徐麗秀，亞爾艾力·阿卜拉，亞迪卡爾·艾合買(mǎi)提,阿仙姑·哈斯木

(新疆醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室，烏魯木齊　830011)

Sirt3蛋白對(duì)體外培養(yǎng)子宮頸癌細(xì)胞脂質(zhì)代謝作用研究

徐麗秀，亞爾艾力·阿卜拉，亞迪卡爾·艾合買(mǎi)提,阿仙姑·哈斯木

(新疆醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室，烏魯木齊830011)

摘要:目的探討沉默信息調(diào)節(jié)因子2 相關(guān)酶3(Sirt3)蛋白對(duì)宮頸癌細(xì)胞脂質(zhì)代謝的作用。方法應(yīng)用qRT-PCR和Western blotting技術(shù)檢測(cè)Sirt3基因在宮頸癌SiHa和 C33a細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄與蛋白本底表達(dá)情況，采用基因過(guò)表達(dá)和RNA干擾技術(shù)分別上調(diào)和下調(diào)子宮頸癌 SiHa和 C33a細(xì)胞中Sirt3 的表達(dá)；Western blotting技術(shù)檢測(cè)Sirt3蛋白水平變化。油紅O染色技術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)染Sirt3低表達(dá)和高表達(dá)慢病毒前后宮頸癌細(xì)胞脂質(zhì)水平的變化情況。結(jié)果與C33a細(xì)胞相比，SiHa細(xì)胞中Sirt3 的mRNA與蛋白的表達(dá)水平均下降(P<0.05)，故選用SiHa細(xì)胞轉(zhuǎn)染Sirt3過(guò)表達(dá)慢病毒，C33a細(xì)胞轉(zhuǎn)染Sirt3低表達(dá)慢病毒。SiHa細(xì)胞轉(zhuǎn)染過(guò)表達(dá)慢病毒后，Sirt3蛋白表達(dá)水平明顯增高(P<0.05)，與正常對(duì)照組和陰性對(duì)照組比，轉(zhuǎn)染Sirt3高表達(dá)慢病毒的細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)含量有所增加。C33a細(xì)胞轉(zhuǎn)染Sirt3低表達(dá)慢病毒后，Sirt3蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)，與正常對(duì)照組和陰性對(duì)照組比，轉(zhuǎn)染Sirt3低表達(dá)慢病毒的細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)含量降低。結(jié)論Sirt3蛋白的表達(dá)參與宮頸癌細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)代謝，具體調(diào)控機(jī)制尚待研究。

關(guān)鍵詞：宮頸癌；脂質(zhì)代謝；Sirt3

中圖分類(lèi)號(hào)：R737.33

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1009-5551(2018)05-0528-06

doi:10.3969/j.issn.1009-5551.2018.05.002

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金(81360332)；新疆醫(yī)科大學(xué)研究生創(chuàng)新項(xiàng)目(CXCY2017009)

作者簡(jiǎn)介：徐麗秀(1992-),女，在讀碩士，研究方向：腫瘤分子生物學(xué)。

通信作者：阿仙姑·哈斯木，女，博士，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向:婦科腫瘤,E-mail:axiangu75@126.com。

本文引用：徐麗秀，亞爾艾力·阿卜拉，亞迪卡爾·艾合買(mǎi)提,等.Sirt3蛋白對(duì)體外培養(yǎng)子宮頸癌細(xì)胞脂質(zhì)代謝作用研究[J].新疆醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2018,41(5):528-533.doi:10.3969/j.issn.1009-5551.2018.05.002

TheeffectofSirt3onlipidmetabolismofcervicalcancercellsinvitro

XUlixiu,YaerailiAbula,YadikaerAiermaiti,AxianguHasimu

(DepartmentofPathology,SchoolofPre-clinicalMedicine,XingjiangMedicalUniversity,Urumqi830011,China)

