郭佳佳，郭艷麗，蘭　怡，李琳琳，王　燁，毛新民

(新疆醫(yī)科大學(xué)1藥學(xué)院，烏魯木齊　830011；2附屬中醫(yī)醫(yī)院，烏魯木齊　830000；3中醫(yī)學(xué)院，烏魯木齊　830011)

黃諾馬苷人工抗原合成及鑒定

郭佳佳1，郭艷麗1，蘭怡2，李琳琳1，王燁1，毛新民3

(新疆醫(yī)科大學(xué)1藥學(xué)院，烏魯木齊830011；2附屬中醫(yī)醫(yī)院，烏魯木齊830000；3中醫(yī)學(xué)院，烏魯木齊830011)

摘要：目的制備中藥兩色金雞菊的活性成分黃諾馬苷(Flavanomarein，F(xiàn)M)的人工抗原，為制備FM的單克隆抗體奠定基礎(chǔ)。方法利用曼尼希法將FM與多聚賴氨酸(Poly-lysine，PLL)偶聯(lián)，并采用薄層色譜法進行鑒定，皮下免疫BALB/c小鼠，采用間接ELISA和間接競爭ELISA法對小鼠血清的抗體進行效價與特異性檢測。結(jié)果薄層色譜結(jié)果顯示FM與PLL偶聯(lián)成功；間接競爭ELISA結(jié)果顯示，采用FM-PLL免疫的3號小鼠產(chǎn)生了抗FM的抗體(Y=-0.037 2X+0.862 1，R2=0.969。結(jié)論成功合成了黃諾馬苷人工抗原，為進一步研究FM的免疫學(xué)檢測方法提供了實驗基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：黃諾馬苷；人工抗原；BALB/c小鼠；ELISA

中圖分類號：R284.1

文獻標(biāo)識碼：A

文章編號：1009-5551(2018)05-0615-05

doi:10.3969/j.issn.1009-5551.2018.05.021

基金項目：NSFC-新疆聯(lián)合基金重點項目(U1303223)；省部共建中亞高發(fā)病成因與防治國家重點實驗室

作者簡介：郭佳佳(1990-)，女，碩士，研究方向：糖尿病藥理學(xué)。

通信作者：毛新民，男，博士，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：糖尿病藥理學(xué)，E-mail：mxm3277@sina.com。

本文引用：郭佳佳，郭艷麗，蘭怡,等.黃諾馬苷人工抗原合成及鑒定[J].新疆醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2018,41(5):615-618,624.doi:10.3969/j.issn.1009-5551.2018.05.021

SynthesisofFlavanomareinArtificialAntigenandDetermination

GUOJiajia1,GUOYanli1,LANYi2,LILinlin1,WANGYe1,MAOXinmin3

(1SchoolofPharmacy,Urumqi830011,China,2TheAffiliatedTraditionalChineseMedicineHospital,Urumqi830000,China,3CollegeofTraditionalChineseMedicine,XinjiangMedicalUniversity,Urumqi830011,China)

Abstract:ObjectiveTo synthesize the antigen of flavanomarein(FM),an active component of Coreopsis tinctoria,for the preparation of monoclonal antibodies against FM,and to provide a technical basis for the rapid detection of FM by enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA).MethodsFM was conjugated to poly-lysine(PLL)using Mannich method and identified by TLC.BALB/c mice were immunized subcutaneously,and the antibodies potency and specificity of mouse serum were determined with indirect ELISA and indirect competitive ELISA assay.ResultsThe results of TLC showed that FM artificial antigen was successfully synthesized.The results of indirect competitive ELISA showed that No.3 mice immunized with FM-PLL produced anti-FM antibodies(Y=-0.037 2X+ 0.862 1,R2=0.969).ConclusionFlavanomarein artificial antigen were synthesized successfully,which provided the experimental basis for further study of FM immunological detection.

