)量也相對較低。

3-羥基丁酮高產(chǎn)菌株的選育多是通過傳統(tǒng)誘變 (如物理誘變和化學誘變) 或簡單篩選 (VP試驗) 而獲得[8]。然而，相較于傳統(tǒng)單一誘變方法的低突變率和操作安全性不足等問題，整合了多種誘變方法的復合誘變具有協(xié)調(diào)效應，因其突變率高逐漸成為應用熱點。Jia等通過紫外線和硫酸二乙酯 (DES) 復合誘變篩得一株耐熱的高產(chǎn) 3-羥基丁酮的枯草芽孢桿菌突變株，通過優(yōu)化發(fā)酵溫度，以玉米纖維進行同步糖化發(fā)酵，得到3-羥基丁酮22.76 g/L，且產(chǎn)率達0.46 g/g (玉米秸稈)[9]。ARTP能夠均勻發(fā)射等離子體作用于微生物細胞，有效造成 DNA多樣性的損傷，利用胞內(nèi)啟動的錯配修復機制形成遺傳穩(wěn)定、種類豐富的突變體，突變率高，操作簡便、安全[10-11]。60Co γ射線輻照能夠直接引起細胞染色體損傷、斷裂以及DNA中堿基的變化，產(chǎn)生染色體突變和基因突變，具有突變率高、不易發(fā)生回復突變等優(yōu)勢[12]。因此，本實驗采用ARTP和60Co γ射線復合誘變的方式，對產(chǎn) 3-羥基丁酮解淀粉芽孢桿菌[13]進行復合誘變篩選，以期提高突變率[14]，并獲得3-羥基丁酮高產(chǎn)菌株。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

解淀粉芽孢桿菌Bacillus amylolique faciensFMME088由本實驗室保藏[14]。

1.1.2 主要試劑

Acetoin、(R,R)-(-)-2,3-Butanediol購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；其他化學試劑購自國藥集團化學試劑有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

固體培養(yǎng)基 (g/L)：葡萄糖20，酵母粉10，大豆蛋白胨10，氯化鈉5，瓊脂粉20，pH 7.0。

固體篩選培養(yǎng)基 (g/L)：3-羥基丁酮（0、40、45、50、55、60或65），葡萄糖20，酵母粉10，大豆蛋白胨10，氯化鈉5，瓊脂粉20，pH 6.5。固體培養(yǎng)基冷卻至 60 ℃，加入不同濃度的 3-羥基丁酮溶液 (無菌水溶解、0.22 μm無機濾膜過濾除菌)，混合均勻倒平板。

液體篩選培養(yǎng)基 (g/L)：葡萄糖180，酵母粉15，大豆蛋白胨 15，MgSO4·7H2O 0.4，K2HPO43，KH2PO43。

種子培養(yǎng)基 (g/L)：葡萄糖60，酵母粉10，蛋白胨10，牛肉膏10，氯化鈉0.5。

發(fā)酵優(yōu)化培養(yǎng)基 (g/L)：葡萄糖 (180、200、210或 220)，酵母粉 15，大豆蛋白胨 15，MgSO4·7H2O 0.4， K2HPO43， KH2PO43，CH3COONa (0、0.25、0.5 或 1.0)。

發(fā)酵培養(yǎng)基 (g/L)：葡萄糖210，酵母粉15，大豆蛋白胨 15，MgSO4·7H2O 0.4，K2HPO43，KH2PO43，CH3COONa 0.5。

1.1.4 主要儀器

Ultimate 3000高效液相色譜儀購自美國戴安公司；ARTP育種機來自思源清生物科技有限公司；60Co γ射線輻照設備由蘇州大學提供；5 L發(fā)酵罐購自上海保興生物設備工程有限公司；30 L發(fā)酵罐購自瑞士伊浮森生物技術有限公司。

1.2 菌株培養(yǎng)條件

種子培養(yǎng)條件：從甘油管保藏的B. amyloliquefaciensFMME088取 200 μL 接種于裝有50 mL無菌種子培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，37 ℃、200 r/min培養(yǎng)12 h。

搖瓶發(fā)酵條件：取種子培養(yǎng)物接種于裝有70 mL無菌液體篩選培養(yǎng)基的750 mL具擋板三角瓶中，接種量為10% (V/V)，37 ℃、200 r/min發(fā)酵培養(yǎng)48 h 。