Abstract :ObjectiveTo explore the effect of Sirt3 protein expressions on Lipid Metabolism of Cervical Cancer Cells.MethodsmRNA and the protein of Sirt3 were detected in normal cervical cancer SiHa and C33a cell by qRT-PCR and Western blotting.The Sirt3 expression was down-regulated in C33a cell by RNA interferencing technology,while the Sirt3 gene was up-regulated in SiHa cell through gene overexpression technology.After transfected lentiviral vector,the Sirt3 protein expression was detected by Western blotting.Oil red O staining was used to evaluate the changing of lipid levels in cervical cancer cells infected lentiviral vector and the control transfected cells and normal cervical cancer cells.ResultsThe mRNA and protein level of Sirt3 in SiHa cell were significantly lower than that in C33a cell(P<0.05),so SiHa cell was transfected with SIRT3 overexpression lentiviru,and C33a cell was transfected with SIRT3 siRNA lentiviru.The expression of Sirt3 protein and the content of intracellular lipid were significantly increased in SiHa cells after transfected with overexpression lentiviru compared to the control and normal cell(P<0.01).While the level of Sirt3 protein was significantly decreased(P<0.01)and reduced the content of intracellular lipid in C33a cell transfected with siRNA lentivirus than the control and normal cell.ConclusionThe expression of Sirt3 protein participates in lipid metabolism in cervical cancer cells,but the specific regulation mechanism remains to be investigated.

Keywords:cervical cancer;lipid metabolism;Sirt3

脂肪酸合成對(duì)惡性腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞膜形成、能量?jī)?chǔ)備以及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子的產(chǎn)生等多個(gè)生物學(xué)過(guò)程起關(guān)鍵作用。研究證實(shí)，脂肪酸代謝通路中代謝物的變化對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移也有促進(jìn)作用[1]。本課題組前期進(jìn)行了宮頸癌血液及組織中的代謝組分分析及代謝網(wǎng)絡(luò)調(diào)控研究，鑒別出17種宮頸癌差異小分子代謝物和18條關(guān)鍵代謝通路，主要涉及到宮頸癌患者體內(nèi)的脂肪酸代謝、糖酵解和谷氨酰胺氧化代謝紊亂[2-5]。

沉默信息調(diào)節(jié)因子2相關(guān)酶3(Sirt3)是調(diào)控物質(zhì)代謝的重要因子，其主要通過(guò)調(diào)節(jié)線粒體代謝限速酶的乙?；絹?lái)改變線粒體功能，控制脂肪酸、氨基酸和酮體進(jìn)入三羧酸循環(huán)，對(duì)調(diào)控線粒體的代謝反應(yīng)起到關(guān)鍵作用，從而維持細(xì)胞能量代謝穩(wěn)定，是一種能量感受器[6-7]。由于很多學(xué)者普遍認(rèn)為腫瘤是一種代謝疾病，而線粒體又處于能量代謝的中心地位，Sirt3 作為細(xì)胞線粒體內(nèi)重要的去乙?；?，則必然與腫瘤代謝有一定的聯(lián)系。目前報(bào)道證實(shí)Sirt3在食道鱗狀細(xì)胞癌、口腔黏膜鱗狀細(xì)胞癌和乳腺癌細(xì)胞中高表達(dá)，其異常高表達(dá)與腫瘤細(xì)胞增殖速度加快，凋亡受限相關(guān)[8-10]；也有研究顯示 Sirt3 是抑癌基因，目前 Sirt3 在腫瘤中的作用尚存在爭(zhēng)議[11]。本研究旨在探索隨著宮頸癌細(xì)胞中Sirt3的表達(dá)水平改變對(duì)細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)含量的影響，進(jìn)一步揭示宮頸癌的發(fā)生與脂質(zhì)代謝異常之間的聯(lián)系，為宮頸癌發(fā)生提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1細(xì)胞系人子宮頸癌C33a和SiHa細(xì)胞株均購(gòu)自上海細(xì)胞庫(kù)。

1.1.2主要儀器 手動(dòng)單道移液器(Axyge)，酶標(biāo)儀(Bio-Rad)，PCR擴(kuò)增儀(Thermo)，蛋白轉(zhuǎn)膜儀(Bio-Rad)，Real Time PCR instrument(ABI)，化學(xué)發(fā)光成像儀(上海勤祥公司 Chemiscope 3000)。