Keywords:flavanomarein;artificial antigen;BALB/c mice;ELISA

兩色金雞菊(Coreopsis tinctoria)又名雪菊，屬于菊科(Compositae)金雞菊屬(Coreopsis)的干燥頭狀花序，通常為單瓣、重瓣或半重瓣，舌狀花，黃色或者金黃色，其花期在6～9月。

金雞菊屬于北溫帶的植物，其原產(chǎn)地為北美地區(qū)，在國內(nèi)新疆的和田有較為豐富的雪菊。兩色金雞菊記載于《新疆植物志》，同雪蓮一樣珍貴，都是較為珍貴的藥材之一[1]。在著名的《新華本草綱要》中曾這樣記載兩色金雞菊，兩色金雞菊全草名曰蛇目菊，具有清熱解毒、活血化痰的功效，現(xiàn)代藥學(xué)研究也同樣表明其具有降血糖[2-3]、降血壓、降血脂[4-5]、抗氧化[6-7]、抗癌[8-9]、抗炎[10]、抗病毒[11]等功效，在臨床上也用于治療高血壓和冠心病[2,12-15]。在民間，人們常用雪菊的頭狀花序泡茶飲用，因為雪菊在心血管疾病方面具有顯著的防治作用[16]。

目前，從兩色金雞菊中分離得到共計18種黃酮類化合物，其母核包括黃酮類、黃酮醇類、查耳酮類、二氫黃酮類、異黃酮類及橙酮類[1]。本課題組前期研究表明：兩色金雞菊醇提物單次灌胃給藥后，檢測出黃諾馬苷(異奧卡寧-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷)以原型成分入血，在小鼠心、肝、脾、肺、腎、腦各組織中均檢測出黃諾馬苷。因此，本研究旨在合成黃諾馬苷的人工完全抗原，為制備單克隆抗體提供基礎(chǔ)[17]。

1　材料與方法

1.1試劑與儀器儀器：微量可調(diào)移液器(Eppendorf，德國)；分析天平(DTG 160，上海精密科學(xué)儀器有限公司)；磁力攪拌器(海門其林貝兒)；卡馬半自動點樣儀(CAMAG-LINOMAT-5，瑞士)；卡馬薄層色譜數(shù)碼成像系統(tǒng)(CAMAG REPROSTAR-3，瑞士)；硅膠G板(青島海洋化工廠)。試劑：黃諾馬苷標(biāo)準(zhǔn)品(EXTRASYNTHESE，法國)；DMSO(Sigma公司，美國)；多聚賴氨酸(Sigma公司)；無水二甲基甲酰胺(DMF，北京索萊寶公司)；乙烷磺酸(MES，Sigma公司)；弗氏完全佐劑(FCA，Sigma公司)；弗氏不完全佐劑(FIA，Sigma公司)；HRP-羊抗鼠(Genesgript，美國)；TMB顯色液(北京索萊寶公司)；Na2CO3分析純(天津永晟精細化工有限公司)；NaHCO3分析純(天津永晟精細化工有限公司)；甲醇(天津永晟精細化工有限公司)；乙酸乙酯(天津永晟精細化工有限公司)；無水乙醇(天津永晟精細化工有限公司)；冰乙酸(天津市豪宇精細化工有限公司)。

1.2方法

1.2.1曼尼希法[18]制備黃諾馬苷人工抗原3mg PLL溶于750μL MES中，作為A液；3mg FM溶于250μL 無水DMF(二甲基甲酰胺)中，加入250μL甲醛(37 %)，作為B液；將A液緩慢加入到B液中，37℃條件下避光攪拌反應(yīng)24h；磷酸鹽緩沖液(PBS)透析72 h，中間多次換PBS，收集液體，-20℃保存待用。