5 L發(fā)酵罐發(fā)酵條件：5 L發(fā)酵罐的發(fā)酵優(yōu)化培養(yǎng)基的裝液量為 2.5 L，接種量 10% (V/V)，37 ℃，通氣比1.0 vvm，發(fā)酵過程中pH維持6.5，發(fā)酵周期為52 h，攪拌轉速0–36 h為350 r/min，36–52 h 為 500 r/min。

30 L發(fā)酵罐發(fā)酵條件：30 L發(fā)酵罐的發(fā)酵培養(yǎng)基的裝液量為18 L，接種量10% (V/V)，37 ℃，通氣比1.0 vvm，發(fā)酵過程中pH維持6.5，發(fā)酵周期為 52 h，攪拌轉速 0–36 h為450 r/min，36–52 h為600 r/min。

1.3 復合誘變

1.3.1 菌懸液的制備

從甘油管保藏的B. amyloliquefaciensFMME088取200 μL接種于裝有50 mL無菌種子培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，37 ℃、200 r/min培養(yǎng)12 h至對數(shù)中后期，將菌液4 ℃、6 000 r/min離心5 min，棄去培養(yǎng)基，菌體用PBS溶液洗滌3次，再用生理鹽水重懸，將菌懸液OD600調(diào)至3.0。

1.3.2 ARTP誘變及首輪搖瓶篩選

吸取10 μL上述菌懸液滴在滅菌后的金屬載片中央，并置于ARTP育種機中誘變，誘變條件詳見表1。將誘變處理后的載片放入裝有990 μL種子培養(yǎng)基的1.5 mL離心管中，用渦旋振蕩儀振蕩菌體至少100 s，徹底洗脫菌液，而后轉入裝有50 mL種子培養(yǎng)基的 500 mL搖瓶中，37 ℃、200 r/min培養(yǎng)12 h，適當稀釋后取100 μL涂布于固體培養(yǎng)基，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)12–36 h。

從含有不同濃度3-羥基丁酮的平板上分別挑取新長出的單菌落于裝有 50 mL種子培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，37 ℃、200 r/min培養(yǎng)12 h，以10% (V/V) 的接種量接入裝有70 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的750 mL具擋板三角瓶中，37 ℃、200 r/min發(fā)酵48 h，將3-羥基丁酮生產(chǎn)能力較出發(fā)菌株優(yōu)良的突變株再次進行搖瓶發(fā)酵驗證，篩得 1株3-羥基丁酮生產(chǎn)能力最優(yōu)的突變株。

表1 ARTP處理條件Table 1 Treatment conditions of ARTP

1.3.3 60Co γ射線輻照處理及二輪搖瓶篩選

將由ARTP篩得的突變株制備菌懸液分置于4支試管中，每管10 mL，直接進行γ射線處理，輻照劑量分別為0、0.6、0.8和0.9 kGy，適當稀釋輻照處理后的菌懸液，取100 μL涂布于固體篩選培養(yǎng)基，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)12–36 h后同1.3.2進行搖瓶發(fā)酵驗證，所得發(fā)酵液進行3-羥基丁酮產(chǎn)量的分析檢測，產(chǎn)量最高的菌株即為篩得的最佳突變株。

1.3.4 突變株遺傳穩(wěn)定性分析

將經(jīng)復合誘變篩得的最優(yōu)突變株B. amyloliquefaciensH-5進行4–8代的傳代培養(yǎng)，分析3-羥基丁酮產(chǎn)量變化。

1.4 5 L發(fā)酵罐上培養(yǎng)條件的優(yōu)化

在5 L發(fā)酵罐中按照1.2中培養(yǎng)條件對突變株B. amyloliquefaciensH-5進行發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵24 h時流加不同濃度的葡萄糖，繼續(xù)發(fā)酵至52 h，所得發(fā)酵液進行3-羥基丁酮產(chǎn)量的分析檢測，確定最優(yōu)葡萄糖流加濃度。

在上述流加一定濃度葡萄糖的基礎上，向發(fā)酵優(yōu)化培養(yǎng)基中添加不同濃度的乙酸鈉，按照1.2中培養(yǎng)條件發(fā)酵至52 h，所得發(fā)酵液進行3-羥基丁酮產(chǎn)量的分析檢測，確定最優(yōu)乙酸鈉添加量。