1.1.3主要試劑胎牛血清、DEME(高糖)、青霉素-鏈霉素雙抗、0.25%胰酶均購(gòu)自以色列Biological industries公司，Sirt3兔抗人單克隆抗體(美國(guó)Abcam公司)，GADPH鼠抗人多克隆抗體(武漢奧博森公司),Maxima SYBR Green qPCR Master Mix(美國(guó)Thermo公司)，BCA蛋白定量試劑盒(美國(guó)Thermo公司)，Western blotting試劑盒(美國(guó)Thermo公司)，Sirt3低表達(dá)慢病毒、SIRT3高表達(dá)慢病毒均購(gòu)自上海吉?jiǎng)P基因公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞中mRNA的提取及qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)取≥1×106的細(xì)胞,加入1mL Trizol，在室溫下靜置5～10min，隨后加入200μL氯仿，室溫靜置2min,4℃，12 000 r/min，離心15min后取上清,加入等體積異丙醇，渦旋充分混勻，靜置10min，4℃，12 000 r/min，離心10min后棄上清，向沉淀中加入1mL75%乙醇充分混勻，離心棄上清后保留沉淀，室溫充分干燥后，用DEPC水溶解 RNA沉淀，隨后檢測(cè)RNA純度和濃度。Sirt3 cDNA引物：正義鏈：5′-CGTCTCAAAACAAAACAAAAC-3′，反義鏈：5′-AAAATCCAAAGCCAAACTG-3′。GADPH cDNA引物:正義鏈：5′-GGACCTGACCTGCCGTCTAG-3′,反義鏈:5′-GTAGCCCAGGATGCCCTTGA-3′。將GADPH作為內(nèi)參照,利用Maxima SYBR Green qPCR Master Mix試劑盒檢測(cè)Sirt3基因的表達(dá)情況。反應(yīng)的總體積為25μL，反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性10min，95℃變性15s，60℃延長(zhǎng)60 s,擴(kuò)增共進(jìn)行40 個(gè)循環(huán)。采用相對(duì)定量公式 2-△△ct計(jì)算SIRT3基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量。本次試驗(yàn)數(shù)據(jù)重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)所得。

1.2.2Western blotting法檢測(cè)取≥1×106的細(xì)胞，加入 100μL RIPA裂解液，1μL PMSF，充分混勻。冰上裂解30min，4℃，12 000 r/min,離心15min，收集上清，BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定細(xì)胞內(nèi)總蛋白濃度。蛋白在Tris base凝膠上進(jìn)行90min電泳分離后，在100 V穩(wěn)壓電壓下電轉(zhuǎn)至PVDF膜上，隨后封閉液室溫封閉30min，一抗孵育，4℃過(guò)夜(SIRT3的抗體稀釋比為1∶500，GADPH抗體稀釋比為1∶1000)，二抗孵育30min后,采用AP法顯色,使用化學(xué)發(fā)光儀進(jìn)行拍照、蛋白灰度值掃描，與內(nèi)參β-actin進(jìn)行比較，計(jì)算出Sirt3蛋白的相對(duì)表達(dá)量。數(shù)據(jù)重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)所得。

1.2.3Sirt3低表達(dá)慢病毒轉(zhuǎn)染C33a細(xì)胞C33a 細(xì)胞生長(zhǎng)至貼壁80%～90%時(shí)準(zhǔn)備慢病毒轉(zhuǎn)染，胰酶消化，接種于6孔板，孵育24h。實(shí)驗(yàn)選取siRNA的靶序列為 5′-GCTGTACCCTGGAAACTAC-3′。按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，將Sirt3 低表達(dá)慢病毒、空載慢病毒、Enhance Infection、polybrene共同加入到不含抗生素的完全培養(yǎng)基的細(xì)胞中，12 h后將液體吸出，換成正常完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，72 h后在熒光倒置顯微鏡下觀察熒光表達(dá)，以正常生長(zhǎng)的C33a細(xì)胞作為正常對(duì)照組，以空載慢病毒轉(zhuǎn)染的C33a細(xì)胞為陰性對(duì)照組，以轉(zhuǎn)染Sirt3低表達(dá)慢病毒的C33a細(xì)胞作為Sirt3低表達(dá)組，然后進(jìn)行轉(zhuǎn)染Sirt3 低表達(dá)病毒后的其他實(shí)驗(yàn)步驟。

1.2.4SIRT3高表達(dá)慢病毒轉(zhuǎn)染SiHa細(xì)胞SiHa細(xì)胞生長(zhǎng)至80%～90%貼壁時(shí)進(jìn)行慢病毒轉(zhuǎn)染，實(shí)驗(yàn)選用高表達(dá)的靶序列為5′-GATGGGCTTGAGAGAGTGTC-3′。取1×105個(gè)/孔的細(xì)胞在6孔板中培育24h后，按照說(shuō)明書(shū)指導(dǎo)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，將Sirt3高表達(dá)慢病毒、空載慢病毒、Enhance Infection、polybrene加到無(wú)抗生素培養(yǎng)基的細(xì)胞中，12 h后棄掉廢液，換成含有抗生素的完全培養(yǎng)基并在CO2孵育箱中37℃培育72 h，在顯微鏡下觀察熒光表達(dá)豐度。以正常生長(zhǎng)的SiHa細(xì)胞作為正常對(duì)照組，以空載慢病毒轉(zhuǎn)染的SiHa細(xì)胞為陰性對(duì)照組，以轉(zhuǎn)染Sirt3高表達(dá)慢病毒的SiHa細(xì)胞作為Sirt3高表達(dá)組，然后進(jìn)行Sirt3高表達(dá)慢病毒轉(zhuǎn)染后的后續(xù)檢測(cè)步驟。