1.2.2人工抗原薄層色譜法鑒定首先活化高效液相硅膠G板，將薄層板G板置于105℃活化30min。用蒸餾水配制1mg/mL的黃諾馬苷與PLL標(biāo)準(zhǔn)溶液，并配置適宜濃度的合成產(chǎn)物溶液，實驗前處理樣品。并過0.22 μm濾膜，備用。配置展開劑，使其充分混勻(展開劑為乙酸乙酯∶丙酮∶冰醋酸∶水=8∶4∶0.3∶1)，向展開缸倒入展開劑10mL左右浸沒缸底一側(cè)。然后使用自動點樣儀依次點樣，將點好樣的薄層板放入展開缸未倒展開劑一側(cè)，蓋上蓋子飽和15～30min。然后將飽和過的薄層板放入有展開劑的一側(cè)開始展開，至上緣1～2cm處停止展開。取出薄層板，晾干。用1%的AlCl3溶液顯色，105℃加熱1min，放入紫外燈(365 nm)下顯色拍照。

1.2.3動物免疫飼養(yǎng)8周齡雌性BALB/c小鼠4只，由新疆醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，動物許可證號：SYXK(新)2016-0002，實驗動物質(zhì)量合格證號：No.00001150。FM-PLL免疫3只，另外一只不進行免疫作為陰性對照。免疫方法如下：初次免疫，免疫劑量為100μg/只，根據(jù)BCA試劑盒檢測蛋白濃度，將FM-PLL用生理鹽水稀釋為1mg/mL，并與等體積的弗氏完全佐劑(Freund's complete adjuvant，F(xiàn)CA)混合，用移液槍反復(fù)吹打，直到形成油包水(W/O)狀態(tài)，即取一滴乳化物滴到水中長時間不分散。采用背部皮下多點注射的方式免疫小鼠(200μL/只)；2周后進行第一次免疫，取同免疫原等體積的弗氏不完全佐劑(Freund′s incomplete adjuvant，F(xiàn)IA)將免疫原充分乳化，進行背部皮下多點注射(200μL/只)；此后每隔2周進行加強免疫1次，方法同第二次。第二次加強免疫后1周，尾尖采血取少量血，37 ℃放置30min后，然后以3000 rpm/min離心10min，分離血淸，置于-20℃冰箱保存待測。

1.2.4間接ELISA法測定血清中抗體的效價首先采用棋盤滴定法優(yōu)化酶聯(lián)免疫吸附測定(Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)方法中包被原、二抗和封閉液等濃度的條件，然后進行相關(guān)的檢測。具體方法如下：以FM-PLL為包被抗原，免疫后的小鼠血清作為一抗，在450 nm處，同一稀釋倍數(shù)下抗血清與陰性血清OD比值(P/N)>2.1定義為陽性，以血清的最大稀釋倍數(shù)定義為該血清的效價。間接ELISA方法如下：(1)包被：將FM-PLL用CBS稀釋至1∶1000作為包被原，以100μL/孔加入96孔酶標(biāo)板中，37℃孵育2h。PBST洗板3次，每次2min。(2)封閉：采用10mg/mL明膠作為封閉液，200μL/孔，37 ℃孵育1h。以PBST洗板3次，每次2min，拍干。(3)加一抗：將抗血清和陰性血清用PBS稀釋500、1000、2 000、4000、8 000、16 000倍，100μL/孔，37℃孵育1h。以PBST洗板3次，每次2min，拍干。(4)加二抗：將HRP-羊抗鼠二抗用PBS稀釋15 000倍，100μL/孔，37℃孵育30min。以PBST洗板3次，每次2min，拍干。(5)顯色：采用TMB顯色液顯色，100μL/孔，37℃孵育15min。(6)終止：每孔加入2mmol/L硫酸50μL終止反應(yīng)，在15min內(nèi)450 nm處測定OD值。

1.2.5間接競爭ELISA法測定抗血清中抗體的特異性此方法與間接ELISA法基本相似，只是在加入一抗50μL的同時加入同體積50μL的黃諾馬苷小分子，加入黃諾馬苷小分子的濃度越高，抗血清的抗體與包被原結(jié)合的抗體就越少，在450 nm處測得的OD值就越低，以此可以辨別抗血清中的抗體是否可以特異性的結(jié)合黃諾馬苷，小分子濃度為：0.001、0.01、0.1、1、10μg/mL。