1.5 30 L發(fā)酵罐上放大培養(yǎng)

在30 L發(fā)酵罐中對突變株B. amyloliquefaciensH-5進行放大培養(yǎng)，按照1.2中優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件發(fā)酵至52 h，HPLC檢測發(fā)酵液中3-羥基丁酮含量。

1.6 分析方法

1.6.1 高效液相色譜 (HPLC) 檢測法

取發(fā)酵液10 000 r/min離心10 min，收集上清液，并以 3-羥基丁酮、2,3-丁二醇、無水葡萄糖作為標準品，配制不同濃度的標準溶液。將上清液與標準溶液經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾后，用高效液相色譜測定 3-羥基丁酮、2,3-丁二醇及葡萄糖的含量。

HPLC檢測條件：色譜柱：Aminex HPX-87H；流動相：5 mmol/L稀硫酸；柱溫：60 ℃；檢測器：示差折光檢測器；進樣量：10 μL；流速：0.6 mL/min。

1.6.2 紫外分光光度計檢測法

取發(fā)酵液適當稀釋，使用紫外分光光度計在波長為600 nm的條件下測定OD600。

1.6.3 正突變率計算

突變株的正突變率[15]的計算以發(fā)酵生產(chǎn)3-羥基丁酮的產(chǎn)量為準。3-羥基丁酮產(chǎn)量較出發(fā)菌株提高的突變株定義為正突變株，正突變率(%)=3-羥基丁酮產(chǎn)量提高的誘變菌株數(shù)/總誘變菌株數(shù)。

2 結果與分析

2.1 ARTP誘變篩選3-羥基丁酮高產(chǎn)菌株

首先對ARTP誘變的處理時間進行優(yōu)化，如圖1所示，正突變株主要集中出現(xiàn)在經(jīng)ARTP處理120 s和150 s的突變株中，可知該處理時間為本研究中ARTP誘變的最適條件。在此基礎上，以B. amyloliquefaciensFMME088為出發(fā)菌株進行ARTP誘變，根據(jù)3-羥基丁酮產(chǎn)量，對篩選平板上長出的140株ARTP突變株進行首輪篩選，獲得39株突變株，其中27株的3-羥基丁酮產(chǎn)量高于出發(fā)菌株，正突變率達19.3%。

將初篩得到的正突變株進行首輪復篩，全部突變株的3-羥基丁酮產(chǎn)量均高于出發(fā)菌株，其中產(chǎn)量較出發(fā)菌株提高 10%以上的突變株見表 2。突變株A-21和A-35較出發(fā)菌株的3-羥基丁酮產(chǎn)量分別提高了 24.74%和 26.84%，產(chǎn)率較出發(fā)菌株均提高了18.92%，生產(chǎn)強度分別提高了24.79%和 26.44%。突變株 A-21的副產(chǎn)物 2,3-丁二醇為9.42 g/L略高于A-35，發(fā)酵后期轉化為3-羥基丁酮的潛能更大，且由于 A-21的 3-羥基丁酮產(chǎn)量較A-35穩(wěn)定。因此，選擇A-21作為后續(xù)60Co γ射線輻照的出發(fā)菌株。

圖1 ARTP誘變首輪初篩結果Fig. 1 Preliminary screening results of the first round for mutants with ARTP mutagenesis.

目前報道中，為獲得高的正突變率，建立了利用多孔板培養(yǎng)的高通量篩選方法[16]，實現(xiàn)快速高效篩選。本研究中出發(fā)菌株B. amyloliquefaciensFMME088及誘變獲得的突變株發(fā)酵生產(chǎn) 3-羥基丁酮均為高好氧發(fā)酵，孔板培養(yǎng)不利于菌體的生長及生產(chǎn)，因此，我們通過優(yōu)化誘變條件，以期提高正突變率，并確定了最適APTR處理時間為120 s和150 s，在此基礎上進行后續(xù)誘變。