1.2.5油紅O染色檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)脂肪合成情況取1×105個(gè)細(xì)胞，4%多聚甲醛固定細(xì)胞30min,隨后每孔加入1mL油紅O染色30min，迅速用PBS清洗2遍，60%異丙醇沖洗5s，10×顯微鏡下觀察，拍照。本次實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2　結(jié)果

2.1宮頸癌SiHa和C33a細(xì)胞中Sirt3的mRNA及蛋白表達(dá)在宮頸癌SiHa、C33a 2種細(xì)胞中Sirt3 mRNA的相對(duì)表達(dá)量分別為(1.183±0.203 7)、(2.12±0.208 8)(圖1)。蛋白表達(dá)水平分別為(0.097 32±0.035 93)、(1.030±0.202 3)(圖2)。其中，SiHa細(xì)胞中Sirt3 mRNA、蛋白的表達(dá)均低于C33a細(xì)胞中的表達(dá)(P<0.05)，故選用宮頸癌SiHa細(xì)胞轉(zhuǎn)染Sirt3過(guò)表達(dá)慢病毒，宮頸癌C33a細(xì)胞轉(zhuǎn)染Sirt3 低表達(dá)慢病毒。

注：SiHa細(xì)胞比較，*P<0.05。

注：SiHa細(xì)胞比較，*P<0.05。

2.2宮頸癌SiHa和C33a細(xì)胞慢病毒轉(zhuǎn)染Sirt3過(guò)表達(dá)慢病毒和轉(zhuǎn)染Sirt3低表達(dá)慢病毒后蛋白水平的檢測(cè)Western blotting結(jié)果顯示，在SiHa細(xì)胞中，Sirt3 低表達(dá)蛋白的表達(dá)量為(0.773 4±0.182 2)，明顯低于陰性對(duì)照組(1.067 5±0.143 15)和正常對(duì)照組(1.223 7±0.250 05)(P<0.05)，見(jiàn)圖3。Sirt3高表達(dá)蛋白的表達(dá)量為(1.070 6±0.137 77)，高于陰性對(duì)照組(0.311 5±0.103 53)和正常對(duì)照組(0.474±0.199 12)(P<0.05)，見(jiàn)圖4。

2.3Sirt3蛋白表達(dá)促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞脂質(zhì)合成轉(zhuǎn)染Sirt3 低表達(dá)組與陰性對(duì)照組和正常對(duì)照組相比，細(xì)胞內(nèi)脂肪合成水平明顯減少；轉(zhuǎn)染Sirt3高表達(dá)組與陰性對(duì)照組和正常對(duì)照組相比，細(xì)胞內(nèi)脂肪合成水平明顯增加(圖5)。