2　結(jié)果

2.1FM-PLL的薄層鑒定在相同的展開條件，365 nm紫外燈照射下，F(xiàn)M在相應(yīng)的位置呈顯著的熒光斑點；由于PLL是大分子蛋白物質(zhì)，在相同的展開條件，展開后仍在原點位置，同時在365 nm紫外燈照射下也不會呈現(xiàn)相應(yīng)的熒光斑點；在相同的展開條件，365 nm紫外燈照射下，合成產(chǎn)物FM-PLL并沒有在與FM相同的位置，而是在原點位置顯示了相應(yīng)的熒光斑點，結(jié)果見圖1。由此可以判斷，該人工抗原的偶聯(lián)是成功的，并且合成物無小分子斑點，表明完全純化去除小分子。

2.2間接ELISA法檢測抗血清效價隨著血清稀釋倍數(shù)的增加，1、2、3號小鼠抗血清的OD450值呈逐漸下降的趨勢，陰性小鼠抗血清的OD450值不隨血清稀釋倍數(shù)的增加而變化，結(jié)果如表1、圖2所示。在450 nm處，同一稀釋倍數(shù)下抗血清與陰性血清OD比值(P/N)>2.1定義為陽性，結(jié)果顯示三只小鼠均為陽性，顯示均產(chǎn)生了抗體，其中2號效價最高，大于16 000，1號和3號效價偏低,在4000,見表2。

表1　FM-PLL抗血清效價OD450值

血清稀釋倍數(shù)1235005.8411.094.21 1 0005.1311.014.17 2 0003.339.162.97 4 0002.226.412.27 8 0001.445.371.82 16 0001.253.621.30

2.3間接競爭ELISA法測定抗血清中抗體的特異性利用包被原與加入的小分子競爭性與血清中抗體結(jié)合；小分子濃度越高，血清中抗體與包被原上抗原結(jié)合越少，OD450值越低。從表3數(shù)據(jù)可以看出，隨小分子濃度的增加，1號和2號小鼠的OD450值并無明顯變化，而3號小鼠隨小分子濃度的增加，OD450值逐漸降低，表明其可以特異性結(jié)合小分子。如圖3和表4所示，3號小鼠間接競爭ELISA結(jié)果顯示：Y=-0.037 2X+0.862 1，R2=0.969，OD450值隨黃諾馬苷溶液濃度的增加而降低，表示該抗體可以特異性的結(jié)合黃諾馬苷小分子，說明產(chǎn)生了抗目標(biāo)小分子黃諾馬苷的抗體。

3　討論

兩色金雞菊中活性成分黃諾馬苷的分子量為450.4，屬于小分子半抗原，只具有免疫反應(yīng)性，而不具有免疫原性，因此不能直接激發(fā)免疫系統(tǒng)識別并產(chǎn)生相應(yīng)的抗體。通常情況下，大分子蛋白具有明顯的抗原性，可誘導(dǎo)免疫應(yīng)答并激發(fā)脾細胞分泌出相應(yīng)的抗體。因此，黃諾馬苷必須與大分子蛋白偶聯(lián)制備成人工抗原，進而誘導(dǎo)免疫應(yīng)答并激發(fā)脾細胞分泌出相應(yīng)的抗體。中藥的成分非常復(fù)雜，但是利用免疫親和色譜柱可以將中藥中的某種活性小分子去除，并且不會破壞中藥的其他成分，然后取去除前后的中藥進行藥理實驗，不僅可以方便的表現(xiàn)出該中藥活性小分子在體內(nèi)的分布和代謝過程，同時也能揭示出該活性小分子在中藥中的作用。