2.2 60Co γ射線誘變強化3-羥基丁酮產(chǎn)量

首先，對60Co γ射線誘變的輻照劑量進行優(yōu)化，得到最適輻照劑量為0.8 kGy。在此基礎上，以A-21為出發(fā)菌株進行60Co γ射線誘變，根據(jù)3-羥基丁酮產(chǎn)量，對篩選平板上長出的250株60Co γ射線突變株進行二輪篩選，獲得136株突變株，其中 62株的 3-羥基丁酮產(chǎn)量高于出發(fā)菌株(圖2A)，正突變率為 24.8%。將全部正突變株進行二輪復篩，其中23株正突變株的3-羥基丁酮產(chǎn)量較高 (圖 2B)。其中，突變株 H-5的 3-羥基丁酮產(chǎn)量提高最顯著，搖瓶水平達到 68.2 g/L，比B. amyloliquefaciensFMME088提高30.4%。

由上述兩種誘變方法計算獲得的正突變率可以表明，誘變條件的優(yōu)化能夠實現(xiàn)對正突變率的提高。搖瓶水平的發(fā)酵法雖然能夠用于高產(chǎn)3-羥基丁酮B. amyloliquefaciens的篩選，但工作量大，效率較低，若進一步改善篩選效率及正突變率仍需建立高效的篩選方法。

2.3 突變株B. amyloliquefaciens H-5遺傳穩(wěn)定性分析

將復篩獲得的突變株B. amyloliquefaciensH-5進行傳代發(fā)酵驗證，并分析其遺傳穩(wěn)定性(表3)。以搖瓶水平發(fā)酵獲得3-羥基丁酮的產(chǎn)量為檢驗指標，由表 3可知經(jīng)復合誘變篩選獲得的B. amyloliquefaciensH-5的3-羥基丁酮產(chǎn)量不僅優(yōu)于出發(fā)菌株且產(chǎn)量變化幅度小。該結果表明，突變株B. amyloliquefaciensH-5具有良好的遺傳穩(wěn)定性。

表2 正突變株的首輪篩選結果Table 2 Preliminary screening results of positive mutant strains

表3 H-5突變株的遺傳穩(wěn)定性Table 3 Stability of mutant H-5

圖2 復合誘變二輪初篩 (A) 及復篩 (B) 結果(虛線代表出發(fā)菌株的3-羥基丁酮產(chǎn)量，星號代表3-羥基丁酮產(chǎn)量最優(yōu)突變株)Fig. 2 Preliminary (A) and secondary screening (B) results of second round for mutants with compound mutagenesis.The dashed line represents the acetoin production of the original strain, the asterisk represents the optimal mutant for acetoin yield.

2.4 突變株B. amyloliquefaciens H-5發(fā)酵條件優(yōu)化

為進一步提高 3-羥基丁酮的產(chǎn)量和改善發(fā)酵過程中細胞的生長，首先在5 L發(fā)酵罐上探究了發(fā)酵過程中葡萄糖流加濃度對乙偶姻生產(chǎn)的影響。如圖3A所示，發(fā)酵24 h時流加20 g/L和30 g/L葡萄糖，3-羥基丁酮產(chǎn)量分別為 70.71 g/L和 76.6 g/L(表 4)，較未流加葡萄糖時分別提高了 4.72%和13.45%。但是，產(chǎn)率及生產(chǎn)強度并沒有得到提升，可能原因在于當流加葡萄糖時，細胞生長已經(jīng)進入穩(wěn)定期，此時細胞糖耗速率相對減小，導致發(fā)酵周期延長。當葡萄糖流加濃度增大到40 g/L時，3-羥基丁酮產(chǎn)量下降，與未流加葡萄糖時無顯著差異，可能是由于發(fā)酵體系中葡萄糖的濃度過高，對菌體造成滲透壓脅迫[13]。因此，選擇30 g/L為葡萄糖最適流加濃度，后續(xù)優(yōu)化以此為基礎進行。

圖3 葡萄糖的流加濃度 (A) 及乙酸鈉添加量 (B) 對3-羥基丁酮產(chǎn)量的影響 (虛線代表流加葡萄糖的時間節(jié)點)Fig. 3 Effects of different glucose additive amount (A) and sodium acetate concentrations (B) on the titer of acetoin.The dashed line represents the time node where glucose is added.