注：與正常對(duì)照組比較，*P<0.05；與陰性對(duì)照組比較，△P<0.05。

注：與正常對(duì)照組比較，*P<0.05；與陰性對(duì)照組比較，△P<0.05。

3　討論

快速增殖是惡性腫瘤細(xì)胞的重要特征，為了滿足其增殖需要需要消耗大量的原料和能量來(lái)調(diào)整自身能量短缺狀態(tài)，因此腫瘤細(xì)胞的能量代謝方式可能會(huì)發(fā)生一系列的變化[12]。脂質(zhì)代謝的異常為惡性腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移、免疫逃避和抵制細(xì)胞凋亡提供了微環(huán)境[13]。主要表現(xiàn)為脂肪酸的從頭合成明顯增加，同時(shí)當(dāng)腫瘤細(xì)胞缺乏葡萄糖時(shí)，通過(guò)增強(qiáng)脂肪酸β-氧化來(lái)滿足細(xì)胞對(duì)能量的需求。研究證實(shí)，脂質(zhì)代謝紊亂可以提高食管癌、乳腺癌等腫瘤患癌的風(fēng)險(xiǎn)。其中，前列腺癌細(xì)胞通過(guò)增強(qiáng)脂肪酸氧化維持自身的生物合成[14]；研究者在高脂食物喂養(yǎng)的p48-Kras小鼠模型中，增強(qiáng)脂肪酸氧化關(guān)鍵調(diào)控因子乙酰輔酶A羧化酶(acetyl-CoA carboxylation,ACC)和肉堿酯酰轉(zhuǎn)移酶1(Carnitine palmitoyltransferase,CPT-1)的表達(dá)，從而加強(qiáng)了脂肪酸β-氧化能力，最終促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)[15]。Sirt3在多種實(shí)體腫瘤如肝癌和乳腺癌中表達(dá)上調(diào)，并通過(guò)增加脂肪酸的合成促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)。

目前已知有3條細(xì)胞凋亡信號(hào)通路：線粒體通路、死亡受體通路和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路，其中線粒體通路是凋亡的最主要途徑[16]。線粒體是體內(nèi)多種生物合成代謝的主要場(chǎng)所，而Sirt3是線粒體上的一種脫乙酰化酶，參與多種線粒體代謝，包括：脂肪酸氧化、氧化磷酸化、三羧酸(TCA)循環(huán)。但SIRT3在不同腫瘤組織表達(dá)及作用存在爭(zhēng)議，在一些腫瘤組織中表達(dá)上調(diào)，如口腔鱗癌、膀胱癌和乳腺癌[8]等，抑制其表達(dá)后，促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖作用。但是也有研究報(bào)道，如肝癌和胃癌[17-18]等中表達(dá)下調(diào)，抑制其增殖和凋亡。

本研究中，通過(guò)對(duì)人宮頸癌SiHa和C33a 2株細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染Sirt3高表達(dá)和SIRT3 高表達(dá)慢病毒，來(lái)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)含量的改變情況。結(jié)果表明，隨著SIRT3水平的增加，細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)水平也相應(yīng)增加，提示Sirt3可能通過(guò)促進(jìn)脂肪酸合成影響宮頸癌的發(fā)生發(fā)展。在宮頸癌脂質(zhì)代謝的相關(guān)研究中，發(fā)現(xiàn)芹菜素刺激細(xì)胞后，與陰性對(duì)照組細(xì)胞比較，宮頸癌SiHa、C33a、HeLa和Caski細(xì)胞中的脂質(zhì)氧化水平增加，進(jìn)而促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[19]；與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)的lncRNA(LNMICC)通過(guò)加強(qiáng)脂肪酸代謝，促進(jìn)宮頸癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移[20]。但還未有研究探討Sirt3對(duì)宮頸癌的侵襲、轉(zhuǎn)移的影響，在其他一些研究中發(fā)現(xiàn)，Sirt3通過(guò)不同的作用機(jī)制調(diào)控腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移，在乳腺癌細(xì)胞系中通過(guò)Sirt/FOXO/SOD2軸調(diào)控細(xì)胞的侵襲和遷移[21]。在前列腺癌細(xì)胞系中通過(guò)PI3K/Akt信號(hào)通路調(diào)控細(xì)胞的侵襲和遷移[22]。AP-1可以結(jié)合Sirt3增強(qiáng)子區(qū)域，通過(guò)誘導(dǎo)AP-1表達(dá)從而激活Sirt3的轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)癌細(xì)胞的侵襲和遷移[23]。

腫瘤細(xì)胞不同程度地利用代謝性信號(hào)傳導(dǎo)分子及轉(zhuǎn)錄因子微調(diào)脂肪合成和脂肪分解以滿足快速增殖的腫瘤細(xì)胞對(duì)脂質(zhì)的需求。因此，研究腫瘤細(xì)胞脂肪酸代謝重編程在腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移中的作用，對(duì)揭示腫瘤發(fā)生、復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制具有重要作用。本課題組后期將進(jìn)一步分析Sirt3對(duì)脂肪酸合成通路關(guān)健酶ACC和脂肪酸β-氧化的關(guān)鍵酶CPT-1調(diào)控分子機(jī)制進(jìn)行深入研究，力求為揭示Sirt3對(duì)宮頸癌脂質(zhì)代謝重編程的作用機(jī)制，及其對(duì)宮頸癌發(fā)生、復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移中的作用。

[收稿日期：2018-02-27]

(本文編輯楊晨晨)