表3　FM-PLL間接競爭ELISA OD450值

表4　FM-PLL間接競爭ELISA

目前，有很多人工抗原合成的方法，如高碘酸鈉氧化法、曼尼希法、碳二亞胺法、活潑酯法、戊二醛法、琥珀酸酐法等[19]。由于半抗原被利用的連接基團或部位不同而產(chǎn)生了不同的偶聯(lián)方法，進而決定了半抗原表位構(gòu)型的表達差異，不同的偶聯(lián)方法不僅可以影響到半抗原的免疫原性，更決定著其免疫抗體的特異性[20]。

目前，國內(nèi)外尚未見黃諾馬苷人工抗原的制備，本課題組前期采用高碘酸鈉氧化法將黃諾馬苷和牛血清白蛋白(BSA)進行偶聯(lián)，其原理是將糖基上的鄰二羥基結(jié)構(gòu)氧化為醛基，醛基再與蛋白上的氨基結(jié)合得到穩(wěn)定的以碳-氮單鍵連接的結(jié)合物，從而實現(xiàn)了黃諾馬苷與載體蛋白的偶聯(lián)。薄層結(jié)果顯示偶聯(lián)成功，但免疫小鼠后，間接競爭ELISA結(jié)果顯示小鼠血清對小分子無特異性，分析其原因可能由于高碘酸鈉在氧化糖基上鄰二羥基結(jié)構(gòu)的同時破壞了黃諾馬苷分子中其他鄰二羥基結(jié)構(gòu)，也有可能BSA的結(jié)構(gòu)不易暴露氨基等等。因此，本實驗參考文獻[18],采用了曼尼希法合成黃諾馬苷人工抗原，將黃諾馬苷與更易暴露氨基的載體蛋白多聚賴氨酸偶聯(lián)。經(jīng)薄層色譜法檢測，偶聯(lián)物不隨展開劑展開，而停留在點樣原點，顯現(xiàn)出蛋白特征，但經(jīng)顯色劑處理后，在點樣處可見明顯色斑，與黃諾馬苷對照品的顏色一致，說明停留在原點的偶聯(lián)物同時又具有小分子的特征，由此可見，黃諾馬苷與載體蛋白偶聯(lián)成功。將合成的人工抗原免疫小鼠后，從間接ELISA的結(jié)果可以看出，1、2、3號小鼠均具有良好的效價，結(jié)合間接競爭ELISA的結(jié)果可以看出，3號小鼠的血清與黃諾馬苷有著競爭抑制現(xiàn)象，說明3號小鼠產(chǎn)生了抗目標(biāo)小分子黃諾馬苷的抗體。

中藥中有很多活性成分，因此分析檢測時有一定的難度，對于這類化合物建立快速、靈敏、特異性強的檢測方法以及對中藥和復(fù)方中微量有效成分的檢測，探索中藥小分子活性成分的作用機制等方面具有非常重要的意義?；诳贵w特異性的免疫分析方法如ELISA具有以下優(yōu)點：耗時少、可以大批量的處理樣品、靈敏度和準(zhǔn)確度均較高，并且有多種技術(shù)形式，此外，將免疫分析方法應(yīng)用于中醫(yī)藥的研究具有廣闊的前景[21]。因此，通過合成黃諾馬苷人工抗原，進而產(chǎn)生抗黃諾馬苷的特異性抗體，建立相應(yīng)的免疫分析方法，為從新的角度進一步考察兩色金雞菊中的活性成分黃諾馬苷的作用打下了一定的技術(shù)基礎(chǔ)?；谛》肿訂慰寺】贵w的中藥活性成分免疫學(xué)分析方法，具有以下優(yōu)點：靈敏度高，特異性強，前處理非常簡單，高通量，且不依賴貴重的儀器，操作也較為簡便[22-23]。本實驗旨在制備黃諾馬苷的人工抗原，免疫小鼠產(chǎn)生抗黃諾馬苷的抗體為后期制備細胞融合得到抗體以及敲除雪菊中黃諾馬苷奠定基礎(chǔ)。

[收稿日期：2017-12-19]

(本文編輯王艷)