表4 葡萄糖流加濃度及乙酸鈉添加量對突變株發(fā)酵的影響Table 4 Comparisons of acetoin production from different glucose additive amount and sodium acetate concentrations

較低濃度的乙酸在低 pH條件下能夠誘導調(diào)控子 AlsR的表達[17]，從而正向調(diào)控 3-羥基丁酮合成路徑中兩個關鍵酶——α-乙酰乳酸合酶(ALS) 和乙酰乳酸脫氫酶 (ALDC) 的表達，以促進 3-羥基丁酮的合成[18]。因此，在發(fā)酵過程中流加30 g/L葡萄糖的基礎上，考察了添加乙酸鈉對突變株B. amyloliquefaciensH-5發(fā)酵生產(chǎn)3-羥基丁酮的影響。如圖3B所示，乙酸鈉的添加對3-羥基丁酮發(fā)酵影響較小，當添加0.25 g/L和0.5 g/L乙酸鈉時，3-羥基丁酮產(chǎn)量提高至78.44 g/L和80.39 g/L，較未添加乙酸鈉時僅僅提高了2.40%和4.95%。另外，當添加0.5 g/L乙酸鈉時，副產(chǎn)物2,3-丁二醇的生成量相對減少，而當添加量增加到1.0 g/L時，3-羥基丁酮產(chǎn)量與未添加乙酸鈉時產(chǎn)量無明顯差異。因此，選擇0.5 g/L為乙酸鈉最適添加量。

經(jīng)上述培養(yǎng)條件優(yōu)化，突變株B. amyloliquefaciensH-5在5 L發(fā)酵罐上發(fā)酵52 h時3-羥基丁酮產(chǎn)量為80.39 g/L，較優(yōu)化之前產(chǎn)量提高了19.06%。

2.5 突變株B. amyloliquefaciens H-5 30 L發(fā)酵罐擴大培養(yǎng)

采用上述優(yōu)化后的培養(yǎng)條件對突變株B.amyloliquefaciensH-5進行30 L發(fā)酵罐的擴大培養(yǎng)。如圖4所示，B. amyloliquefaciensH-5在30 L發(fā)酵罐發(fā)酵0–12 h時，菌體生長迅速，溶氧急劇下降至1.6%；發(fā)酵12–24 h時，細胞生長進入穩(wěn)定期，2,3-丁二醇大量產(chǎn)生，并在流加30 g/L葡萄糖后繼續(xù)緩慢積累；發(fā)酵36 h時，葡萄糖基本耗盡，此時提高攪拌速度，使 2,3-丁二醇轉化為3-羥基丁酮；發(fā)酵52 h時，3-羥基丁酮的最大產(chǎn)量為85.24 g/L。由表5可知，在30 L發(fā)酵罐上，3-羥基丁酮的產(chǎn)率及生產(chǎn)強度較5 L發(fā)酵罐上分別提高了7.89%和5.81%。另外，在30 L發(fā)酵罐上單位細胞的 3-羥基丁酮產(chǎn)量比 5 L發(fā)酵罐上提高了 6.03%，可能是由于發(fā)酵后期主要通過2,3-丁二醇脫氫酶催化 2,3-丁二醇轉化為 3-羥基丁酮。因此，當菌體量較低時，間接使得發(fā)酵過程中 2,3-丁二醇積累量增加，但是后期轉化并不徹底，從而降低了3-羥基丁酮的產(chǎn)量。

圖4 突變株B. amyloliquefaciens H-5發(fā)酵生產(chǎn)3-羥基丁酮過程曲線Fig. 4 Time course of acetoin fermentation by the mutant B. amyloliquefaciens H-5.

表5 突變株B. amyloliquefaciens H-5發(fā)酵生產(chǎn)3-羥基丁酮過程參數(shù)Table 5 Parameters of acetoin fermentation by the mutant B. amyloliquefaciens H-5

3 結論

本研究以B. amyloliquefaciensFMME088為出發(fā)菌株，通過ARTP和60Co γ射線復合誘變，篩選獲得一株高產(chǎn) 3-羥基丁酮的解淀粉芽孢桿菌，并命名為B. amyloliquefaciensH-5。最終，在30 L發(fā)酵罐上進行放大培養(yǎng)，3-羥基丁酮產(chǎn)量達到85.24 g/L，是目前以微生物發(fā)酵法生產(chǎn)3-羥基丁酮的最高產(chǎn)量。

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